肿瘤血管生成抑制剂筛选模型的研究进展

1、肿瘤血管生成抑制剂筛选模型的研究进展葛 慧，张洪泉（扬州大学医药研究所药理研究室，扬州225001）摘要 目的：介绍肿瘤血管生成抑制剂（tumor angiogenesis inhibitor，TAl）筛选模型的研究进展。方法：查阅国内外相关文献进行分析和归纳。结果：TAI的筛选主要依赖于采用形态学检测法测定血管的生成活性。TAI筛选的程序为：体外筛选体内筛选应用肿瘤模型进行全面最终的评价。结论：TAI对于肿瘤治疗有重要作用，其筛选模型的研究取得突破性进展。关键词 血管生成抑制剂；药物筛选试验，抗肿瘤；综述中图分类号 R 965.1 文献标识码 A 文章编号 1671-2838（2005）04

2、-0381-04Advances in research on screening modelS OftUmot angiOgenesiS inhibitorsGE Hui，ZHANG Hong-Quan（Department OfPharmacology，Institute OfMedlclne and Pharmacy，Yangzhou University，Yangzhou 225001，China）ABSTRACT Objective：TO review advances in research on tumor angiogenesis inhibitors（TAl） Methods

3、：The domestic and foreign relevant literature was sunnnarized and analysedResults：The methods fOr screening TAl were mainly deterlnining the angio-genesis activityThe morphology assay was adopted tO measure the angiogenesis activityThe procedures were screening in vitroscreening in vivousing tumormo

4、dels tO carry out overall and final appraisal.Conclusion：TAI has important effects On cancerthera-pyThe studies Ofscreening mOdels OfTAI have already got breakthroughKEYWORDS angiogenesis inhibltors；drugscreeningassay，antitunior；reviewPharm Care & Res，2005，5（4）：381-384肿瘤血管生成抑制剂（tumor angiogenesi

5、s inhibi-tor，TAl）能抑制血管生成，阻止肿瘤生长和转移。TAT治疗肿瘤具有副作用小、不易产生耐药性等优点。近年来这类药物的研究已取得突破性进展，可望进入临床成为一类崭新的、有希望的抗肿瘤药物。本文就目前常用的TAI筛选模型作一简要介绍。1、肿瘤发展依赖血管生成的机制1971年Folkman在新英格兰医学杂志（N Engl J Med）上首次提出肿瘤生长依赖血管形成的概念：当肿瘤直径超过2mm时，直接由微环境提供的营养就不能满足其生长需要，此时肿瘤的生长依赖于新生血管运送营养物质。新血管的生成是一个多步骤的、受多因素调控的复杂过程，这一过程包括：促血管生成因子的分泌、血管内皮基底膜

6、的降解、内皮细胞的迁移与增殖、新的血管环与基底膜的形成。目前专家认为血管生成是正性和负性调节因子共同作用的结果，已发现的正负调节因子有60余种。正性调节因子有：碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、血管生成素等。它们可以直接刺激血管内皮细胞的生长，或通过促使宿主细胞释放有关生长因子来刺激血管内皮细胞的增生。血管内皮细胞受刺激后基底膜降解，内皮细胞数增多，浸润到血管周围基质，降解细胞外间质并向血管生成因子产生的方向移动，在肿瘤组织内形成新的血管。负性调节因子包括天然的和合成的两大类，宿主细胞产生的天然因子有：血管抑制素、内皮抑制

7、素、生长抑素等。化学合成的有：基质金属蛋白酶抑制剂、黏附分子的拮抗剂、烟曲霉素及其衍生物TNP-470等。它们的功能是抑制内皮细胞的增殖、游走、基底膜的降解以及基底膜与生长因子结合等。正常情况下正负因子的调节保持动态平衡关系，一旦失衡则导致新血管的生成，此即血管形成的开关平衡假说。2、肿瘤血管生成活性的检测TAI的筛选主要依赖于血管生成活性的检测。为了对大量TAI进行快速、高效、低成本、微量化的筛选，必须采用高灵敏的检测系统和数据采集处理系统。在此简单介绍几种常用的检测方法。2.1 形态学检测法 将肿瘤组织移植到鸡胚绒毛尿囊膜（chick chorioallantoic membrane）、仓

8、鼠颊窝、兔耳等部位，在显微镜下观察肿瘤组织诱导血管生成的情况，计数微血管密度最高的区域即“热点”区的血管数，也可用电镜观察肿瘤结节内及邻近组织中的微血管结构和毛细血管超微结构。2.2 免疫学检测 用凝血因子、CD31等来标记内皮细胞，通过检测标记物浓度可检测血管生成活性。新近采用一种近红外（near infrare，NIR）荧光探针（Cv5.5）标记内皮细胞，选择“热点”区域，计数或采用计算机图像分析系统，对血管生成进行定量分析，并能选择性地定位肿瘤组织。2.3 影像学检测 彩色多普勒超声可全面反映肿瘤血流情况，包括血流速度、方向，是否为层流或湍流等特征，但此法对血管生成的定量分析效果较差。3

