三重复合诱变和原生质体融合技术筛选林可霉素高产稳定菌株可行性研究报告

1、南昌市科技计划项目可行性研究报计划类别： 科技攻关项目名称：项目类别：生物技术及新医药工业化研究与开发专题 课题名称：三重复合诱变和原生质体融合技术筛选林可霉素高产菌株申请单位：江西师范大学（盖章）项目（课题）负责人：王筱兰 起止年限：2007.12009.1通讯地址、邮编：江西师范大学生命科学学院33002 2 联系电话、传真：3926 002 报告编制单位：江西师范大学二oo六年九月编写说明一、本可行性研究报告格式适用于南昌市科技计划（软科学研究计划、国际科技合作与交流计划除外）项目 开展可行性研究时使用，其主要依据是相应的南昌市科技 计划项目申请书。二、本可行性研究报告是南昌市科技局组织

2、技术经济可行性论证的主要材料和科技计划项目立项的重要依据,各项内容应实事求是,逐项编写。三、本可行性研究报告附件材料中，涉及引进技术的项目，须附有技术引进协议和有关知识产权的文件。四、本可行性研究报告一式六份，一律用a4纸打印,于左侧装订成册。南吕科技计划项0可行性研究报告、总论1. 项目的主要内容及技术原理简述主要内容：本研究基于以林可霉素产生菌林可链霉菌(stre ptomyces l inloinensi s)为出 发菌株，采用加热、紫外线(uv)、des三重复合诱变处理，用终点产物林可霉 素为选择压力进行梯度筛选，经摇瓶初筛、复筛获得较高效价菌株，最后用正 交设计来优化发酵培养基。本研

3、究采用三种不同的诱变方法分步处理林可霉素 产生菌，促使林可霉素产生菌的dna多基因位点发生突变，然后采用耐自身终 产物和前体物压力梯度筛选方法把高产林可霉素产生菌筛选出来。利用菌种的 自然突变，多因素低剂量的诱变效应来筛选稳定生产林可霉素的突变株作为亲 木与三重复合诱变筛选的高产菌株进行原牛质体融合，促使两亲木优良性状的 基因重组从而获得高产稳定的融合菌株。把三重复合诱变技术和原生质体融合 技术结合筛选林可霉素高产稳定菌株。本项目完成时筛选到高产稳定融合菌株，50立升发酵罐林可霉素发酵 单位达到7000u/ml ,优化高产稳定菌株的罐上发酵工艺用于生产林可霉素。 技术原理：1. 自然分离的机理

4、：多因素低剂量的诱变效应，互变异构效应(据统计， 碱基对发生自然突变的几率约为10-810-9)造成的结果：一部份菌种退 化，也有少部分高产菌，对生产有益，简单易行，纯化菌种，防止菌种 退化，稳定生产，提高产量。2. 三重复合诱变的机理染色体畸变：染色体或dna片段发生缺失、易位、逆位、重复等。基因突变：dna中的碱基发生变化，即点突变。诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。诱变因素有物 理的、化学的和生物的三大类。三重复合诱变的特点：第一，诱变效率较高，即产生点突变的频率相 对较高，而染色体畸变相对较少，并且诱变范围广。因而可被用来对微生 物的某一特殊性状进行改良，并且容易出现

5、高产的突变体。第二，出现的 突变体类型较多。尽管主要引起的是gcat碱基对z间的转换，同时也 由于两种不同的诱变方式结合，使得突变位点增加，突变方式多样。在突 变过程中可出现其它各种类型的突变体，因而具有多效性。第三，与其它 诱变方法相比，三重诱变后产生的显性突变体相对较多，因而易于筛选突 变体。3. 原生质体融合技术原理把两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用加以瓦解，使菌体细胞在高渗环境 中释放出只有原牛质膜包裹着的球状体（称原牛质体）。两亲本的原生质体在高渗条件下使之混合，由聚乙二醇（peg）作为助 融剂，使它们互相凝集，发生细胞融合，从而实现遗传重组。在再生成细 胞的菌落屮就有可能获得具有理

