血清尿素测定参考方法

1、WS/T 3452011ICS 11.020C 50wsI中华人民共和卫生行业标准WS/T 3452011血清尿素测定参考方法Reference procedure of the measurement of urea in serum2011-09-30 发布2012-04-01 实施中华人民共和国卫生部发布目 次前言ID1范围12规范性引用文件13术语和缩略语14测定原理35测定样品36测定试剂36.1警示与安全注意事项 36.2试剂原料36.3试剂性能要求 36.4试剂制备46.5标准液的制备67测定条件77.1仪器77.2最终反应混合液的浓度107.3 血清尿索盹定条件117.4校准的

2、扩展不确定度118测定118.1无蛋白滤液的制备11& 2试剂准备12&3标准曲线制作128.4测定方法128.5测定范围138.6谋差的来源13& 7测定样品要求139结果计算139.1计算实际吸光度值139.2标准曲线的制作139.3样品测定结果的计真149.4单位换算14附录A （规范性附录）L谷氨酸脱氢酶催化活性浓度测定15附录B«范性附录）麻酶催化活性浓度测定 18WS/T 3452011本标准修改采用由国际检验医学溯源联合委员会(JCTLM)批准的CDC入血清尿累参考方法(分 光光度法”,并参考ISO 15193:2009(体外诊断器具生物源样品中

3、最的测定参考测定程序的表述 适当增加内容.本标准按照GB/T 1.1-2009给岀的规则起章本标准由卫生部临床检验标准专业委员会提出.本标准起草单位:卫生部临床检验中心.本标准主要起草人，杨振华、陈宝荣、邵燕、陈琦、孙慧颖胡滨。WS/T 3452011血清尿素测定参考方法1范围本标准规定了在临床医学应用中，测定血清尿素浓度的参考方法.本标准主要适用于参考实验室作为血清尿素测定的溯源，也可作为与血清尿素检验有关的仪貉和 试剂生产企业的潮源，可供有关认可单位及质量管理部门应用.2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件.凡是不注日期的

4、引用文件其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。ISO 15193-2:2009体外诊断器具生物源样本中量的测定参考方法的表述3术语和缩略语3.1术语下列术语和定义适用于本文件。3. 1. 1原始样本 primary sample最初从一个系统中取出的一个或几个部分的集合物，旨在提供该系统的信息或作为对该系统做岀 决定的基础注：在某些情况下所提供的信息可以适用于一个较大的系统或一组系统此时取样系统是这些聚统的组成部分. 3. 1.2实验室样本 laboratory sample准备送到实验室或实验室接收的用于测定的原始样本或原始样本的分样本.3. 1.3分析样本 analytical sam

5、ple自实验室样本制备的、可从中僉由分析部分的样本。注：在取岀分析祁分之前，分析样本可经过各种处理3. 1.4分析部分 analytical portion从分析样本中取岀的用于实际测定和观察的物质部分.注：如果不需E（处理，分析部分直接从原始样本或实验室样本中取出某些情况下，希将分析部分溶解成分析溶液 再上机甜定.3. 1.5分析溶液 analytical solution将分析部分溶解在气体、液体或固体中而制备的溶液，溶解过程中可以有反应发生或无反应发生。 3. 1.6（某一物质系统的）基质 matrix （of a material system）一个物质系统中除被分析物之外的所有成分W

6、S/T 34520T13. 1.7参考方法 reference procedure在校准或表征标准物质时为提供测定结果所采用的测定方法，适用于评定由同类童的其他测定方 法获得的彼测定董值的测定正确度。3. 1.8测定系统的灵敏度 sensitivity of a measuring system简称灵敏度(sensitivity)测定系统的示值变化除以相应的披测定值变化所得的商.注h测定系统的灵敏度可能与被测定的it值有关注2：所考虑的被测定值的变化必须大于罔定系貌的分辨力.3. 1.9分析特异性 analytical specificity测定方法只测定可测定的最的能力.3. 1. 10分析

7、干扰 analytical interference由一个影响輦引起的系统测定谋差，该彩坊量自身在测定系统中不产生信号，但它会引起示值的增 高或降低.3. L11影施:& influence quantity被测定以外的可影响测定结果的誥.3.1.12拟测定的量。注1:对被测定的说明要求了解量的种类以及含有该址的现象、物体或物质状态的描述包括有关成分及所涉及的 化学实体.注2,在VIM第二版和IEC 60050300:2001中彼曲定定义为受到渕定的注3：测定包括测定系统和实施测定的条件它可能会改变研究中的现象.物体或物质，使被测定的量可能不同于定 义的被澳定.在这种情况适当的修正是必

