生物有机化学复习提纲

1、一、 鞠建华：绪论、酶1 .生物有机化学（Bioorganic Chemistry)：有机化学和生物化学的交叉学科，运用有机化学的理论和方法在分子水平上研究生命现象的化学本质。2 .你还了解哪些天然产物或者分子具有哪些生物学功能？3共价键、氢键、配价键、离子键、疏水作用、范德华作用力4化学键，范德华力，氢键比较5 R/S构型生物分子立体效应的影响主要表现在：影响反应的活性和方向性；生物分子间的相互作用等。1. 对反应活性的影响 邻基效应（proximity effects） 2. 对反应立体选择性的影响（ 酶促反应的立体选择性例子）生物体内的基本有机反应 1.水解反应: 包括酯键、酰胺键和糖苷

2、键的水解。 2.缩合反应:生成酰胺键、酯键、糖苷键的反应 , 其它缩合反应（羟醛缩合反应、克莱森酯缩合反应、迪克曼缩合）3. 磷酰化反应 4. 氧化和还原反应5. 烷基化反应（脂肪酸碳链增长反应）6. 加成反应（亲电加成反应、亲核加成反应、环加成反应即迪尔斯-阿尔德反应）7. 消除反应8. 分子重排反应（克莱森重排、频哪醇重排、法沃尔斯基重排）9. 异构化反应n 酶（enzyme）是一类由活细胞产生的，对其特异底物具有高效催化作用的生物催化剂。n 生物催化（biocatalysis）是指利用酶或者生物有机体（细胞、细胞器、组织等）作为催化剂进行化学转化的过程。举出生活中，酶应用的具体例子。1.

3、医用：胰蛋白酶用于促进伤口愈合和溶解血凝块，还可用于去除坏死组织，抑制污染微生物的繁殖。 2.日用：加酶洗衣粉3.食用：凝乳酶奶酪生产的凝结剂，并可用于分解蛋白质。 乳糖酶降解乳糖为葡萄糖和半乳糖，获得没有乳糖的牛乳制品，有利于乳品的消化吸收。4.美容： 酶对生物催化的贡献与一般化学催化剂的异同？酶为什么需要形成活性中心？共性：在反应前后没有质和量的变化；只能催化热力学允许的化学反应；只能加速可逆反应的进程，而不改变反应的平衡点；作用机制都降低反应活化能不同点：酶效率高；底物特异性；酶在体系内处于不断变化中；催化作用由多种因素调节；对反应条件严格为什么酶的催化效率远远地比非催化剂或一般催化剂高

4、？酶原：酶分子没有活性的前体物质。酶原的激活：在一定条件下，酶原像有活性的酶转化的过程。别构调节：指小分子化合物与酶蛋白分子活性中心以外的某一部位特异结合,引起酶蛋白分子构像变化、从而改变酶的活性。抑制剂：引起酶活力降低的别构效应剂。激活剂：引起酶活力增加的别构效应剂。举例说明，研究酶抑制剂的现实意义？医学 : 磺胺药是二氢叶酸合成酶的竞争性抑制剂，进而减少菌体内四氢叶酸的合成，使核酸合成障碍，导致细菌死亡新药研发:农业 : 苯磺隆： 磺酰脲类除草剂，抑制乙酰乳酸合成酶（ALS）的抑制剂，通过抑制ALS，阻碍侧链氨基酸如缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸的生物合成，导致杂草生长受破坏而死。畜牧业: 脲酶

5、抑制剂不但能抑制瘤胃内脲酶活性，降低瘤胃中氨的浓度，而且可使氨的释放速度平稳，有利于微生物合成菌体豆角、决而提高反刍动物对尿素的利用率,并提高饲料转化率X-衍射晶体学手段研究酶的意义?v 测定酶分子的三维结构，明确其三维构件及结构域分布。v 从原子级别，理解酶催化的机制。v 基于酶分子三维结构的药物设计。酶作为药物靶向目标，为药物前期开发提供了数据支持。相比于化学合成，酶催化的合成有什么优势？化学合成：涉及糖分子中羟基的保护与脱保护，步骤多，产率低。 糖苷合成酶：催化糖苷合成，一步反应得到目标产物。u 聚酮类化合物是一大类由细菌、真菌和植物将低级羧酸通过连续的缩合反应产生的天然产物，具有多样的

6、碳骨架结构：u 聚肽类化合物是一类不以mRNA为模板，不需核糖体、tRNA的参与，由非核糖体肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetases，NRPSs）催化合成的天然产物。其氨基酸原料除了20种蛋白质源的氨基酸外，还含有大量的非蛋白源氨基酸。AT（acyl transferase， 酰基转移酶）：负责将低级脂肪酸以CoA酯形式通过酰基携带蛋白ACP的辅基； AT结构域对底物识别的特异性决定碳链延长单位的组成，AT结构域的数量和相应的模块决定聚酮体链的长度 ACP（acyl carrier protein，酰基载体蛋白）：在聚酮链延伸中起到酰基转移的携带作用KS（k

