实验1植物组织中几种重要碳水化合物

1、实验1 植物组织中几种重要碳水化合物 的分组分离及其测定 一、植物组织中几种重要碳水化合物的分组分离植物体内的碳水化合物按照化学性质，可分为单糖、寡糖和多糖三大类，每一类中又可分为若干种，其生理作用各不相同。测定时按照测定目的不同可分类提取，分别测定。常用的分离提取方法是根据各种碳水化合物在乙醇和水中的溶解度不同，以及水解的难易加以区别。这种方法在一般的营养状况研究中经常采用。当需要对每一种糖进行分离鉴定时，则必须利用更加精密的分离方法，如纸层析分离法或直接在纸谱上显色，利用光密度计鉴定。现代的高效液相色谱分析更是进行碳水化合物分离鉴定的有效手段。本实验只介绍常规的分离方法。原理碳水化合物中的

2、单糖及寡糖易溶于水及乙醇，而糊精、果聚糖等多糖可溶于水但不溶于乙醇；淀粉不溶于冷水，但经加热糊化后亦可部分溶于水中，半纤维素不溶于热水，但可用稀酸水解，纤维素则只可用浓硫酸方可水解，故可用不同方法提取植物样品以测定不同类型的碳水化合物。可溶性糖（单糖、寡糖）一般用82%乙醇提取，其残渣经4050热水提取，可测定其中的糊精、果聚糖（葡糖）等水溶性多糖。剩余部分有淀粉、半纤维及纤维素，其中淀粉可用淀粉酶水解，也可用过氯酸提取，残渣用2%的盐酸加热水解，以测定半纤维素，而纤维素则用80%的浓硫酸溶解，分别测定各级提取液及水解液，即可求出各种类型碳水化合物的含量。方法（一）样品的预处理测定碳水化合物的

3、含量可用新鲜样品或烘干样品。其原则是，从取样至样品完全杀死以前，尽量减少植物体内碳水化合物的含量及种类的变化。当用于样品分析时，应迅速将样品放在105烘箱中20分钟左右，将细胞杀死，然后在80下烘干。幼嫩材料含单糖多的，烘干温度过高糖易焦化，最好在60下，用真空干燥箱烘干。样品烘干后，用粉碎机粉碎，全部通过60目筛，即可作为分析样品。如用鲜样品直接分析，应取剪碎的新鲜材料二份，准确称重，一份放入105烘箱中，烘至恒重，测其含水量，以求得供试材料的干重，另一份立即投入几乎沸腾的95%乙醇中，以停止酶的活动，乙醇的用量应使加入植物材料后，其浓度不低于80%，如此固定的材料也可长期保存。（二）碳水化

4、合物的系统分离较细致的分离方法可将碳水化合物分为以下五组：1可溶性糖类（包括单糖、寡糖），可按下列步骤进行：（1）浸提：精确称取干样品二份，第一份重5克，于105下烘至恒重，测定含水量。另一份重1克，供分析用。将样品投入100ml三角瓶或大试管中，加82%的中性乙醇20-30ml（乙醇用量依材料中含糖量而定，含糖量高的应适当多加），瓶口塞以带长玻管的塞子，作回流冷凝用。将三角瓶固定在支架上，在7075恒温水浴中抽提30分钟，如材料含酸过多，应加少量饱和Na2CO3溶液中和，以防提取过程中蔗糖的水解。浸提完毕，待澄清后，将上清液过滤入蒸馏瓶中（过滤时尽量避免将残渣倾倒在滤纸上），另换乙醇浸提，反

5、复3-4次（后几次浸提时间可减至1015分钟），最后把全部乙醇提取液连同残渣过滤入蒸馏瓶中（如为新鲜材料，应将固定时所用乙醇一并倾入蒸馏瓶中），用少量乙醇冲洗容器及漏斗中残渣，不使糖分有损失。残渣保留，供分析第二组碳水化合物用。（2）蒸去乙醇：将上述乙醇提取液在4045水浴上进行减压蒸馏，当浓缩成浆状物以后，再加蒸馏水10ml，继续蒸馏，以去尽残留的乙醇，最后再在粘浆状物中加少量温暖的蒸馏水，以溶出可溶性糖，转入另一锥形瓶中，用少量蒸馏水洗涤蒸馏瓶，洗后的水也倒入同一锥形瓶中，使总体积不超过40ml，蒸馏瓶壁上若有不溶物，可不必管它。亦可将提取液洗入蒸发皿中，放在4045水浴上蒸发，至乙醇完全