6、想性状的重组子。获得高产优质菌株经过原生质体化与再生过程，可能得到产量提高的 细菌和链霉菌的变异菌株；种内融合还可能使抗牛素合成中的限速酶得到修饰而使抗生素合成的代谢途径畅通。4重组菌株发酵培养基及工艺优化的原理菌株的基因发生改变，随z其代谢途径也会发生改变。因此，有必要通过正交实验，来探索主要的c源（葡萄糖、淀粉）和n源（硫酸钱、黄豆饼粉）对林可霉素产牛菌代谢的影响，从而找出诱变后的高产菌的最优培养基配方。3. 项目的目的和意义林可霉素（lincomyci n lc）又称洁霉素，是一种高效广谱抗生素，于1962 由美国人mason等首先从链霉菌林可变种培养液中获得，从此获得广泛应 用。林可霉

7、素对革兰氏阳性菌有较强的抑菌作用，特别是对链球菌、金黄色葡萄球菌及厌 氧菌的抗菌作用尤为明显，在许多感染症的治疗中疗效显著。由于其对组织和细胞的穿透 力强，应用方便，不需做皮试，临床上用于肺炎球菌、溶血性链球菌、草绿色链球菌及金 黄色葡萄球菌的感染。特别用于严重厌气菌引起的感染及金黄色葡萄球菌骨髓炎。而且林 可霉素用药途径较多，副反应较少，控制感染快，是较有前途的一种抗生素。利用菌种改良技术提高抗牛素的产量、质量是增加抗生素牛产效益的最有效途径，基 因工程菌的构建是当今育种技术发展的热点，但由于很多抗生素合成相关基因及其功能尚 未学握，且已构建的工程菌经常发生性状丢失，所以基因技术应用受到极大

8、限制。传统育 种方法，盲目性大、实效差，在20世纪70年代发展起来的杂交育种方法受到遗传标记的 限制，应用较少。虽然皖北药业股份有限公司利用先进的基因工程技术对林对芻素菌种进 行改良、筛选出高产优质的林可霉素产生菌，摇瓶效价达到4500n/ml以上。应用于生产后, 使发酵单位提高到6000p/ml以上，同比增长40%o但是国内洁霉素还是处于生产水平偏低 的状况。目前，利用离子注入技术对抗生素产生菌诱变处理国内已有一些报道氮离子注 入技术用于林可霉素产生菌的诱变，取得了一定的效果。本实验通过三重诱变(热诱变一uv-de s)处理林可霉素生产菌及抗终点 代谢物突变株的筛选，以期能提高其产林可霉素的

9、能力，且利用正交设计 来优化经过三重诱变后的高产菌的发酵培养基和发酵工艺来进一步提高林 可霉素产量。4. 相关技术领域国内外发展现状、趋势林可霉素(lincomycin)，属于林可胺类抗生素，是由l-酪氨酸和戊糖磷酸 循环(戊糖-5-磷酸和景天糖-7-磷酸)的屮间产物缩合而成的。整个生物合成途 径包括两个分支:一个由i厂酪氨酸合成丙脯氨酸(ppl)，另一个由景天糖-7-磷酸 构成a-甲硫林可胺(a -mtl )。林可链霉菌(s. 1 incolnensis)合成一共需18种 酶的参与：8个酶参与ppl合成，另8个酶参与a -mtl合成，还有2个酶控制缩合两个 组分形成终产物。此外,还发现了一个

10、小分子组分，以辅助合成因子形式(7, 8-二 脱甲基-8-拜基-5-氮化核黄素)参与ppl生物合成途径屮的催化反应。林可霉素是于1962年从链丝菌(streptomycesli neol nens i s)变异株的好氧 发酵液中获得的抗牛素，抗革兰阳性菌临床上用于肺炎球菌、溶血性链球菌、 草绿色链球菌及金黄色葡萄球菌的感染。特别用于严重厌气菌引起的感染及金 黄色葡萄球菌骨髓炎，在许多感染症的治疗中疗效显著。由于其对组织和细胞 的穿透力强，应用方便，不需做皮试。林可霉素用药途径较多，副反应较少， 控制感染快，是较有前途的一种抗生素。利用菌种改良技术提高抗生素的产量、质量是增加抗生素生产效益的最有

11、 效途径，基因工程菌的构建是当今育种技术发展的热点，但由于很多抗生素合 成相关基因及其功能尚未掌握，且已构建的工程菌经常发生性状丢失，所以基 因技术应用受到极大限制。传统育种方法，盲目性大、实效差，在20世纪70年 代发展起来的杂交育种方法受到遗传标记的限制，应用较少。虽然皖北药业股 份有限公司利用先进的基因工程技术对林可霉素菌种进行改良、筛选出高产优 质的林可霉素产生菌，摇瓶效价达到4500|i/ml以上。但是国内林可霉素还是处 于生产水平偏低的状况。目前，利用离子注入技术对抗生素产生菌诱变处理国 内已有一些报道，氮离子注入技术用于林可霉素产牛菌的诱变，取得了一定的效 果。长期以来，医药市场