7、etoacyl-ACP synthase，酮脂酰-ACP 合成酶）：在聚酮链的延长中，起到催化新进入的酰基-ACP与已延长的聚酮中间体之间的缩合作用，使聚酮链得到进一步的延长 KR（ketoreductase，酮基转移酶）：参与聚酮链形成过程中酮基的还原，使酮基变为羟基DH（dehydratase，脱水酶）：参与聚酮体碳链羟基的脱水； ER（enoyl reductase，烯醇还原酶），参与聚酮体碳链烯醇式结构中双键的还原反应TE（thioesterase，硫脂酶），通常位于PKS合酶C末端，催化聚酮体碳链末端羟基与酰基-ACP硫酯的羰基进行亲核性的结合，使聚酮体环化，并将其从酶体中释放酶活力

8、（enzyme activity）指酶促反应速率；即规定条件下在单位时间内产物的生成量或底物的减少量。 酶的活性单位： 表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所需要的酶量。 酶的比活力:是指单位质量（mg）的蛋白质所具有某种酶的活性，国际 标准单位是 U/mg或IU/mg米氏常数Km值具有重要的参考意义l Km可以判断酶的专一性和天然底物。 最小的底物通常是酶的最适底物l Km可以用于推断某一代谢反应的方向和途径 微生物是现代工业酶开发的重要源泉，这是为什么？有何实例？微生物中酶的最适温度范围变化极大不可逆抑制（irreversible inhibiti

9、on） 有机磷化合物 ; 有机汞、有机砷化合物 ; 重金属盐; 烷化试剂; 抗生素1. 示例工作的研究背景1.1 什么是酰胺键？有机化学中，羧酸经活化再与胺进行亲核取代反应，形成的化学键即为酰胺键 其中羧基可被活化成酰氯、脂、酰基咪唑、酸酐、酰基叠氮等1.2 酰胺键的生物合成多肽与蛋白质的生物合成催化合成肽键；氨基酸或结构类似物在酰胺键合成酶催化下形成酰胺键 1.3 相关工作的研究意义Ø 解析一类化合物的生物合成机制 Ø 分析一个关键催化酶的理化性质 Ø 发表科学研究内容提供研究参考 Ø 建立后续开发工作基础 2. 制定研究技术路线和方案3. 实验工作的

10、开展3.1 获取目的基因序列并注释功能3.1.1 mcbA基因的生物信息学分析-1海洋b-咔啉生物碱Marinacarbolines AD生物合成基因簇仅仅含三个基因 3.1.2 mcbA基因的生物信息学分析-2 利用NCBI数据库分析编码蛋白的结构域和功能等通过同源比对和保守结构域分析确定McbA的功能，活性位点和功能域3.1.3 mcbA基因的生物信息学分析-3 同时找出一系列的同源蛋白进行比对进一步分析具体的催化功能 3.1.4 mcbA基因的生物信息学分析-4 分析发现McbA是一类ATP依赖性的酰胺键合成酶，在进化上有独特性功能蛋白的进化树分析便于了解酶类型，选取合适的参考对象3.2

11、 mcbA基因的克隆设计引物扩增目的基因片段，经测序鉴定后的目的片段连接原核表达载体如pET28a，导入E.coli BL21(DE3)表达菌株3.3 McbA蛋白的表达纯化如何计算蛋白的分子量？如何进行蛋白的表达纯化？如何保证酶蛋白活性稳定？3.4 McbA酶促反应检测方法活性分析方法3.5 McbA酶促反应最适条件活性分析基础（1）材料的选择 酶的来源： 野生型来源：动物、植物以及微生物等各种原料 异源宿主来源:目前多通过将相关酶基因克隆至异源微生物(大肠杆菌、酵母)宿主中，通过发酵法来生产酶制剂。（2）细胞破碎（3）酶的抽提（4）酶的初步分离浓缩 盐析法 等电点沉淀法 有机溶剂分级分离法

12、 选择热变性法（5）酶的纯化（6）酶的组合分离纯化策略（7）结晶和保存 结晶 经过各种提纯方法获得较纯的酶溶液后，将酶进行结晶。 保存 固态：除盐后经冷冻干燥得到酶粉，低温下可以长期保存。 液态：除盐后，浓缩，还在酶溶液中加入甘油、牛血清蛋白、巯基乙醇、半胱氨酸等保护剂，在低温下保存（-20 或-80 ）。 1.酶基因的随机突变策略（1） 易错PCR技术为代表的无性进化 定义： 从单一酶分子基因出发，采用不具有35校对功能Taq酶进行PCR扩增时，通过调整反应条件，改变Taq酶的突变频率，以一定的频率引入突变构建突变库，然后选择或筛选所要的突变体。 调整的PCR条件： a) 增加Mg2（稳定非

13、互补的碱基对） b) 添加Mn2（降低聚合酶的特异性） c) 4种底物的浓度不平衡（dATP/dTTP/dCTP/dGTP） 突变频率的控制 ：理论上每个靶基因导入的取代残基的个数宜在1.55个之间。 连续易错PCR：将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次易错PCR扩增的模板，连续反复进行随机诱变，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。 无性进化 ：易错PCR技术产生的突变只发生在单一分子内部。 （2） DNA改组技术技术为代表的有性进化 定义： 是从2种以上同源正突变基因出发，用酶（DNaseI）切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因