6、蒸发为止，冷却后，用水约20ml溶出可溶性糖，无损地转入锥形瓶中。（3）沉淀蛋白质：向浸提液中滴入10%中性醋酸铅，以沉淀蛋白质，直至不再产生沉淀为止。再滴入10%硫酸钠或草酸钠溶液以除去多余的铅，以免妨碍以后的分析，直至不再产生沉淀为止。过滤入50ml容量瓶中，用少量蒸馏水冲洗容器及残渣数次，洗涤液一并加入容量瓶中，最后加水定容，即可供测定用。有些提取液中蛋白质等杂质少，沉淀蛋白质一步可省去，提取液立即测定，以免微生物滋生，如须保存一定时间，应放入冰箱中，或加12滴氯仿防腐。（4）还原糖的测定：把提取液配制成适当浓度（如提取液浓度过高，应按一定倍数稀释后测定，记下稀释倍数），然后测定还原糖浓

7、度A（mg/ml），再以下式求出组织中的还原糖（包括单糖及1/2麦芽糖）： 还原糖（%）=(还原糖浓度A×提取液总量×稀释倍数)/组织干重×100 （5）蔗糖的测定：吸取提取液4ml加入大试管中，加入10%HCl 1ml，使溶液中HCl浓度为2%，若溶液含糖量高，可适当减少提取液用量，同时适当调整HCl用量，仍使溶液中HCl浓度保持2%，在70水浴上加热5分钟，以水解蔗糖。然后用Na2CO3饱和溶液中和，用适当方法测得还原糖浓度B（mg/ml）。其中包括单糖、1/2麦芽糖和蔗糖。从B值减A值再乘以0.95，既为蔗糖浓度，依下式求组织中蔗糖百分率： 蔗糖（%）=（6

8、）可溶性糖总量的测定：利用2%的HCl在70下水解5分钟只能水解蔗糖，其它可溶性糖类如麦芽糖及其它三糖、四糖等，须在沸水浴中3小时方可完全水解。因此，为了测定可溶性糖总量，可以按照蔗糖测定法吸取一定量的提取液，加HCl，使成1%浓度，在沸水浴中水解3小时，取出中和，其它步骤同蔗糖。测得总糖量为C（mg/ml），其中包括单糖、蔗糖、麦芽糖和少量其它寡糖类，如果提取液中的双糖以蔗糖和麦芽糖为主，则可按下列公式计算麦芽糖的近似值： 麦芽糖（%）=按照以上三个测定数字，亦可大至计算出单糖含量： 单糖=由于提取液中总会含有少量其它寡糖类，故对于麦芽糖和单糖的计算都是近似的。若要精确的定量分析各种糖类，则

9、应先进行色层分离，然后逐一进行定性与定量分析。2水溶性多糖类（包括糊精、菊糖和低分子果聚糖、粘多糖和一部分果胶类物质），其步骤如下：（1）将提取可溶性糖后的全部残余物风干或在50下烘干，以除去乙醇。然后加4050温水浸提，每克干物质用水2030ml，浸提34次，每次提取液均用玻璃过滤器过滤。如果在提取可溶性糖后立即提取水溶性多糖，亦可免去烘干步骤，而将滤纸上的沉淀全部洗入小烧瓶（或锥形瓶）中，如果要在第二天进行分析，则应在溶液中加12滴氯仿，并用塞子塞住瓶口。（2）合并滤液，在沸水浴上适当浓缩。（3）向浓缩液中加入适当的1020%HCl，使总的HCl浓度为2%，在沸水浴上水解3小时，用Na2C

10、O3中和后加入醋酸铅及硫酸钠除去蛋白质如前。过滤入容量瓶中配成适当浓度的溶液，测定还原糖，还原糖量乘以0.9，即为水溶性多糖。依下式求出组织中水溶性多糖的%：水溶性多糖（%）=(还原糖浓度×0.9×提取液总量×稀释倍数)/组织干重×100注：组织干重系指提取可溶性糖之前样品的干重，下同。（4）由于此法中约有25%的果糖分解，因此，对含菊糖较多的材料，应从上述浓溶液中分出一小部分（应准确计算占溶液总量的%，在测定结果中补入这一部分）测定菊糖。测定方法可用0.10.15%的HCl在沸水浴上水解30分钟，或用2%HCl在6770水浴上水解5分钟，然后测定还原糖

