ExpEcoli染色体DNA提取

1、基因工程实验基因工程实验Gene Engineering30学时学时 实验课设计的思路实验课设计的思路 蛋白质蛋白质核心核心超螺旋超螺旋DNADNA环环实验一实验一、E.coli染色体染色体DNA提取提取 一、实验目的一、实验目的掌握掌握E.coli基因组基因组DNA的提取方法的提取方法, ,制备高质量的制备高质量的gDNA,用作用作PCR模版模版 通过冻融、溶菌酶或通过冻融、溶菌酶或EDTAEDTA处理，并用去垢剂处理，并用去垢剂使使细胞裂解细胞裂解，释放出，释放出DNADNA，然后用，然后用RNARNA酶和蛋白酶酶和蛋白酶处理，使处理，使RNARNA和蛋白质降解，再用苯酚和蛋白质降解，再用

2、苯酚/ /氯仿氯仿抽提抽提，离心，去除蛋白质，用乙醇离心，去除蛋白质，用乙醇沉淀沉淀DNADNA。二、实验原理二、实验原理 裂解液裂解液/Pro K 灭活胞内核酸酶灭活胞内核酸酶 吸附于硅基质膜吸附于硅基质膜 漂洗漂洗-离心离心-洗脱洗脱试剂盒提取原理试剂盒提取原理（一）材料（一）材料 大肠杆菌培养物大肠杆菌培养物 （二）试剂（二）试剂常规方法所需试剂常规方法所需试剂 LB培养基培养基GTE: 50 mmol/L葡萄糖葡萄糖, 25 mmol/L Tris-HCl (pH8.0), 10 mmol/L EDTA (pH8.0)100 mg/ml溶菌酶溶菌酶20 mg/ml 蛋白酶蛋白酶K(Pr

3、o K)三、实验材料、试剂及用具三、实验材料、试剂及用具酚酚/氯仿氯仿/异戊醇异戊醇(PCI)，体积比为，体积比为25:24:1，采用，采用Tris-HCl(pH8.0)饱和酚。饱和酚。3mol/LNaAc (pH5.2)无水乙醇无水乙醇70%乙醇乙醇TE缓冲液：缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0), 1mmol/L EDTA (pH8.0)20 mg/ml RNaseA酶酶 裂解液裂解液LB2 结合液结合液BB2 清除液清除液CB2 漂洗液漂洗液WB2试剂盒的组成试剂盒的组成 洗脱液洗脱液EB RNase A(20mg/ml) Pro K (20mg/ml) 离心柱离

4、心柱,收集管收集管（三）用具（三）用具恒温摇床恒温摇床,培养箱培养箱, 灭菌锅灭菌锅,超净台超净台,微量移液器微量移液器,枪枪头头,EP管管,恒温恒温水浴锅水浴锅,台式离心机台式离心机,漩涡混合器漩涡混合器,冰冰箱等箱等常规方法1. 收集菌体: 1ml菌液/1EP管, 12000rpm, 1,弃上清2. 加600l GTE,振荡混匀3. 加6l溶菌酶,混匀,37,304. 加6l Pro K,混匀,55,1h5. 加等体积PCI,混匀, 12000rpm, 56. 转移上清至新管,加等体积氯仿/异戊醇, 12000rpm, 5 7. 取上清至新管,加V 3mol/L NaAc (pH5.2),

5、混匀,加2倍体积的无水乙醇,上下颠倒混匀,20,30, 12000rpm, 10 8. 弃上清，取1mL70%乙醇洗涤沉淀, 12000rpm, 59. 干燥后用20l TE(含RNaseA酶)溶解,37,3010.检测DNA质量，20保存四、实验方法四、实验方法试剂盒方法试剂盒方法1. 收集菌体: 2ml菌液/2人, 12000rpm, 1,尽量吸净上清2. 加100l LB2和20l ProK, 振荡至菌体彻底悬浮 3. 55孵育,154. 加20l RNase A,室温孵育25. 加500l BB2,立即涡旋5s,室温106. 全部溶液加入离心柱, 12000rpm,30s,弃流出液7. 加500l CB2, 12000rpm,离心30s,弃流出液8. 重复步骤7一次9. 加500l WB2, 12000rpm,离心30s,弃流出液10. 重复步骤9一次11. 12000rpm离心2,彻底去除残留的WB212. 离心柱置于新EP管,柱中央加200l预热EB,放 置2, 12000rpm, 离心113. 洗脱的DNA于20保存 P33思考题思考题3. 提取染