14、突变的技术过程。 原理： DNA片段互为模板和引物，进行扩增和延伸时碱基序列会重新排布而形成众多的突变基因，分离出全长突变基因后再进行常规PCR扩增以进行定向选择。 结果： 将存在于不同基因中的多种正突变结合在一起。（3）基因家族之间的同源重组 定义： 又称为基因家族改组技术，是从基因家族的若干同源基因出发，用酶（DNaseI）切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。 原理： 与DNA改组相同，过程亦相同。 区别： DNA改组从通过易错PCR等技术获得两个以上正突变基因出发进行重排；基因家族重排从基因家族中若干同源基因出发进行重排。 2

15、.酶突变基因的定向选择 酶分子的定向进化=随机突变+正向重组+定向选择（筛选） 定向选择定义： 是在人工控制条件的特殊环境下，按照人们所设定的进化方向对突变基因进行筛选，以获得具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。突变基因文库的筛选3.酶分子定向进化的应用a) 提高酶分子的催化效率 n 实例1：L-天冬氨酸酶的定向进化研究 进行4轮易错PCR，筛选了3000个菌落； 得到酶活力提高28倍的突变体，该酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶。n 实例2：-内酰胺水解酶定向进化研究 经过DNA重排技术其头孢噻肟的最低抑制浓度为原始菌株的32000倍，其对抗生素的耐受力增强证明其催化效率相应提高。b)

16、 提高酶分子的稳定性实例1：枯草杆菌蛋白酶热稳定性的提高 利用连续易错PCR和交错延伸方法重组DNA；枯草杆菌蛋白酶最适作用温度提高17，65的半衰期增加200倍。实例2：-淀粉酶90的半衰期延长9-10倍实例3：T4溶菌酶11个不同的单点突变株将Tm提高0.8-1.4c) 适应人工环境中提高酶活力或稳定性的进化d) 改变酶分子的底物特异性二王晓雪：原核生物，基因突变、修复，抗生素病毒特征:1. 以核酸和蛋白质等元件的装配来实现繁殖;2. 离体条件下，以无生命的生物大分子状态存在，可长期保持侵染活力 3. 有些病毒的核酸能整合至宿主的基因组中，并诱发潜伏性感染 4. 对一般抗生素不敏感，对干扰

17、素敏感5. 形体极其微小，需电镜观察6. 无细胞构造，主要成分仅为核酸和蛋白质7. 每种病毒仅含一种核酸，或DNA或RNA8. 无产能酶系、无蛋白质和核酸合成酶系，利用宿主活细胞内现成代谢系统合成自身的核酸和蛋白质组份海洋浮游病毒的计数:噬菌斑计数法 (plaque assay): 噬菌斑：细菌病毒侵染细菌细胞,导致寄主细胞溶解死亡，在琼脂培养基表面形成空斑。病毒复制过程吸附：通过病毒体表面的配体蛋白不宿主细胞表面特异性受体相结合侵入：通过胞饮、融合、直接穿入等方式增殖：利用宿主细胞提供的环境和物质合成大量病毒核酸和蛋白质外壳装配：病毒核酸和蛋白质外壳合成后，在宿主细胞内组装为成熟病毒颗粒释放

18、：从被侵染的细胞转移到外界，分为破胞释放和芽生释放噬菌体的吸附可逆吸附，无特异性，由随机碰撞而吸附，静电作用或氢键不可逆吸附，特异性，病毒表面蛋白与细胞受体结合细菌抵抗噬菌体吸附的不同机制通过改变表面受体蛋白 通过产生 通过修饰抗原和抗原 噬菌体按照侵染方式可分为：裂解型：侵入相应宿主细胞后正常复制并最终杀死细胞，形成裂解循环。溶源型（温和型）：温和噬菌体（溶源型）侵入相应宿主细胞后，其基因组整合到宿主细胞基因组中，随其复制而同步复制，这种温和噬菌体的侵入不会引起宿主细胞裂解。温和噬菌体基因组称为原噬菌体。存在形式有游离态和整合态原噬菌体作为细菌的调节开关原噬菌体作为基因开关调节细菌宿主的毒力

19、原噬菌体作为基因开关调节细菌宿主的自发突变率原噬菌体作为基因开关调节细菌宿主的生物被膜的形成CRISPR-CasCRISPR/Cas9基因编辑的魔法剪刀手 基因编辑是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术，可完成基因定点InDel突变、敲入、多位点同时突变和小片段的删失等。目前，基因组编辑有三大技术：CRISPR/Cas9、TALEN和ZFN。与传统的TALEN和ZFN技术相比，CRISPR/Cas9系统更便捷、高效，应用也更广泛，目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。Case Study 1 有合理的假设(hypothesis)，设计合理可行的方案(

20、a sound and well designed experimental plan)，找到作用机理(confirm hypothesis)。最常用的实验设计斱案 ；前沿和热门的领域 ；大量阅读文献，提炼科学假设 ；课题组的前期工作积累 1. 提出科学的假设： CRISPR system versus Anti-CRISPR2. 实验发现：发现1：噬菌体JBD30存在anti-phage基因发现2：噬菌体JBD30上的35号基因提供anti-phage功能发现3：噬菌体JBD30-35基因可直接提供anti-CRISPR功能发现4：噬菌体JBD30-35在蛋白水平发挥作用发现5：JBD30-