11、。把测出的还原糖量×0.25×0.9作为校正值，加入前一测定值中。3淀粉将提取水溶性多糖后的残余物，洗入烧瓶中，加入适量的水（每1g材料共用1015ml）在沸水浴中糊化30分钟，如果材料含果胶很多，则只能在60水浴中加热30分钟，因为温度过高，果胶易溶于水中。糊化完毕，待温度降至50左右时，加入适量的淀粉酶液和几滴甲苯，塞好塞子，置于4045的恒温箱中24h，取出少量残渣用I-KI检查淀粉是否完全水解。待完全水解后，用玻璃过滤器过滤，洗涤瓶壁和残渣，此时滤液中含有淀粉的水解产物糊精和麦芽糖。将滤液浓缩，加HCl使成2%浓度，在沸水浴中水解3h，中和后测定还原糖量，测定值乘以

12、0.9即为淀粉含量。计算公式同水溶性多糖。如有必要，亦可如前法沉淀蛋白质。4半纤维素与果胶类物质将测定淀粉后的残渣，全部洗入烧瓶中，加盐酸使成2%的浓度，在沸水浴上水解3h，中和后用玻璃滤器过滤。把过滤液配成适当浓度的定量溶液，然后测定还原糖浓度。还原糖量乘以0.9即为第四组碳水化合物总量。计算公式同水溶性多糖。5纤维素把测定半纤维素之后的残渣洗出，在50下烘干，移入烧瓶，加10倍重量的80%硫酸，置室温下2.5h，其间摇动几次，玻璃滤器上粘附的少量纤维素也加入少量硫酸溶解。浸泡2.5h后，小心地向酸中加入15倍体积的水，置沸水浴上水解5h，中和后，加水至一定量，或再稀释成一定倍数，然后测定还

13、原糖量。测定值乘以0.9，即为纤维素量，计算公式同水溶性多糖。（三）碳水化合物的简易分组分离法按照上述分离方法将碳水化合物分为五组，分别测定，虽能测出各类化合物的含量，但手续繁杂，费工费时，对于许多测定来说，并非必需，故实际应用中，常采用一些变通办法，将某些组分合并测定，至于具体的合并方法，则根据测定目的及测定材料所含的碳水化合物种类而定。一般来说，可以按碳水化合物在植物体内的作用分成三大类。第一类：可称为“代谢性碳水化合物”，这类碳水化合物多属代谢中间产物，如光合碳循环和呼吸作用的五碳糖循环中的糖类，作为呼吸底物的葡萄糖和果糖，以及它们的磷酸酯等等，这类碳水化合物往往是一边生成，一边转化，很

14、少在体内积累，所以含量常常很低，而且比较稳定。第二类是贮藏性碳水化合物，它们常常在某些贮藏器官（种子、块根、块茎、鳞茎等）或暂存性器官（茎、叶鞘等）中大量积累，以供应下一个生活周期或下一个生育阶段的需要，尤其是暂存器官中贮存的碳水化合物，对于判断植物的营养状况至关重要。这类碳水化合物的种类，因植物和器官而异，种子、某些块根、块茎中以淀粉为主，葱、蒜类的鳞茎、甘蔗、高粱、玉米茎杆中以蔗糖为主，某些菊科植物的块茎（如菊芋）以菊糖为主，小麦茎杆中以蔗糖为主，水稻茎杆中则存有大量淀粉。第三类是结构性碳水化合物，构成植物细胞壁，其主要成分是纤维素、半纤维素和果胶类，在某些情况下，半纤维素可以分解成小分子