12、中抗感染药物的销售额始终位居第一，现在年销售额已达 3 0 0多亿元。林可霉素在我国的应用已有多年历史，正处市场销售成熟期。 目前全国林可霉素生产厂家有4 0多家，每年原料药产量达1 9 0 0吨左右， 其中出口约7 0 0余吨，国内应用1 2 0 0吨左右。紫外、氮离子注入技术、快中子处理技术、热诱变等物理诱变方法运用于林肯 链霉菌的诱变育种中，取得了一定的成果。国内一些厂家发酵生产林可霉素虽有几十年的历史，但生产水平一直徘徊不前。 原因主要有以下三方面：（1）缺乏高产菌株，或者菌种退化；（2）工艺有待优化；（3）生产管理不善（责任心不强、操作工素质不高、工艺变形）。5. 项目申请单位、主要

13、合作申请单位及项目主要负责人 的基本情况1. 项目申请单位基本情况江西师范大学生命科学学院现有生物科学和生物工程本科专业。学院现有 教职工32人，其中教授6名，副教授8名，具有博士学位的老师16名，全省 高校中青年骨干教师2名。，学院拥有生物工程综合实验室、省重点实验室，专 业图书资料室藏书1600余册，中外文期刊近百种，还建有科研实验棊地。目前，学院正以鄱阳湖重点实验室建设为契机，围绕省学科建设，加 强对外交流与合作，努力实现高位嫁接，与中国科学院庐山植物园建立槓物生 态联合实验室。重点实验室拥有木项目的先进生物工程设备，包括全自动发酵 罐和用于产物分析检测的h plc高压液相仪。2. 主要

14、合作申请单位基本情况江西国药有限责任公司始创于一九五五年，系由原江西国药厂于一九九四年依法改制组建的国有独资有限责任公司，现隶属于江西省医药集团公司。公司有近50年中药牛产和30余年西药生产历史。现有资产 总额41228万元，净资产1037 8万元。主要牛产设备3300余台套，生产 发酵容量2100立方米，动力系统水、电、汽、空气、冷冻、真空等与生 产相配套，其规模在江西省医药行业位居前列。公司目前固体制、原料 药已经通过gmp检查。公司一贯注重科技进步，自行研制或通过合作方 式开发新品种药物.3项目主要负责人的基本情况项目主要负责人：王筱兰，女，教授，任职于江西师范大学生命科学研究 院。19

15、92年获华东理工大学生物化工专业“工学硕士”学位。2005年晋升为教 授。2000年获华东理工大学生物化工专业“工学博士”学位。曾主要从事发酵 工程和基因工程工程及生化分离技术的科研和教学工作。在国内外学术刊物发 表研究论文11篇；曾获上海市第四届化学化工研究生论文报告会优秀论文奖。200 1年九月进入中科院上海牛命科学研究院植物牛理牛态研究所微牛物次牛代 谢调控研究室做博士后研究，进行d氨基酸氧化基因的表达及酶工程的研究。 并于2004年3月出站到江西师范大学生命科学学院任教。6. 有关本项目的现有工作基础和支撑条件程的本课题组有多年从事微生物学和酶工老师及长期从事抗生素生产的国 药有限公司

16、的中级技师和高级工程师，还有微牛物学研究方向的研究牛，在人 才方面能保证木项目顺利进行。实验室现有大型仪器设备比较齐全、真空冷冻 干燥器、高速冷冻离心机、带有尾气分析的3 0l高级生物反应器等。还需添置 一些仪器：微生物培养摇床、生化培养箱、蛋白电泳仪、旋光仪、台式高速离 心机、5升全自动发酵罐，购买实验用微牛物学试剂和微生物培养基及其他牛 化试剂。二、项目实施方案1. 项目达到的目标及考核的主要技术经济指标（含知识 产权、技术标准）技术指标：林可霉素发酵单位由现在的5000u/ml达到7000u/ml,提高林 可霉素产量40% o经济指标：林可霉素原料药年产量由20吨提高到28吨，经济效益提