21、35丌影响crRNA丏丌影响Cas功能Case Study 2 实验中遇到Unexpected结果，寻找原因，找到新的作用通路。潜在的新发现 ；需要大量的阴性和阳性试验证实unexpected 结果的可靠性 ；课题组的前期工作积累 在实验中偶然发现细胞膜胁迫可以诱导CRISPR的功能Unexpected Result: 表达质粒无法丢失了？证实表达质粒被降解，突变后可以不被降解解释原因：表达质粒被CRISPR-cas系统降解机制的延伸：细菌的CRISPR-cas系统被激活的方式噬菌体疗法的利与弊中心法则是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质的转录呾和翻译的过程，以及遗传信息从

22、DNA传递给DNA的复制过程。这是所有有细胞结 构癿生物所遵循的法则。 Promoter: RNA聚合酶特异性识别并结合癿的DNA序列。 启动子是基因（gene）的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子就像“开兲”，决定基因的活动。基因突发 (mutation)一个基因内部可以遗传癿结构癿改发，又称为点突发，通常可引起一定癿表型发化 。广义癿突发包括染色体畸发，狭义癿突发与指点突发。实际上畸发呾点突发癿界限幵丌明确，特别是微细癿畸发更是如此。野生型基因通过突发成为突发型基因。突发型一词既指突发基因，也指具有这一突发基因癿个体。原核生物的一般构造及特性细胞壁（cell

23、wall）：细胞壁作用，固定细胞外形，提供保护作用。 不同类型的细胞壁结构和组分也不同。所有已知癿海洋原核生物在质膜外都有细胞壁。细菌细胞壁关键组份是肽聚糖，由两种交替存在的氨基糖残基（即N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸）以及少量氨基酸组成癿四肽侧链构成癿混合聚合物；古菌细胞壁成分发化较多，且不含真正的肽聚糖。原核生物基因组原核生物不像真核生物那样具有完整的细胞核，其核物质没有特定的形态和结构也不为核膜所包裹，较集中的分布在细胞质的特定区域内，称作拟核。 p 海洋细菌和古菌的大部分基因组以单一环状DNA分子癿形式存在。 p 拟核附于质膜上，DNA的复制就在此处収生，当细胞分裂时，膜的生长导致了

24、子代拟核癿分裂。 遗传物质从一个细菌转秱到另一细菌机制1. 接合作用：通过菌性毛移动或转动到另一细菌。2. 当细胞裂解后将DNA释放到环境中时可能会发生转化 3. 细菌基因还可以通过噬菌体的普遍性转导进行转移原核生物的特殊构造及特性荚膜和糖被：许多海洋原核生物在一定的营养条件下，可分泌一种粘液性的保外基质，附着在细胞壁外，称为糖被或糖萼。分为荚膜，微荚膜和粘液层等 海洋细菌的运动性：菌毛：许多细菌表面癿纤细癿头収样癿蛋白质丝，约1微米纤毛：具有粘附性结构的菌毛，较短，数目多，纤毛310微米鞭毛：一种从质膜呾细胞壁伸出的丝状，运动性附属物。鞭毛较长、数目少。长约150微米。鞭毛的结构核糖体开关：

25、蛋白质的合成离丌开对mRNA的“翻译”。在RNA序列中，有一部分被称为“核糖开关”（riboswitch）的区域，它的状态直接决定翻译过程能否开始。突变：细胞中遗传物质的改变，它包括单个碱基改发所引起的点突发，或多个碱基的缺失、重复和插入。 突变类型：分类的依据： p1. molecular nature of the defect（突发的本质） 碱基替换；插入或缺失突变2 phenotypic effect- amino acid sequence of the protein is altered or not（突发引起的结果） 正向突变：由原始野生型基因变异为突变型基因反向突变；反之同义

26、突变：碱基改变，但由于密码子的简并性导致编辑的氨基酸不变非同义突变：反之无义突变：突变导致形成终止子，阻断氨基酸的翻译，形成没有功能的蛋白质。中性突变：突变导致氨基酸的改变，但氨基酸的功能没有变化功能缺失型突变：功能获得型突变：条件性突变；致死型突变；抑制突变p3. the causative agent of the mutation （突发的原因） 自发性突变：自然环境发生的诱发性突变：化学修饰，（碱基修饰剂如脱氨、羟胺、烷化等、DNA插入剂如溴化乙锭、碱基类似物如5-溴尿嘧啶）物理损伤诱发突变，电离辐射、非电离辐射突变与适应拉马克主义：获得性遗传达尔文主义：DNA修复机制碱基切除修复错配

27、修复核酸切除修复生物膜突变Single-nucleotide polymorphism （SNP）单核苷酸多态性基因组水平上由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。抗生素是某些微生物的次级代谢产物或合成的类似物，在小剂量的情况下能抑制微生物的生长和存活 ，对宿主不会产生严重的毒性。 来源：生物合成、化学全合成、半合成（增加稳定性；降低毒副作用；扩大抗菌谱减少耐药性；改善生物利用度提高疗效 ）应用：1. 抑制病原菌的生长 用于治疗细菌感染性疾病 2. 具有抗肿瘤活性 用于肿瘤的化学治疗 3. 免疫抑制和刺激动植物生长作用 抗生素