15、碳水化合物而被重新利用，如某些豆科种子发芽时，子叶细胞壁的半纤维素可以水解。水稻、小麦茎杆细胞壁的半纤维素在灌浆期也可以水解一部分运往籽粒，所以半纤维素兼有结构性碳水化合物和贮藏性碳水化合物两种性质。根据碳水化合物的以上功能，有时可采用一些简化的分析方法，常用的有以下几种：1对于以淀粉为主要贮存形式的器官，可以分为水溶性碳水化合物（以冷水或40温水浸提）和淀粉两部分。2对于以蔗糖为主要贮存形式的器官，可以用温水提取植物材料，测定其中的还原糖和蔗糖两部分。3对于含果聚糖较多而淀粉极少的小麦茎杆，可以先用82%乙醇提取第一组碳水化合物，然后用热水浸提出果聚糖类，所剩残渣进行结构性碳水化合物测定。4

16、可利用碳水化合物测定：利用酶解法将淀粉水解，测定其中全部水溶性碳水化合物，作为植物可以利用的碳水化合物总量（包括淀粉、果聚糖、糊精以及全部单糖和寡糖），在某些情况下也可代表植物碳素营养状况。考虑到小麦、水稻茎杆在生育后期，有一部分半纤维素分解利用，所以也可用2%HCI在沸水浴中水解3h，测定其中水溶性碳水化合物作为可利用的碳水化合物。酸解法应比酶解法的测定值为高。5水溶性碳水化合物总量：对于小麦茎、鞘，还可用沸水提取法（置沸水浴中用水提取2030min），提取其中果聚糖、糊精等及分子量更小的多种水溶性糖类，一并测定其总量，作为可利用碳水化合物，此法对于基本不含淀粉的材料来说，应与酶解法测定值相

17、似，但手续都大大简化，具体方法如下：取新鲜样品，剪碎（成1mm），混匀，用称量瓶称取2份，一份重5g左右，立即放在105烘箱中烘至恒重，求出含水量。另一份重1g左右，放入2.5×20cm的大试管中，加水10ml，置沸水浴上浸提20min，静置，将上清液滤入100ml锥形瓶中，试管中残渣再加水10ml，继续提取，如此提取三次，将残渣倾倒在漏斗的滤纸上，用清水冲洗试管及残渣，使总液量不超过40ml，向浸提液中加入10%中性醋酸铜以沉淀蛋白质，直到不再产生沉淀为止，再滴入10%硫酸钠以除去多余的铅，将提取液过滤入50ml容量瓶中，用少量蒸馏水冲洗容器及沉淀数次，洗液一并滤入容量瓶，最后定容

18、至刻度，摇匀、待测，如须保存一段时间，可加12滴氯仿，将待测液保存在冰箱中。如须测定干材料，可精确称取通过60目筛的样品0.20.3g，提取方法如前。6水溶性碳水化合物速测法：为了进行作物营养诊断，须要快速测定，则可进一步简化手续。称取1克剪碎的新鲜样品，置于20ml刻度试管中，加水5ml，在沸水浴中提取20min，冷却后加入1滴氯仿，加水定容至10ml，摇匀，静止澄清后即可吸取上清液进行含糖量测定，但一般材料中含糖量较高，必须将提取液稀释50100倍，方可进行测定。如果只需测定水溶性碳水化合物总量，则可用蒽酮或苯酚法，免去酸水解的步骤。二、水溶性碳水化合物的测定（一）蒽酮法糖在浓硫酸的作用下

19、，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，如：生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成兰绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖，而且可以测定所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣，加入反应液中，不然会因为细胞

20、壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。糖类与蒽酮反应生成的有色物质，在可见光区的吸收峰为630nm，故在此波长下进行比色。仪器与用具 分光光度计；水浴锅及水浴试管架；电炉；大试管（2.5×20cm），大试管架；刻度吸管5ml、1ml；记号笔；吸水纸适量。试剂 1蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g，溶于50ml乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中。在黑暗中可保存数星期，如有结晶析出，可微

21、热溶解。2浓硫酸（比重1.84）31%蔗糖标准液：将分析蔗糖在80下烘至恒重，精确称取1.000克，加少量水溶解，移入100ml容量瓶中，加入0.5ml浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。4100mg/L蔗糖标准液：精确吸取1%蔗糖标准液1ml加入100ml容量瓶中，加水至刻度。方法1标准曲线的制作 取大试管11支，从010分别编号，按表1-1加入100mg/L蔗糖溶液和水，配成从1015mg/L的系列标准液，除空白外，各浓度均重复二次。加完溶液后，按顺序向试管内加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸。浓硫酸要沿管壁缓缓加入，然后将试管轻摇一下，待醋酸乙酯水解后，再充分摇动试管数次（注意勿将硫酸