17、高 40% o（二）项目的主要研究（开发）内容研究内容：1岀发菌株的自然分离，在生产过程中，不经过人工处理，利用菌 种的白然突变，多因素低剂量的诱变效应来筛选稳定生产林可霉素的突变株； 2以林可霉素生产菌为出发菌株，采用加热、紫外线（uv）、des三重复合诱变处 理，用林可霉素和前体为选择压力，压力梯度法筛选耐自身终产物的高产菌种 及用甲硫氨酸为前体物筛选耐前体物的高产菌种；3. 用双亲本菌株原生质体融合技术筛选高产稳定的林可霉素菌株；4. 高产稳定融合菌株发酵培养基及发酵工艺优化及屮试放大。（三）试验（开发）规模及地点本申请项0是中试工艺开发项0,本项目主要依托于江西师范大学生命 科学学院省

18、重点鄱阳湖实验室完成，研究内容主要包扌舌三重复合诱变出发菌株， 用林可霉素和前体为选择压力，压力梯度法筛选耐自身终产物的高产菌种及用 甲硫氨酸为前体物筛选耐前体物的高产菌种；采用双亲本菌株原生质体融合技 术筛选高产稳定的林可霉素菌株；在30立升高级生物反应器中进行高产稳定融 合菌株发酵培养基及发酵工艺优化及屮试放大。本项目产业化在江西国药有限 责任公司进行。（四）主要技术关键及创新点三重诱变的优点：第一，诱变效率较高，即产生点突变的频率相对较高，而 染色体畸变相对较少，并且诱变范阖广。因而可被用來对微生物的某一特殊 性状进行改良，并且容易出现高产的突变体。第二，出现的突变体类型较多。尽管主要引

19、起的是gcat碱基对z间的转换，同时也由于两种不同的诱 变方式结合，使得突变位点增加，突变方式多样。在突变过程中可出现其它 各种类型的突变体，因而具有多效性。第三，与其它诱变方法相比，三重诱 变后产生的显性突变体相对较多，因而易于筛选突变体。2. 实施方案（含技术路线、工艺流程及技术关键的解决方案）技术路线：溶菌酶出发菌株的自然分离三重复合诱变（热诱变、uv、des）抗终点代谢物突变株的初筛耐 前体物突变株初筛高产林可霉素突变菌株的复筛亲本（高产柿霉素突变株）亲本（自然选育 特定的菌株）制备亲本原生质体制备亲本原生质体溶菌酶peg 2000融合细胞壁再生筛选高产稳 定融合细胞高产菌株发酵培养基

20、及发酵工艺优化中试放大实验方案：1. 自然分离（1）将林可霉素产生菌菌种斜面用10 mio.85%的生理盐水刮洗下来，然后用玻璃珠 在摇床200r /min摇床上振荡2 omin过滤后制成单抱子悬浮液。（2）从砲子悬浮液中吸収lm i,加入9ml无菌水中将其稀释成101,然后再稀释成10*2,10'3,10'4,10'5,10*6o（3）将lcfi, 10巳 w3, io'4, 10*5, 10'6,分别取0 .lml涂布于分离培养基上，30°c 培养7天。（4）根据菌落形态，挑选出60株不同形态的菌株接到60个大试管斜面中30°c,

21、培 养7天。（5）一一对应地将60株培养基试管斜面分别挖块接种于母瓶中，置于 30°c, 220r/min 的摇床培养 48h.（6 ） 一一对应地将60只母瓶各取3.2ml发酵液转接于40ml的小发酵瓶中，置于 30 °c, 220r/min的摇床培养7天。（7 ）测定效价2. 三重诱变（1）从试管斜面取下泡子制备成泡子悬浮液，用棉花漏斗过滤后，用10ml吸管吸取 10ml悬浮液装入2 50ml三角瓶中，（2）从中取出lml悬浮液放入9ml无菌水中，稀释成10七 再稀释成10巴io 3, w 役io'5, 10匕分别涂布于分离培养基上，从而算出菌浓。（3）将三角瓶