8、要的。3. 1. 13检出限 detection limit,limit of detection由给定测定方法获得的测得值，其声称的物质成分不存在的误判概率为d,声称物质成分存在的误 判概率为5注1：国际理论和应用化学联合会(IUPAC)推荐a和0的默认值为0.05.注2：有时使用第写词LOD.注3：不要用术语灵敏度”表示"检岀限J3. 1. 14 校准品 calibrator用于校准的测定标准.3.2缩略语下列缩略语适用于本文件.GLDH: L谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase)NADH：还原型 A烟酰胺腺嗥吟二核昔酸(|3-nicotinamide-a

9、denine-dinucleotide,reduced form)IFCC：国际临床化学与检验医学联合会(international federation of clinical chemistry and laboratory medicine)5SOP：标椎操作方法(Stmntiard Operation Eroecdurc), 4謂定原理尿索在隰酶催化下T水解生成氮和CO"亂在w酮戊二戢和胚原性辅酶存在下.腔睿熬醴脱氢酶繼化生成谷氨酸，同时还原性辅酶i被氧优成氧化型辅酶I 反应式如下1尿素+ HO吧NHJgOff-(NHJJC0J-2NHJ + C0iGLDHMH+a 駅戊二駿

10、+ NADH + fT 卷盘醸 + N启D'+HO在还原性辅酶I转牝成氧化型辅酶I同时伴有340 nm处吸光度的下降吸光度下降的桂度与样本中尿索含世成正比，酒定反应30 min后,nm St吸光度变优即可测定样本中尿素含童.5测宦样品标准物壓、校准品*质控品、血诸°6测定试剂6. 1 示与安全注意事项6. 1. 1氢筑化極；奇娄类物质，吸人及接触可引起中毒表现为恶心、臥吐、职循、腹洋，.脉缓、进行住肌 麻痹、心律紊乱、血钾明显降低等.接融髙温度溶灌可造成皮肤灼舫毒.称朵及配制试剂时应进行有效 阱护带防护跟镀、橡胶手套，穿隔离軽'6, 1.2硕酸锌：对眼睛有中度剌激性，

11、对皮肤无剌激性，谋服可引起急性胃肠炎，严重可引起林克至死 亡”称量及配制试剂时症进行有效防护，带防护眼擁、橡胶手套穿隔离脈.6.2试剂用料本方洙使用F列试剤.6.2.1氣双(4-轻基苯基卜LGHA异苯并相对分子质ft-318,33.6.2.2毓酸(ZnSOt7已0人相对分子质ft即5灵6. 2.3氢霍化锁BMOHh * &HIOL相对分子质最=31乩46.6, 2.4苔靈矇脱氢酶(glmam血dehydrog阳阴“GLDH),来源于牛肝脏，要求高纯度.6. 2,5 2”氨基瞥轻基-1,3 丙二醉(TripHClHN區CXCHOHh * HCDt 相对分子质4 = 157.60.6, 2

12、-6三寰甲基氨基甲烷(Tris-Base)rNH.CCCHzOH),t相对分子质S-12L14.鼠工7 ®<Ur«St),来源于川豆,晝求高城度.6. 2,8 r酮戊二醸fNaOCXXHKHUXXXJN#2H：Oh相对井子质卷，相对分子质量= 226,096.2.9 还原型A烟疏胺腺環吟二核昔酸二钠盐(NADHXQlH即N，N出0“比工H,O),相对分子曉 M-709.40.6.2,10乙二胺四乙醸二抽盐2H2O)T相对分子质量=3允丄4.6.Z11附二磷酸腺噪吟单钾盐(ADPHG°H“KI*Om匕2已0人相对分于质fi = 50L32 6.3试刑性能裏求6

13、. 3.1宜使用最高纯度的试剂.6. 3.2 GLDH：试剂纯度'70%,每毫克蛋白酶含fi20单位。6. 3. 3 Urease：试剂含就每克固体酶含址为（15 00050 000）单位.6. 3.4牛血清白蛋白五级，相对分子质1 = 68000.6.4试剂制备6. 4. 1试剂原料含试剂的原料纯度应为100%,如果试剂原料含fit小于100%例如，（）,按公式（1）计算实际W*. N 咒監（1）式中：W实耳实际称量；W毗理论称量,y 试剂原料纯度，注每次衣ft过程中的扩展不确定度（* = 2）（包括物质纯度的不确定度）应Vl5%.称蛀时显示的值与靶值的差异 不应）6过05%6. 4