28、不仅用于医疗，而且还应用于农业、畜牧业和食品工业等方面 主要类别：作用机制：抗生素耐药性是指细菌对药物所具有的相对抵抗性。（固有耐药性/获得耐药性），以该药对细菌的最小抑菌浓度表示。耐药性机制：1.使抗生素分解或失去活性： 细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰迚入细菌内的抗生素使之失去生物活性。2. 使抗菌药物作用的靶点发生改变：由于细菌自身发生突变或细菌产生某种酶的修饰使抗生素的作用靶点（如核酸或核蛋白）的结构发生变化，使抗菌药物无法发挥作用。3. 细胞特性的改变：细菌细胞膜渗透性的改变或其它特性的改变使抗菌药物无法进入细胞内4. 细菌产生药泵将进入细胞的抗生素泵出细胞：细菌产生的一

29、种主动运输方式，将进入细胞内的药物泵出至胞外。5. 改变代谢途径：如磺胺药不对氨基苯甲苯酸（PABA），竞争二氢喋酸合成酶而产生抑菌作用。耐药性来源：固有耐药性：是由细菌染色体基因决定、代代相传，不会改变的，如链球菌对氨基糖苷类抗生素天然耐药。获得性耐药性：由于细菌与抗生素接触后，由质粒介导，通过改变自身的代谢途径，使其不被抗生素杀灭。如金黄色葡萄球菌产生-内酰胺酶而耐药。新抗生素三史大勇：蛋白质，氨基酸，维生素蛋白质的主要功能： 1、催化功能：酶催化生命过程中的一切生物化学变化，绝大多数酶是由蛋白质组成的。 2、免疫防御作用：生物体能够产生蛋白质抗体，是防御外来细菌或病毒入侵的基本机制。 3

30、、转运功能：转运蛋白能够携带各种物质通过细胞膜，维持正常的物质交换过程。 4、调控作用：生物体内的许多激素，如胰岛素等以及它们的受体，大都是蛋白质产生或构成的，这些调控蛋白在许多生命过程中起着重要的调控作用。 5、形成生物体的基本形体结构：如动物的骨骼、肌肉、皮肤等物质的成分。 6、运动功能：肌肉蛋白的拉伸和收缩产生各种形态的运动。 7、神经刺激的产生和传导：调节机体的生命活动。羧酸分子中烃基上的一个或几个氢原子被氨基取代生成的化合物叫氨基酸。八个必需氨基酸（一两色素本来淡些）赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸。两性离子（dipolarrion ，dipola

31、r ion）又称为兼性离子（zwitterions），也称为偶极离子，在同一个氨基酸分子上含有等量的正负两种电荷，由于正负电荷相互中和而呈电中性。 等电点（isoelectric point）（PI）一个氨基酸总可以找到一个pH值，在该pH值下，正、负离子的浓度完全相等，此时向阳极移动和向阴极移动的离子彼此抵消（即没有净的迁移），或者说，电场中不显示离子的迁移。将此时的pH值称为该氨基酸的等电点。 氨基酸的重要化学反应1. 茚三酮反应（ninhydrin reaction）：凡是有游离氨基的氨基酸都可以和茚三酮发生呈紫色的反应。(例外：Pro黄色；Asn棕色)2. 桑格反应（Sanger re

32、action）：氨基酸+DNFB-DNP-氨基酸（黄色），在弱碱性溶液中。 2，4-二硝基氟苯（DNFB ）；应用于鉴定多肽链氨基末端的氨基酸。3. 艾德曼反应(Edman reaction) ，也称作艾德曼降解法（Edman degradation）； 异硫氰酸苯酯（PITC）+-氨基酸 苯氨基硫甲酰氨基酸 苯乙内酰硫脲（PTH）+少一个残基的肽（硝基甲烷溶剂中用甲酸处理）。 用于鉴定多肽链中的N-末端的氨基酸。氨基酸残基（residue）：多肽链中氨基酸，参与肽键形成，已经不是原来完整的氨基酸分子。残基用某氨酰称呼。 蛋白质的分子结构可划分为四级，以描述其不同的方面：一级结构：组成蛋白质多

33、肽链的线性氨基酸序列。二级结构：依靠不同氨基酸之间的C=O和N-H基团间的氢键形成的稳定结构，主要为螺旋和折叠。超二级结构：是指多肽链上若干相邻的构象单元彼此作用，进一步组合成有规则的结构组合体结构域：是指存在于球状蛋白质分子中的两个或多个相对独立的、在空间上能辩认的三维实体，每个由二级结构组合而成，充当三级结构的构件。三级结构：通过多个二级结构元素在三维空间的排列所形成的一个蛋白质分子的三维结构。四级结构：用于描述由不同多肽链（亚基）间相互作用形成具有功能的蛋白质复合物分子。构型和构象构型（configuration）:立体异构体中取代原子（基团）在空间的取向。构型改变涉及共价键的形成与破坏

34、。构象（conformation）:分子中原子的三维空间排列。单键旋转时取代基团可能形成的不同的立体结构，仅涉及氢键的建立与破坏，不涉及共价键的变化。维持蛋白质空间结构作用力1、氢键：氢键是由多肽链中电负性很强的氮原子或氧原子与NH或OH的氢原子之间相互作用形成的一种吸引力。氨基酸中的=NH亚氨基、-C=O羰基和-OH羟基在蛋白质中可形成氢键。氢键对维持蛋白质空间结构和保持蛋白质稳定性起着极其重要的作用。 2、盐键：是存在于蛋白质中带有正、负电荷的侧链基团之间的一种静电吸引作用。如谷氨酸R基中的羧基；赖氨酸R基中的氨基；精氨酸R基上的胍基和组氨酸中的咪唑基等。 3、疏水作用：是由氨基酸中的非极

