【大学课件】核酸的研究方法VIP

1、第第1515章章核酸的研究方法核酸的研究方法http:/ 制备天然核酸必需采用温和的条件，制备天然核酸必需采用温和的条件，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用重要的是防止核酸酶的作用一、核酸的分离、提纯和定量测定一、核酸的分离、提纯和定量测定http:/ nacl1mol/l nacl），但不溶于低盐），但不溶于低盐溶液（溶液（0.14mol/l nacl0.14mol/l nacl去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。dnadna沉淀：沉淀：0.3m naac-70%0.3m naac-70%乙醇乙醇（一）

2、（一）dna分离纯化分离纯化http:/ rna：核糖核糖 糠醛糠醛 绿色物质（绿色物质（670-680nm） dna：脱氧核糖脱氧核糖+二苯胺二苯胺兰色物质（兰色物质（595-620nm）苔黑酚/地衣酚浓hcl浓硫酸1、紫外吸收法紫外吸收法1个个a50g/ml 双链双链dna 40g/ml rna或单链或单链dnahttp:/ 核酸含磷量为核酸含磷量为9.5% 1g磷相当于磷相当于10.5g核酸核酸4、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭溴乙锭能插入能插入dna分子的碱基分子的碱基对对间形成复合物间形成复合物在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与荧光强度

3、与dna含量成正比含量成正比http:/ dna 比值比值1.81.8， 1.8 pr1.8 pr、苯酚污染、苯酚污染纯纯rna rna 比值比值2.02.0， 2.0 dna 2.0 dna、 prpr、苯酚污染、苯酚污染（四）、核酸纯度的测定od260od280http:/ 不同构象的核酸（线形、不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度离降速率不同，用密度梯度离心可以将不同构象心可以将不同构象dnadna、rnarna与蛋白质区分开来与蛋白质区分开来http:/ cscl，45000rpm，16h密度梯度：密度梯度：1.80g/ml1.5

4、5g/ml平衡时：浮力密度平衡时：浮力密度=cscl密度密度=离心力离心力=0 +4.22（r2 - r02） 10-10 ：浮力密度：浮力密度 ：角速度（弧度：角速度（弧度/秒）秒）r：样品到转轴的距离：样品到转轴的距离（一）核酸密度的测定http:/ xg-c + 1.658xg-c =（-1.658） 10 （二）测定（二）测定dnadna的的g-cg-c含量含量http:/ 蛋白质，蛋白质，变性程度越大，浮力密度越大变性程度越大，浮力密度越大（三）研究核酸的构象（三）研究核酸的构象http:/ sangersanger1955 1955 确定牛胰岛素结构，确定牛胰岛素结构，1958 1

5、958 获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖1975 1975 设计出设计出dnadna测序法，测序法，1980 1980 获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖合成一段与待测合成一段与待测dnadna序列互补的序列互补的dnadna片段群。片段群。 http:/ 2，3 3双脱氧核苷三磷酸（双脱氧核苷三磷酸（ddntpddntp）是是dnadna合成链延伸的合成链延伸的抑制剂抑制剂。http:/ : mcb4.0dideoxy sequencing of dnahttp:/ 由由maxammaxam和和gilbertgilbert所发明。所发明。 其基本原理是用特异的其基本原理是用特异的化学试剂化学试剂作用于

6、作用于dnadna分子中的不同碱基，然后用分子中的不同碱基，然后用哌啶哌啶切断反应碱基切断反应碱基的多核苷酸链。用的多核苷酸链。用4 4组不同的特异反应，可使末组不同的特异反应，可使末端标记的端标记的dnadna分子切成不同长度的片断，其末端分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱影得到测序图谱 http:/ 4组特异的反应如下：组特异的反应如下：（1 1）g g反应：反应：用硫酸二甲酯用硫酸二甲酯dmsdms使鸟嘌呤上的使鸟嘌呤上的n n7 7原子甲原子甲基化，加热引起鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在此处断基化，加

7、热引起鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在此处断裂裂（2 2）g+ag+a反应：反应：用甲酸使用甲酸使a a和和g g嘌呤环上的嘌呤环上的n n原子质子化，原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂（3 3）t+ct+c反应：反应：用肼使用肼使t t和和c c的嘧啶环断裂，再用哌啶的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基除去碱基（4 4）c c反应：反应：当有盐存在时，只有当有盐存在时，只有c c与肼反应，并被哌与肼反应，并被哌啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂二酯键断裂http:/ 32p-

8、gctacgta：在a处：32p-gct和32p-gctacgt在g处： 32p ，32p-gctac在c处：32p-g和 32p-gcta在t处：32p-gc和32p-gctacghttp:/ *acttcg*acttcgacag甲酸（g+a）： *a*acttcg *acttcga *acttcgaca*acttcgacag肼/nacl（c）： *ac *acttc*acttcga c*acttcgacag 肼（c+t）： *ac *act *act t *acttc*acttcgac*acttcgacag从下往上读：ctacgta，末端g不能读出。32p *acttcgacaghttp:

9、/ rnarna的测序方法有的测序方法有3 3个：个：（1 1）用酶特异切断）用酶特异切断rnarna链：链：（2 2）用化学试剂裂解）用化学试剂裂解rnarna（3 3）逆转录成）逆转录成cdnacdnahttp:/ 4种种dntpdntp、taq dnataq dna聚合酶和适量聚合酶和适量mgmg2+2+五、五、dnadna聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（pcrpcr）http:/ 3个温度进行热循环：个温度进行热循环：变性变性9494，454560s60s；退火，根据引物的退火，根据引物的tm tm ，1min1min；延伸，延伸，7272，1min1min。循环循环4.4.扩增完成后取出一定量的反应产物，检扩增完成后取出一定量的反应产物，检测扩增结果：先进行凝胶电泳，用溴化乙测扩增结果：先进行凝胶电泳，用溴化乙啶染色，紫外光下检测结果啶染色，紫外光下检测结