14、.2试剂制备用水6.4.2. 1 纯水宜使尽高纯厦的水（导电性2 PS - cnT',pHA7,硅酸盐C. 1 mg：）制备试齐J.6. 4.2.2 无 CO2 水试剂水在敞口的容器中煮沸15 min,密闭冷却至使用前。64.2.3无氨水试剂水在敞口的容器中煮沸15 min,密闭冷却至使用前.6. 4.3血清尿素试剂6. 4. 3. 1 0.5%酚耿指示剂准确称取0.125 g酚駄，放入烧杯内，用20 mL 95%乙醉溶解后转移至25 mL容量瓶内，用95%乙 醇补足至刻度线.密闭玻璃瓶28保存.稳定1个月.6. 4. 3. 2 22g- L-' 的 ZnSQ 溶液准确称取22

15、 g ZnSO7H：O,放入烧杯内，用800 mL热的无CO：水（水温大于50 9）溶解后转移 至1 000 mL容量孫内，用无CO?水补足至刻度线.密闭玻璃瓶室温保存。稔定1个月.64.33饱和Ba（OH）2溶液准确称取80 g Ba（OH）, 8HZO,放人烧杯内用800 mL热的无CO,水（水温大于50 9溶解后 转移至1 000 mL容敌瓶内，用无CO?水补足至刻度线.需至少24 h后使用采用带有祓石灰帽的玻 璃瓶密闭室温保存，祓石灰帽中的饋石灰每两夭更换1次税定1个月.6434 0.11 mol L" Ba（OH）2 溶液6. 4. 3.4. 1用无CO,水稀释245 mL

16、饱和Ba（OH）,溶液f1 000 mL.密闭玻璃瓶室温保存，稳定1 d.WS/T 345-Z0116, < 3. 4. 2 0,11 mol L-'BaCOH 溶潘的检査方怯用中和漓定法检査谏溶秽的摩尔诫度* 在渭请干燥的烧杯中准确加人10 mL的ZnSO.需裁；在烧杯中如人2滴0. 5%的酚軌瘩液作为指示剂j准确吸取10 mL 0.11 mol * L Ba(OH)3帶槪进行滴定，至潢粉色为终点i结果判斷:如果消耗tbo!LBaCOHh溶液在10 mL±0.1 mL范圈内.说明配制的溶液符 合要求匚如果趋耗。.口 molL"1 BatOH)；帶液>1

17、工1 mL或V9, 9 mL,说明0. 11 mol - L-1 BaOHh溶液当屋谨度过髙或过低，应按公式佗计算补偿量：亠料X V吟丿击鼻黑 2*“*.£ )式中Jr祓度单位为摩尔毎升5川 L")*V休积单位为髦升(mL).6. 4. 3.5105 nunol 的 Tris-HCl准确称眾L654 8 g Trts-HCl,放人烧杯内，用SO mL无氨水洛解后转移至100 mL容量瓶内，用无 氨水补足至刻度线.便用电于天平、清沽干燥的烧杯、容輦瓶及称董杯配制.密闭试?Pifea r-sr保 存.穗定2周.氐 4h 3, 6105 mmol * L_1 Tris-Bas准确

18、称取L 272 0 g TriBase人烧杯内.用SO mL试剂水帮解后转移至100 mL容駐瓶内用试 刑水补足至刻度皱.密闭试剂瓶裸存n稳定戈周.6.4. 3. 7 溶范 2CpH7.筋 105 mmol < L" TriHCl 集冲液)ICO tnL的105 mmol L'1 Tris-HCl倒人烧杯内，用105 mmolf1 TEa玛共凋节pH值至九呂 密闭试刑瓶2匸咅弋保存.稳定2周+6. 4.3. 8310 mmol * L"的 TriHCl准确称取3. 309 6 g Tus-HCh放入烧杯内，用80 mL无氮水溶解后转移至100 mL容量瓶内用无