22、浅出），使液体混匀，立即放入沸水浴中准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其光密度，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。并求出标准曲线的直线的方程。表1-1各试管加入试剂量管 号01-23-45-67-89-10100mg/L蔗糖（ml）00.20.40.60.81.0水（ml）2.01.81.61.41.21.0蔗糖加入量（g）0204060801002样品测定：准确吸取样品提取液或水解液2ml于大试管中，2ml样品液中总含糖量应在20-100g之间，若超出此值，则应稀释样品液（或减少样品液用量，然后加水使液体总量达到2ml），以下步骤与标准曲

23、线测定相同。根据所测光密度查标准曲线，即可得出每ml样品液中碳水化合物总量。（二）苯酚法原理 苯酚法的测定原理与蒽酮法相同。糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糖醛，能与苯酚缩合成一种橙红色化合物。在10-100g范围内颜色的深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。与苯酚法相比，蒽酮比色法有许多缺点，蒽酮试剂较贵，而且蒽酮在硫酸中不稳定，也不能用于甲基化的糖和戊糖的测定。而苯酚比色法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的比色测定，方法简单，试剂便宜，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，因而简化了糖的提取程序，而且苯酚法产生的颜色稳定，可以稳定在1

24、60分钟以上。试剂190%苯酚溶液 称取90g苯酚，加蒸馏水10ml溶解，在室温下可保存数月。29%苯酚溶液 取3ml 90%苯酚溶液，加蒸馏水至30ml，现用现配。3浓硫酸其它试剂见蒽酮法。方法1标准曲线的制作 取大试管11支，从010分别编号，用100g/ml的蔗糖溶液，按表1-2配制一系列浓度的蔗糖溶液，每一浓度设两个重复。然后按顺序向试管内加入1ml 9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面在520秒时间内加入5ml浓硫酸，摇匀比色液总体积为8ml。在室温下放置30min显色，然后以空白为参比，在485nm波长下比色，测定光密度，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准线性方程

25、。表1-2各试管加入试剂量管 号01-23-45-67-89-10100ug/ml蔗糖液（ml）00.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）2.01.81.61.41.21.0蔗糖加入量（g）0204060801002样品的测定 取2ml样品提取液，加入20ml大试管中，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的含量，计算可溶性糖的酚含量。水溶性碳水化合物的测定程序：1配制试剂及标准蔗糖溶液。2制作标准曲线或建立直线回归方程。3植物样品中碳水化合物的提取与测定步骤： 称取磨碎烘干的小麦茎鞘材料200mg，2份 分别放入两支大试管中，加蒸馏水

26、1020ml于沸水中提取30分钟（提取2次） 提取液分别过滤入100ml容量瓶中，反复漂洗试管及残渣，定容至刻度 吸取5ml样品液加入50ml容量瓶中定容 全部残渣用2%HCl洗回原大试管中总体积20ml 吸取样品液2ml于大试管中（重复4次） 沸水中分解3h 两重复为一组，分别用苯酚法与蒽酮法 过滤于100ml容量瓶中，用蒸馏水漂 测定还原糖 洗残渣数次，于容量瓶中定容至刻度 计算单位糖含量（水溶性糖） 吸取5ml提取液加入50ml容量瓶中，定容 每份样品取2ml于大试管中（4次重复）， 每两重复为一组，分别用苯酚法及蒽酮法 测定还原糖 计算单位糖的含量（稀酸溶性糖） 三、还原糖的测定砷钼酸比色法 原理 硫酸铜在碱性条件下被还原糖还原成亚铜，加入砷钼酸溶液，亚铜将钼还原成低价氧化物钼兰，其确切成分尚未完全确定，而亚铜则被重新氧化。砷酸盐可使兰色加深，兰色深浅与还原糖的含量成正比，故可用分光光度计法测得还原糖含量。仪器与用具 分光光度计1台；100ml容量瓶2个；20ml刻度试管20支；水浴锅1个；电炉1个；水浴试管架1个；刻度吸管1ml 4支，2ml 1支。试剂1葡萄糖标准溶液 取分析纯葡萄糖于称量瓶中，在80下烘至恒重，放入干燥器中，冷却后称取0.1000g，先用少量蒸馏水溶解，转入100ml容量瓶