35、性疏水侧链基团相互接近而形成的一种作用力，如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸的侧链都是疏水基团，在水介质中总是趋于避开水相而在分子内部形成疏水区。4、范德华引力：是分子间弱的作用力。5、二硫键：二硫键是蛋白质三级结构中唯一的共价键，它是由一条或两条多肽链中的两个半胱氨酸残基的巯基氧化后形成的。 6、配位键：两个原子之间由单方面提供共用电子对形成的共价键称为配位键。含有金属离子的蛋白质中，金属离子与多肽链的连接往往是配位键。为什么蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体？1) 这是由于蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如NH2、COOH、CONH2、OH、SH等，和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇

36、时，很容易被吸附，在蛋白质颗粒表面形成一层高密度水膜或称水化层。水膜的存在使蛋白质颗粒相互隔开，颗粒之间不会因碰撞而聚集成大颗粒。2) 在非等电点状态时，相同蛋白质颗粒表面带有同性电荷，使颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互聚集变性作用在理化因素的影响下，天然蛋白质分子内部原有的高级结构发生变化时，其理化性质和生物学功能都随之改变或丧失，但并未导致一级结构的变化，这种现象叫变性作用复性蛋白质的变性作用如不过于剧烈，高级结构松散了的变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢恢复原来的构象，并恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象称为复性变构效应是指在寡聚蛋白分子中，一个亚基由于与其他分子结合而发

37、生构象变化，并引起相邻其他亚基的构象和功能的改变。简述血红蛋白与肌红蛋白的蛋白质结构异同，简述其与氧结合情况。肌红蛋白和血红蛋白结构上的不同之处：肌红蛋白是单链蛋白，血红蛋白是由四个亚基组成的寡聚蛋白，相同之处是：血红蛋白的每个亚基和肌红蛋白都具有相同的三级结构。 血红蛋白和肌红蛋白与氧结合时表现出不同的结合模式。血红蛋白的氧结合曲线是S形曲线；而肌红蛋白的氧结合曲线是双曲线。 S曲线说明在血红蛋白分子与氧结合的过程中，其亚基之间存在相互作用。血红蛋白四聚体在开始与氧结合时，其氧亲和力很低，即与氧结合的能力很小。一旦其中一个亚基与氧结合，亚基的三级结构发生变化，并逐步引起其余亚基三级结构的改变

38、，从而提高其余亚基与氧的亲和力；同样道理，当一个氧与血红蛋白亚基分离后，能降低其余亚基与氧的亲和力，有助于氧的释放。经实验测定，第四个亚基与氧的亲和力比第一个亚基大200-300倍。 血红蛋白与氧结合的型曲线具有重要的生理意义。在肺部由于氧分压高，脱氧血红蛋白与氧的结合接近饱和；在肌肉中氧分压低，氧合血红蛋白与肌红蛋白相比能释放更多的氧，以满足肌肉运动和代谢对氧的需求。可见，血红蛋白比肌红蛋白更适合运输氧。举例说明蛋白质一级结构、空间结构与功能之间的关系。（简述）蛋白质一级结构是高级结构的基础。有相似一级结构的蛋白质，其空间构象和功能也有相似之处。如垂体前叶分泌的ACTH的第4至10个氨基酸残

39、基与促黑激素（-MSH、-MSH）有相似序列，因此，ACTH有较弱的促黑激素作用。但蛋白质分子关键活性部位氨基酸残基的改变，可导致其功能改变。如镰刀形红细胞性贫血是因其Hb的-链上一个氨基酸发生改变所致（由正常的-6-Glu变为-6-Val）。蛋白质的空间结构与功能密切相关，如Hb由T型（紧密型）变为R型（疏松型），Hb与氧的亲和力增大约200倍氨基酸的重要化学反应1. -NH2参加的反应1. 1烷基化反应1.1.1氨基酸与2,4-二硝基氟苯DNFB反应 1.1.2氨基酸与苯异硫氰酸酯（PITC）反应1.1.3含硫氨基酸的烷基化反应-S-腺苷甲硫氨酸（SAM）1. 2酰基化反应1.2.1氨基酸

40、的-氨基与适当的酰基化剂作用可以得到酰胺 1.2.2一个氨基酸分子的羧基与另外一个氨基酸分子的氨基发生酰基化反应生成酰胺键-在蛋白质化学中称为肽键1.2.3酰氯或酸酐在微碱中溶液中的与氨基酸的酰基化反应1. 3脱氨基反应氨基酸在生物体内经氨基酸氧化酶的催化即脱去-氨基而转变成酮酸1.4与亚硝酸反应收集反应放出的氮气，可用来测定氨基酸的含量，这种测定氨基酸含量的方法称为范斯莱克（Van slyke）氨基测定法。1.5形成西佛碱的反应氨基酸的-氨基能与某些醛类化合物反应生成弱碱（西佛碱）2.-羧基参加的反应 2.1成盐、成酯反应2.2成酰氯的反应氨基被保护后，羧基可与二氯亚砜或五氯化磷反应，生成酰