19、 甄水补足至剽度统.密闭试利瓶鏑亡保存.稳定2周"6. 4. 3.9 2T0 mmol LJ1 Tris-Base准确称取3” 309 g 白卜氐放入烧杯内,80 mb无氨本溶解百转移至100 mL容量瓶内，用无 氨水补足至剽度线*嘗闭试剂瓶31C肆存.稳定2周.6. 4, 3. 10 pH7.8,210 mmol ' L-1 Tris-HCl 3(冲潦100 mL 的 105 mmol L" TriHCl 倒入烧杯内*用 105 mmol L Tns-Base 调节 pH 值至7.肛 密闭试剂賊8 9保存争趙宦？周*6.4.3. 11 flftl准确称取1.06S

20、 2窖旷酹戊二酸和1. 172 5暂EDTA，故人烧杯内，用200 mL溶液2(105 mmol * r1 Tris-HCl冲液)溶解后转移至250 mL容量瓶内，用Tris-HCl缓冲淒补足至刻度线.密闭试剂删 匸 咅匸保存.穗定2周。#WS/T 34520116. 4.3. 12 溶液 3准确称取0. 789 6 g ADP,放人烧杯内用200 mL 105 mmol f1 Tris-HCl缓冲液溶解后转移至 250 mL容量瓶内，用Tris-HCl缓冲液补足至刻度线。密闭试剂瓶2P8P保存.穩定2周，6. 4.3. 13 溶液 4准确称取0.178 8 g NADH,放入烧杯内用200

21、mL 105 mmol Tris-HCl缓冲液溶解后转移 至250 mL容量瓶内，用Tris-HCl缓冲液补足至刻度线.密闭试剂瓶2 *C8 *C保存.稳定2周.6.4.3.14 0.2%牛血清白爱白溶液准确称取0.5g牛血清白蛋白，放入烧杯内，用200 mL无氨水溶解后转移至250 mL容最瓶内.用 无氨水补足至刻度线.密用试剂瓶2 8 *C保存.稳定2周.6 4.3.15 756 000 U f1 GLDH 溶液采用称歎法依据L-谷氨酸脱氢酶测定的含量获得总活性为37 800 U L谷氨酸脱氢酶，放入烧杯 内，用40 mL 0.2%牛血清白蛋白溶液溶解后转移至50 mL容量瓶内，用0.2%

22、牛血清白责白溶液补足 至刻度线.密闭试剂瓶2 P8 "C保存。稳定1周.6. 4. 3. 16100 800 U L-1 Urease 溶液采用祢量法依据脉酶演定的含量获得总活性为37 800 U脉瞬放入烧杯內后40 mL 0. 2%牛血清 白蛋白溶液溶解后转移至50 mL容最瓶内，用0. 2%牛血清白萤白溶液补足至刻度线，密闭试剂瓶 2C保存.稳定1周。6. 4. 3. 17空白试剂按以下步骤配制：准确移取等最的756 000 U - L'1 GLDH溶液及pH 7. 8,210 mmol L*1 Tris-HCl缓冲液进 行混合备用；准确移取10 mL溶液110 mL溶液

23、25 mL溶液42. 5 mL混合后的GLDH溶液及2.5 mL pH7. 8.105 mmol L1 Tris-HCl缓冲液，并进行混合制备为空白试剂.6.4.3.18反应试剂按以下步骤配制：准确移取等最的756 000 U- L-1 GLDH溶裁及pH7. 8,210 mmol L'1 Tris-HCl缓冲液，进 行混合备用；准确移取等量的100 800 U- L" Urease溶液及pH7. 8,210 mmol L"1 Tris-HCl缓冲液，进 行混合备用； 准确移取10 mL溶液110 ml溶液25 mL溶液42.5 mL混合后的GLDH溶液及2. 5

24、mL混合后的Urease溶液，并进行混合制备为反应试剂°6.5标准液的制备6. 5. 1尿素标准原液(100 mmol L")的配制准确称取0600 6 g SRM 912a标准物质，放入清洁干燥经过灭菌处理的烧杯内加入80 mL无氨 水进行溶解，溶解后转移至100 mL A级容量瓶中用无氨水多次冲洗烧杯将烧杯内的尿素溶液全部 转移至容量瓶，用无氨水补足密闭颇倒混匀至少10次，每一次颠倒后旋转倒置容最瓶10s配制完成 后进行分装，每15 mL 一份，放人带有螺旋盖的硼硅酸盐的瓶中，盖紧并标记，注明日期，保存在4匸或 一20匸如无污染，标准原液可以长期稳定.建议每6个月重新配