22、放入50°c水浴锅中保温5 min,然后取出放入冷水中，直至冷却。（4）从冷却后的三角瓶屮取出5ml放入直径为7cm的平皿内置于15w, 30cm距离的 紫外灯下照射30s,然后在暗处放置10 min.（5）从小平皿内各吸取1ml,分别加入3只100ml摇瓶内，在3只摇内分别加入 0ml,0.2 ml,0.4ml 0 .lmol/l 的 de s,在 30°c, 200 r/min 的摇床上振荡三小时。（6）向三只摇瓶屮各加入9ml , ph&o磷酸盐缓冲液10ml屮止反应。3. 筛选（1）初筛（2）复筛4. 原牛质体融合技术改造菌株：把两个亲木的细胞壁分别通过酶解

23、作用加以瓦 解，使菌体细胞在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹着的球状体（称原生质 体）。两亲本的原生质体在高渗条件下使z混合，由聚乙二醇（peg）作为助融 剂，使它们互相凝集，发生细胞融合，从而实现遗传重组。5 重组菌株的培养基及发酵工艺的优化的优化（六）技术风险分析本项冃把经典的诱变方法与定向的原生质体融合技术相结合，使两亲本的 优良性状的基因实验遗传重组，从而获得高产稳定的融和菌株，通过对重组菌 的培养基配方及罐上发酵工艺的优化，促使其优良性状的基因表达，分泌大量 林可霉素，林可霉素发酵单位由原来的5000 u/ml达到700 ou/ml,木工艺具有 国内领先水平，技术风险小。（七）分年度

24、的工作内容、目标20 07. 1-2007. 3：通过自然选育筛选稳定生产林可霉素菌株预期目标：得到一株稳定牛产林可霉素的菌株，发酵单位达到550 ou/mlo20074-2007. 6：三重复合诱变剂量及最佳致死率的确定预期目标：三重复合诱变方法建立。2007. 7-2007.9：三重复合诱变处理出发菌株，筛选耐自身终产物的高产菌种。 预期目标：得到一株生产林可霉素的高产菌株，发酵单位达到6000u/mlo 2007.10 -2007.12：:筛选耐甲硫氨酸为前体物高产菌种。预期目标：得到一株生产林可霉素的高产菌株，发酵单位达到6000u/m 1 o 2008.1-2 008.3：双亲本菌株

25、原生质体融合技术筛选高产稳定的林可霉素菌株。 预期口标：得到一株生产林可霉素的高产菌株，发酵单位达到7000u/ml20 08.4-2008.6：:高产稳定融合菌株发酵培养基及发酵工艺优化及中试放大。 预期目标：得到适合重组菌株的最优发酵培养基配方和发酵工艺。（八）申请单位、合作申请单位及主要人员的分工木项目主要依托于江西师范大学牛命科学学院完成，研究内容主要包括内容 主要包括三重复合诱变出发菌株，用林可霉素和前体为选择压力，压力梯度法 筛选耐自身终产物的高产菌种及用甲硫氨酸为前体物筛选耐前体物的高产菌种; 采用双亲木菌株原牛质体融合技术筛选高产稳定的林可霉素菌株中试放大试验。 木项目主要人员

26、为江西师范大学牛命科学学院王筱兰和江西国药有限责任公司 的葛友群高级工程师。王筱兰负责工艺的中试放大试验，葛友群高级工程师负 责木项目产业化。（九）组织及管理的运行机制按照江西师范大学组织和管理模式进行运行和管理。（十）相关依托工程（含技术）的落实情况王筱兰木项目主要人员为江西师范大学生命科学学院教授和江西国药有限 责任公司的葛友群高级工程师。王筱兰负责高产稳定融合菌株发酵培养基及发 酵工艺优化及中试放大，葛友群高级工程师负责木项目产业化。（一）有关本项目的国内外知识产权状况分析本项目来源于产学研合作课题。不存在技术知识产权方面问题。三、市场分析1.市场预测（含同类项目的国内外市场情况）长期以来，医药市场中抗感染药物的销售额始终位居第一，现在年 销售额已达3 0 0多亿元。林可霉素在我国的应用已有多年历史，正处 市场销售成熟期。廿前全国林可霉素生产厂家有4 0多家，每年原料药 产量达1 9 0 0吨左右，其中出口约7 0 0余吨，国内应用1 2 0 0吨 左右。（二）本项目的市场竞争优势、风险及市场策略我们的优势是所有技术和设备都实行现国产化，在菌种和发酵工艺方面我们具有自主知识产权。（三）经济社会效益分析我国在林可霉素牛产菌研究，产品开发和工业规模牛产等领域必将有快速发展。菌种和发酵工艺是生产林可霉