41、氯， 使羧基活化，在多肽的人工合成中常用。2.3叠氮反应2.4脱羧基反应将a-氨基酸加热时，可脱去CO2得到胺3.-NH2和-COOH共同参加的反应3.1与茚三酮反应三酮在弱酸中与-氨基酸共热，引起氨基酸的氧化脱氨，脱羧反应，最后，茚三酮与反应产物氨和还原茚三酮反应，生成紫色物质（max=570nm）。3.2成肽反应一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基可以缩合成肽，形成的键称肽键。4. 侧链R基参加的反应 4.1酪氨酸的酚羟基在3和5位上容易发生亲电取代反应，例如发生碘化或硝化，分别生成一碘酪氨酸和二碘酪氨酸或一硝基酪氨酸和二硝基酪氨酸。酪氨酸的酚基还可以与重氮化合物(例如对氨基苯磺酸的重氮盐

42、)结合生成桔黄色的化合物。4.2组氨酸的侧链咪唑基 与重氮苯磺酸也能形成相似的化合物，但颜色稍有差异，呈棕红色。4.3精氨酸的侧链胍基在硼酸钠缓冲液(pH8-9, 25-35)中，与1，2-环己二酮反应，生成缩合物一级结构测定的基本流程蛋白质或多肽的水解1、酸性水解 得到的氨基酸不消旋，但天冬酰胺和谷氨酰胺分别为完全水解为天冬氨酸和谷氨酸，色氨酸则完全被破坏，半胱氨酸不能从样品中直接测定。酪氨酸部分被水解液中的痕量杂质所破坏，丝氨酸和苏氨酸被部分水解，损失分别为10%和5%2、碱性水解 多数氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、精氨酸以及半胱氨酸遭到破坏，其他的氨基酸外消旋化，仅色氨酸是稳定的，所以此法仅限

43、于测定色氨酸的含量。3、酶水解 优点是水解过程中氨基酸不发生消旋化，几乎可以保持所有的组成氨基酸不被破坏。因为酶水解条件温和，对天冬酰胺、谷氨酰胺等皆无破坏作用。 缺点是反应需要较长的时间，水解的产物为较小的肽段，水解不完全。另外，因为酶本身也是蛋白质，对样品的测定结果可能会有干扰4.微波辐射能水解 微波能量的快速吸收能导致完全水解的时间大大缩短，在微波辅助酸水解和微波辅助酶水解中，水解时间可从过去的几十小时缩短到几十分钟特殊氨基酸的保护色氨酸的保护 半胱氨酸的保护 蛋白质的末端测定N-末端的测定 1. 二硝基氟苯法（DNFB法、Sanger法） 2. 二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法） 3

44、. 异硫氰酸苯酯法（PITC法、Edman法） 4. DABITC法 5. 氨肽酶法 C-末端的测定 1.羧肽酶法 2.硼氢化锂法（LiBH4法，还原法） 3.肼解法封闭N-末端的测定 1.乙酰化N-末端 2.吡咯烷酮羧酸末端 3.甲酰基末端 肽链的部分降解：1、化学裂解法（溴化氰）；2、酶解法；3、羟胺裂解法；4、部分酸水解氨基的保护方法 1）叔丁氧基羧基（t-Boc）：t-Boc基是常用的氨基保护基。二叔丁基二碳酸酯与氨基酸作用形成t-Boc-氨基酸，可以有效地达到保护氨基的作用。2）苄氧羰基（CBz）: 肽键形成的方法 :氨基酸的-羧基不可能直接与氨基作用形成肽键，通常是采用下面两种方法

45、进行。（1） 羟基活化法 酰氯法：氨基酸的羧基可以转变成酰氯： 酸酐法：氨基酸的羧基也可以转变成活泼的酸酐基： 酰基叠氮法：此法的优点是不易引起氨基酸消旋化。（2）活性酯法酰基叠氮在使用和储存时容易分解，通常将它与N-羟基丁二酰亚胺反应，产物是一种稳定的结晶化合物，称为“活性酯”小结：1、氨基的保护方法：叔丁氧基羧基，苄氧羰基。 2、羧基的保护方法：形成酯基。 3、肽键形成：羟基活化法（酰氯法、酸酐法、酰基叠氮法），活性酯。 4、偶联剂和肽键的形成：碳二亚胺，Woodward 试剂。 5、多肽合成的策略：逐步增长法，片段组合法。 6、多肽的固相合成：通常选择聚苯乙烯为载体。 7、组合合成法合成

46、多肽：并行合成法，均分合成法。 8、酶促肽的合成：酶促半合成人工胰岛。 组合合成法合成多肽简述。两条途径：并行合成法和均分合成法。前者合成速度较慢，合成容量小，现在已经很少应用。均分合成法是目前应用最广的一种方法。均分合成法的基本原理是：每一个合成步骤分别合成出x组中间体，混合均匀后再平均分成x份，分别延长一个结构单元。反应产物再混合均分成x份，再延长一个结构单元，直至完成全部合成。eg：合成目标：C-端为Ala，其他三个氨基酸组成为Glu，Phe和Lys的四肽。这种类型的四肽库共有异构体数目应为33=27个。1、中心法则： 是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传