25、制.注1： SRM 912a的參址溟差应控制在土0.0002g以内.注2：尿素标准原液(100 mmol )的配制也可采用其他国际或国家标准物质.6.5.2工作标准液的配制将尿素标准原液和无氨水在室温平衡30 miru按表I配制工作标准液.衰1工作标准液配制方法原液mL无氨水 mL用无氨水稀释的最终体枳 mLJR终尿索诳度 mmol L"1010. 001000. 509. 50105.001.009.001010.001.25& 751012. 501.50& 501015.001.758.2510- - !17. 502.008.00. - -10I-J20.00

26、3. 007. 001030. 00配制好的工作标准液应贮存于聚乙烯螺旋帕瓶中、4 X：稳定期不超过1个月 注：工作标准浪JC存瓶必须清洁干操且紐过无菌化处理.7测定条件 7. 1仪器 7.1.1紫外可见分光光度计 7. 1. 1. 1环境条件温度：5 *C35 湿度：45%85%,避光，不能直接放在风口，防震.外围禁放热源,放置场所周围 不能有大容氏变压器等强厳场,周围环境宜清洁无尘，电压稳定，避免共用电源设备的频繁开关.应有 接地线接地电阻大于100 Q,仪器两侧各应有大于20 cm空间.7. 1.1.2数据测定范围ARS 一3.0003.000 或 00%T2000%T.7. 1.1.3

27、测定模式ABS；T(%);Conce7. 1.1.4技术指标应符合下列要求：波长：190 nm1 100 nm；波长准确度:±0.2nm；波长重现性:±0.1 nm；吸光度准确性:土 （0. 0020004） > 吸光度贡现性：士（00010.002）;噪声：W0. 000 2 Abs：基线稳定性:W0000 3 Abs/h；基线平稳度：±0. 001 Aj光谱带宽:Cl.Snm,光学精度：土0. 005 A；杂散光:WO. 05%T°7.1.1. 5狡准情况每年至少进行一次校准;大型实验的应进行校准.7.1.2点式温度计7. 1.2. 1环境条件

28、温度0弋100匸，湿度V90%。7. 1.2.2数据测定范围op loo r.7. 1.2.3测定模式摄氏度（匸）7. 1.2.4技术指标应符合下列要求：“分辨率：o. 001 *c）准确度：土 0.01 ；重复性：土0. 005匸丿解析度：土 0.000 17. 1.2.5校准情况每年至少进行一次校准;大型实验前应进行校准。7.1.3 pH 计7.1.3.1环境条绊温度5 U45 9,湿度5%85%.7. 1.3.2基本性能待征应符合下列要求：pH 范围：-1.00014.000；pH 分辨率：0 002/0.01；准确度：士0. 002,斜率：80%120%；温度范围：一5匸105：温度分

29、辨率，士0.397. 1.3.3校准情况7. 1.3. 3. 1 pH标准缓冲液的选择与便用应符合以下要求：应使用至少两种标准缓冲液进行校准，标准缓冲液应包含PH6pH8的范围，即应包含需调 整的测定试剂的pH值；pH标椎缓冲液的不确定度应=001 pH；所用标准缓冲液应能溯源至国际或国家参考物质.7. 1.3. 3.2 pH 计校准按标准物质证书制备pH标准缓冲液:将pH标准溶裁温度调整至25匸,按pH计使用说明书进行 校准.7.1.4电子分析天平7. 1.4. 1环境条件温度5 35 湿度45%85%.7. 1.4.2技术指标应符合下列要求：准确度级别：特种准确度级；最大允许误差:

30、7;0. 000 6 g,7. 1.4.3校准情况每年一次进行校准;必要时可增加校准.7.1.5电子天平7.1.5.1环境条件温度5 P35 9,哉度45%85%。7. 1.5.2技术指标应符合下列耍求：准确度级别：高准确度级）9WS/T 3452011最大允许谋差：±0.05 g.7. 1.5.3校准情况每年至少进行一次校准;大型实验前应进行校准。7.1.6加样器7.1.6. 1技术指标应符合下列要求：容量允许误差:JJG 646-2006计最性能标准；测定重复性:JJG 646-2006计量性能标准.7. 1.6.2校准悄况每三个月进行一次校准;实验前应进行校准.7.1.7容瓶7

31、. 1.7. 1技术指标应符合下列要求：材质、外观、结构、密合性:JJG 196-2006通用技术标准;容蜃允许渓差:JJG 196-2006计量性能标准.7. 1.7.2校准情况实验前进行校准.7.2最终反应混合液的浓度7.2.1血清尿素最终完全反应混合液（空白液）的浓度见表2.表2血清尿素量终完全反应混合液（空白液）的浓度参数指标Tris100 mmol L*1pH(30r)7.8 土 0 05sGLDH30 000 U L (500 pkat L"1)a 期戊二酸6 mmol L"1EDTA4 mmol L"1ADP2 mmol L-1NADH0. 2 mm

32、ol L"1样品与反应混合协体枳比0.05(1 > 20)a扩展不确定度4=2）.WS/T 34520117. 2.2血清尿素最终完全反应混合液（反应液）的浓度见表3.« 3血清尿素最终完全反应混合液（反应液）的浓度参数指标Tris100 mmol L*1pH（3OX：）7.8 士 005GLDH30 000 U L"1 （500 pkat L'1）銅戊二酸6 mmol L*1EDTA4 mmol L*"1ADP2 mmol L"1NADH0. 2 mmol L"1Uressc4 000UL（66“lutL样品与反应混合

33、物体积比0.05（1，20）4扩展不确定S（* = 2）t7.3血清尿素测定条件 见表4.表4血清尿素测定条件畚数18 标温度3o.or±i c波长339 nm土 1 nm1带宽0 nm光径10. 00 mm±0. 01 mma屛育时间30 min测定时何孵育后立即测定1扩展不确定度（* = 2）e7.4校准的扩展不确定度如果校准的扩展不确定度等于或小于原参考测定程序中规定的该参数允许范围且校准的不确定 度范围重叠于規定的允许区间，则温度、pH、光径和波长的参数遵从规定允许范圈.8测定 8.1无爱白涯液的制备按表5所列顺序和量，将试刑和工作标准液/样品加入离心管中。11WS

34、/T 3452011表5无爱白建液的制备步肆Ba(OH)：(0.11 mol> L-1)5.0 mL工作标准液/样岳0. 5 mL充分混匀5 s10肌立即加入ZnSOiZnSO<5.0 mL剧烈振荡10$充分混匀立即按1 000g min-1离心10 min,离心后上清液即为工作标准液/样品的无蛋白滤液.8.2试剂准备测定前，将足世的空白试剂、反应试剂和样本（无蛋白滤液）在30 *C下平術20 min.其余空白试剂 和反应试剂应贮存于2弋88.3标准曲线制作8. 3. 1工作标准液逵液吸光度的测定按表6所列顺序和量将工作标准液无蛋白滤液和试剂进行混合孵育后加入比色杯表6工作标准液吸

35、光度测定步骤试剂/样吕反应管空白管空白试刑5.0mL0 mL反应试剂0 mL5.0 mL工作标准液无蛋白滤液0.25 mL0. 25 mL轻轻倒混匀样育30 min孵育结束后轻轻戲倒混匀，将各管液体依次倒入比色扶内约3 mL.340 nm处灣定 吸光度.8.3.2制备标准曲线工作标准液的吸光度值经过空白校正后，得到实际吸光度值.将实际吸光度值按最小二乘法计算, 制作标准曲线。比较每个浓度标准的实际测定浓度与它的理论浓度差值，按下列标准进行判断：工作标准液浓度在0 mmolLT17. 5 mmol -范围内，则|实际测定浓度一理论浓度|应W0. 5 mmol L"1 ；工作标准液浓度1

36、7. 5 mmol L"1，则丨实际测定浓度一理论浓度|应=1.0 mmol L"1 8个浓度16个工作标准液实际浓度与理论诳度之差最多有3个不在范围内.如果超出以上要求，则标准曲线无效,需重新制备。& 4 團定方法按表7所列顺序和最，将试剂和样品进行混合孵育后加入比色杯°WS/T 3452011«7血清尿素测定步鼻试剂/荐品反应管空白管空白试剂.5.0 mL0 mL反应试剂0 mL5.0 mL样品无贵白滤液0. 25 mL0. 25 mL轻轻倾倒混匀，孵育30 min.卿育结束后轻轻取倒混匀将各管液体依次倒入比色杯内约3 rnL340 nm处测