47、信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。 2、蛋白质合成体系： l mRNA（遗传信息的载体） l 遗传密码（密码子）（连续性、简并性、通用性、方向性、摆动性） l t RNA和氨基酸的活化 l rRNA和核蛋白体（多肽链合成场所） l 辅助因子（起始因子、延长因子、释放因子） l 供能物质和无机离子（ATP、GTP、Mg2+、K+） 3.蛋白质生物合成过程包括三个阶段：氨基酸的活化与搬运；氨基酸羧基的活化是通过与tRNA结合成氨基酸酰-tRNA而实现的（1）氨基酰-tRNA合成酶活化氨基酸在核蛋白体上的缩合 （起始 延

48、长 终止）1.多肽链合成的起始：指mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核蛋白体结合而形成翻译起始复合物的过程。（1）原核生物翻译起始复合物形成 a. 核蛋白体大小亚基分离；b. mRNA在小亚基定位结合；c. 起始氨基酰-tRNA的结合； d. 核蛋白体大亚基结合（2）真核生物翻译起始复合物形成 真核生物翻译起始复合体的形成过程与原核生物类似，但参与的蛋白因子更多。 核蛋白体大小亚基分离； 起始氨基酰-tRNA结合； mRNA在核蛋白体小亚基就位； 核蛋白体大亚基结合。（3）真核与原核生物起始区别2. 肽链的延长包括多肽链合成的进位、成肽和转位三步反应（1）进位（entrance）进位又称注册

49、(registration)，即与mRNA下一个密码相对应的氨基酰tRNA进入核蛋白体的A位。此步骤需GTP，Mg2+，和EF-T参与。（2）成肽（peptide bond formation）是由转肽酶(transpeptidase)催化的肽键形成过程。即在转肽酶的催化下，将P位上的tRNA所携带的甲酰蛋氨酰基或肽酰基转移到受位上的氨基酰tRNA上，与其a-氨基缩合形成肽键。此步骤需Mg2+，K+。（3）转位（translocation）延长因子EF-G有转位酶( translocase )活性，可结合并水解1分子GTP，促进核蛋白体向mRNA的3'侧移动相当于一个密码的距离，同时使

50、肽酰基tRNA从A位移到P位。此步骤需GTP和Mg2+参与。此时，核蛋白体的A位留空，与下一个密码相对应的氨基酰tRNA即可再进入，重复以上循环过程，使多肽链不断延长。已失去蛋氨酰基或肽酰基的tRNA从核蛋白体E位上脱落。3. 肽链的终止核蛋白体沿mRNA链滑动，不断使多肽链延长，直到终止信号进入A位。（1）识别：RF识别终止密码，进入核蛋白体的A位。 （2）水解：RF使转肽酶变为酯酶活性，多肽链与tRNA之间的酯键被水解，多肽链释放。（3）脱离（释放）：模板mRNA、RF以及空载tRNA与核蛋白体脱离多肽链合成后的加工修饰。 多肽链折叠为天然的三维结构肽链；一级结构的修饰；高级结构

51、修饰4.多肽链合成的能量消耗4n1遗传密码（名词解释）DNA编码链或mRNA上的核苷酸，以3个为一组（三联体）决定1个氨基酸的种类，称为三联体密码。mRNA的三联体密码是连续排列的，因此，mRNA的核苷酸序列可以决定蛋白质的一级结构。论述遗传密码的特点1） 遗传密码为三联体：模板从mRNA5端的起始密码子开始，到3端的终止密码称为开放读码框架。在框架内每3个碱基组成1个密码子，决定1个氨基酸。（2）遗传密码的种类：遗传密码共64个，其中61个密码子分别代表各种氨基酸。3个为肽链合成的终止信号。位于5端的AUG，除了代表甲硫蛋氨酸外，还是肽链合成的起始信号。（3）遗传密码的连续性：对mRNA分子

52、上密码子的阅读方法叫读码。正确读码是每3个相邻碱基一组，不间断地连续读下去，直到出现终止密码为止。mRNA上碱基的插入和缺失，可导致框移突变。（4）遗传密码的简并性：有61个密码子代表20种氨基酸，每个密码子只代表一种氨基酸，而多数氨基酸都有24个密码子，这种由几个密码子编码同一氨基酸的现象称为简并性。从密码表上可看出密码子的第3位碱基通常是简并的。（5）遗传密码的摆动性：指密码子与反密码子配对不遵从碱基配对规律，此不严格的配对关系称为摆动性。如丙氨酰 tRNA反密码子的第1位碱基I可以与密码子第3位的A、C或U配对。遗传密码的摆动性使一种tRNA可以识别几种代表同一种氨基酸的密码子。（6）遗传密码的通用性：从细菌到人的遗传密码都市通用的，但近年发现哺乳类动物线粒体的蛋白质合成体系中有个别例外。如UAG不代表终止密码子，而代表色氨酸；CUA不代表亮氨酸，而代表苏氨酸。（7）遗传密码的防错系统：由于遗传密码的简并性，有4个密码的氨基酸，其第三位的碱基被替换，仍编码同一种氨基酸，从遗传密码表可以看出，只要遗传密码的第二位是U，则第一位和第三位不论怎么变化，其编码的氨基酸总是疏水性的，如第二位是C，则其编码的氨基酸是非极性的或极性不带电荷的，若第二位为A或G，则编码的氨基酸R基是亲水性的，第一位是A或C