37、定 吸光度注：应使用符合测定性能的分光光度计和高准确度容诞设备分光光度渕定的不确定度和样品体积的不确定度宜用已知标凌不确定度的测定程序确定；分光光度测定的吸光度扩展不确定度(* = 2)不应超过1%,样品体积部分的!T展不确定度(*=2)应该1%.8.5测定范围血清尿責测定参考方法的线性为0 mmol -30 mmol f1.8.6误差的来源8.6.1测定过程中器材和去离子水等如果受到気离子的污染，干扰血清只索的漫定弓：起结果版亡 偏髙。8.6.2高诙度載化物会抑制尿素酸，引起血清尿素测定结果假性偏低.8.6.3溶血(血红蛋白含址10 gL-).黄疸(胆红素含最1 mmol干扰本注测定结果影响

38、 大于2%&7测定样品要求& 7. 1校准品、质控品、标准物质应严格按照运输条件和贮存条件运输和保存.8. 7. 2静脉采血应空腹10 h14 h,采血3 mL,室温2 h内离心分离血清，厲心速度3 000 r mirT：,离 心时间10 min.9结果计算9.1计算实际吸光度值每份样本的测定包括样本吸光度值和空白吸光度值，经过空白校正的吸光度值为实际吸光度值，按 实际吸光度值=测定吸光度值一空白吸光度值.9.2标准曲坡的制作用最小二乘法获得标准曲线斜率&和截距a,每个单独的吸光度作为非独立变异丙索给出，浓发作 为独立因素使用16个吸光度值和16个浓度用于8组数据分析.

39、设定倍增系«(F) = l/6»校正因数(C)=a/fr16个标准液的毎一个实际测定浓度按公式(3)计算：«««取 X F C( 3 )式中：标桂液实际测定浓度，单位为亳克每分升(mgdL-J；标准液实际吸光度值；F倍增系数，等于1/6；C校正因数，等于a/九9.3样品測定结果的计算标准曲线符合通过标准后，按公式(4)计算样品浓度： c*g=A“xF C( 4式中：5一样品测定结果，单位为毫摩尔(mmolL-1);A “ 一样品实际吸光度值；F倍增系数，等于1/如C校正因数，等于a/b.9.4单位换算以mgdL单位表示的血清尿素浓度可通过乘以系

40、数(/=0.167)转化成mmolL'1#WS/T 3452011Ptt ft A （舰范性附录） 氢酶催优话性液度测定A. 1藏定试剤A. 1. 1补克试拥原料aCNHcCl）.相对分子质量= 53M9tA. 1.2试剂制备A, L2. 1125 mmol L '的 Tris*HCl淮确称取1.970g Tris-HCLSt人烧杯內，用SOmL无氨水溶解后转移至NO eiL容屋瓶内*用无輕 水补足至刻度线.密闭试J2X：-8TC保存。稳定2周，A, 1. 2+ 2125 mntol * I.'1 Tris-Base推确諫取1. 514 3 e TrBase.放入烧杯内

41、，斥抑rrX试剂水常解后转移至100代匸容量擬内+用试 削水补足至刻度线密席讫剂瓶2匸呂弋保存。卷定2周.A, 1.2. 3 pH7. B.125 mmol * L_1 Tris-HCJ 缓冲液100 mb的125 mmol * L 1 Tris-HCl倒人烧挤内，用125 mmol鸵调节pH值至7. S. 密厨试捌瓶2 P8 X：保存.稳定2周.A. 1.2.4溶覆血准确称战 HO罰 Eg 沪酶戊二 .O.OOS 9g NADH,O. 093 1 g EDTA .0,062 7 g ADP 別用 5 tnL pH 7. 8J25 mmol * f1 Tris-HCl緩冲菠溶解后转碁至50 m

42、L容量瓶中用Tris-HCl缓冲液充分冲状 烧杯，使瘩解廉分全部转體至容量瓶中'用TriHCl 冲液补足至刻度线.密闭试剂瓶2 TC-8 U棵 存，穩定3血A. LZ5反应试刑准确称取0.334 3呂NH.CI,用榕液A充分溶解后转移至2S ruL容量瓶中*用溶液A充分冲抚烧 杯*使涪解成龙全部转程至容童瓶中，用溶臧a补足至刻度线.密闭试刑战ar-e*C裸存*穂定2山A, L2,6 31 500 U L" GLDH 容港采用称量密嵌据谷氨酸脱氢酵厂家声明的含录获得总活性为63L1 L-谷氨酸脱氢酶，放人烧杯 内，用2mL 0.2牛血清直蚤白酵液完全溶解.密闭试剂婕29=8 保

43、存.穗定1止A.L2.7 "谷氯醴脱赛*的輛释便用前进行示例扎1.2.M 在2,8mL 0,2%牛血湾白蛋白溶液中加入広ImL i谷畫酸脱氢醐原液充分馄匀.第一5 步的稀释比刮是1 28*A.L2.7.2 将步驟扎L2.7. 1中的0. 1 mb最蝇協蔽加入到2. S mL 125 mmol - f0, 2血清白ISWS/T 3452011蛋白溶液中，充分混匀.第二步的稀释比例是1 « 28.第一步和第二步总稀释比例是1 « 841.A. 2测定条件A.2. 1最终反应混合液的浓度见表A.I.* A. 1 L谷氨酸脱氢議催化活性浓度测定最终反应混合液的浓度参数指标

44、TriS100 mmol L"1pH(30r)78±C 05*a 酮戊二酸6 mmol L-1EDTA4 mmol L-1ADP2 mmol L*1NADH0. 2 mmol L_,NH<C12C0 mmol L"1样品与反应混合初体积比0.20(1 » 5)a扩履不确定度（*=2）.A. 2.2 "谷氨酸脱氢爾催化活性浓度漠定条件见表A.2.表A.2厶谷氨酸脱氢酶催化活性浓度测定条件# ft指标温度30.0匸±02波长339 nm 士 1 nma带宽W2 nm光径10. 00 mm±0. 01 mme再育时间90 s

45、测定时何连续监测孵角后120 s3扩展不确定度* = 2）eA.3测定A. 3.1试剂准备将5 mL反应试剂、06 mL L谷氨酸脱氢酶稀释液和0. 6 mL生理盐水放在30匸土0. 2 的水浴 箱中大约10 min使液体达到预定温度。#WS/T 3452011A. 3. 2测定方法按表A. 3的顺序和扯将试剂和样品加入比色杯表A3谷氨酸脫氢S|稀释液催化活性浓度测定步鼻反应液2.000 mL平衡到30 I：步鼻A. 1. 2. 7. 2 1 谷氨酸脱氢穂溶液0. 500 mL充分混匀，孵育90再连续120 s的吸光度.A. 3.3试剂空白采用9 gL-J(154 mmol)氯化钠溶液代祥L-

46、谷氨酸脱氢酶溶液浪定试剂空白，按上述步骤 进行操作.A.4结果计算通过回归分析(最小二集法)计算吸光度随时间的改变减去试剂空白率后即GLDH储存液稀释液的吸光度变化率。按公式(A. 1)计箕储存酹溶液中GLDH催化活性浓厦：GLDH ftoa = FX Fammi X (AA/AX)gldh (A. 1 )注：此公式仅适用于按上述方法稀释与澳定L谷氨酸脱氢SI催化活性浓度.式中：GLDHgh 祥原液中谷氨酸脱氢酶催化活性浓度单位为微凯塔尔毎升Ska: L-J或单 位每升(U* f1)；注*单位pkat L"除以1 000可得mkat L"1,单位U L"1除以1

47、000可得kU L"1.F系数，尊于 794(在 339 nm 波长测定(NADH) = 630 m: mor1 为 IFCC 与IRMM推荐卄F GLDH储存液的稀释因子.A.1.2.7中为84"(AA/AOcg测定样品的实际吸光度变化率，单位为每秒Q7)或每分(mini)。WS/T 3452011规范性附录）豚酶催化活性浓度测定B1测定试刑B. t 1试剂制备B, L 1. 1125 mmol 的 Tris-HCl准确称取L 970fiTrHCl,放人烧杯内，用帥mL无毎水落解厉转移至100tnL睜量瓶内，用无輒 水补足至刻度线.密闭试剂瓶2它ET?保存*稳定2周.B+

48、 1+ 1. 2125 mmol * L_, Tris-Base准确称取1. 5U 3 g Tris-Base人烧杯内用80 mb试剂水溶解后转移至100 mL容氏瓶内，用试 剂水补足至刻度线.茗闭试剂瓶2弋8弋保存.稳定2周.B. 1. L3 pH7. 8 J25 mmol I/1 Tris-HCI ij 冲懑100 mL的1药mmolL_1 Trts-HCi倒人烧杯内周125molLc Tris-Base間节pH值至匸 密闭试剂瓶ar-er保存.種宦2周.B.1.1.4 落酒 B准确称取 0, OS4 S 呂“酮戊二議 *0, 008 9 g NADH.O, 093 1 g EDTA.O.