9、、血管生成抑制剂的筛选筛选的程序一般先经分子、细胞水平的体外筛选，再经组织、器官水平的体内筛选，最后应用肿瘤模型进行全面最终的评价。体外筛选操作较简单，容易控制。体内筛选的优点是实验条件比较接近药物在人体内使用的环境。3.1 体外筛选3.1.1 血管内皮细胞模型 血管内皮细胞是进行TAI筛选的主要的细胞模型，国际上现在采用较多。如人脐静脉血管内皮细胞ECV304。该模型的主要检测指标有：细胞增殖率（可通过2.1所述的形态学方法检测）与药物促进内皮细胞形成管腔的能力。血管生成过程中内皮细胞会形成细胞条索，然后形成管状，体外培养的血管内皮细胞在特定条件下也可以形成细胞条索状。在含有TAI药物和不含

10、有TAI药物的胶原凝胶中分别培养内皮细胞4d后，在显微镜下比较它们形成的管腔数目，可用来评定TAI对新生血管的抑制作用。最近国外有学者将人类的端粒酶催化蛋白（hTERT）的基因导入内皮细胞，使其永生化，形成的新细胞株被命名为HMVEC，它不仅保留了原代内皮细胞（HMEC-1）的固有特征，且避免了用HMEC-1作为体外筛选模型时可能出现的原有血管的干扰现象，并且对VEGF的抑制作用特异性很高，有希望成为理想的体外模型。3.1.2 血管生成因子模型 血管生成因子的检测研究较多的是VEGF和bFGF。选择血管生成因子高表达的实体瘤细胞株体外培养，加入待检物质作用?4h后，应用免疫酶标法、同位素标记法

11、等检测血管生成因子含数。通过待检物质是否影响肿瘤细血管生成。3.1.3 高通量筛选模型（high throughput screening，HTS）近年来肿瘤新生血管相关基因组的研究为TAI的筛选提供了新靶点，从而有条件进行针对特定基因型药物的研发。基因重组是近年来发展起来的一项新技术，可使用基因重组技术制备与肿瘤血管生成密切相关的受体，如VEGF受体、bFGF受体等，建立TAI的HTS模型。重组受体具有纯度高、制备量大、成本低等优点，因此使用基因重组进行药物筛选具有广阔的前景。3. 2 体内筛选 TAI的筛选，必须建立组织、器官水平的体内模型，经这些模型评价有效后，才能进入下一阶段的研究。近

12、年来常采用的体内模型有：鸡胚绒毛尿囊膜模型、鼠耳模型、基质胶塞模型（matri-gel plug）、啮齿动物的角膜微囊（microdocket corne-。）模型等。建立这些模型都是为了寻找无血管区域或原血管能明显与新生血管相区别的区域进行TAI的筛选。3.2.1 鸡胚绒毛尿囊膜模型 鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成早期，机体免疫系统尚未完全建立，因此鸡胚绒毛尿囊膜对各种异物几乎不发生排斥反应，便于将含有TAI的载体置于其表面，观察TAI对血管生成的影响。Bernardini等建立了一种鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的定量分析法：将鸡胚胎放在直径100mm无菌的玻璃平皿内，加入5mL培养液，在无菌恒温箱中孵

13、育到第9天的生长高峰时，将浸泡过TAI的明胶海绵置于鸡胚绒毛尿囊膜表面。由两个实验人员同时在250倍显微镜下随机取6个视野，记数“热点”区的新生血管数，计算平均值。3.2.2 鼠耳模型 李凌等利用绿色荧光蛋白（GFP）基因标记膀胱癌细胞BTT739株，把含有1×1031×104个标记后的癌细胞悬液接种于半透明的鼠耳皮下，借助荧光显微镜及血管造影观察肿瘤生长所造成的局部血管改变和新血管的生成情况。通常于接种后立即观察并摄像记录肿瘤细胞的数量和分布，此后每天或隔天麻醉小鼠后用荧光显微镜观察耳部血管改变，发现接种3-4d时肿瘤细胞附近的小血管和毛细血管管腔扩张和弯曲最为明显，5-

14、10d后可见血管出芽及新生血管形成。连续血管造影可显示血管生成的动态变化过程，此时注射TAT于鼠耳下，观察其对血管新生的抑制作用。此模型操作简便，且对动物损伤较小，并能反映TAI抑制肿瘤新血管生成的实际过程。3.2.3 基质胶塞模型 此模型被广泛用于评价生长因子的促血管新生能力，如VEGF。基质胶在4的时候是液态，37时能够形成固体凝胶。把0.5ml的基质胶与生长因子混合后注射到荷瘤小鼠腹部皮下组织，在小鼠体温的条件下基质胶很快形成固体凝胶。4-5d后相邻组织新生血管出芽，生长因子缓慢释放渗入组织中；7-10d后处死小鼠，取出基质胶塞进行10%甲醛固定、石蜡包埋、切片染色、组织学检查，图像分析

15、塞内的总血管面积，可以对血管生成进行定量分析，以评价TAT疗效。3.2.4 角膜微囊模型 此模型多采用啮齿动物如兔、鼠的角膜，与TAT的其他体内模型相比，用角膜微囊时对动物的操作更简便，由于角膜本身无血管，因此只要观察到血管进入角膜即可认为是新血管生成，可以避免其他模型中原有血管干扰的影响。尤其是用兔角膜可直观监测肿瘤血管生成和炎性反应的过程。重组生长因子、细胞悬液或组织标本加入TAI后制成可缓慢释放的小丸置入微囊，Bernardini等将体重为2-3kg的健康新西兰白兔麻醉后，在离角膜边缘2.5-3mm处用虹膜刀植入3mm×1.5mm×3mm微囊，3-4d后血管丛边缘出芽

16、，7-10d内新生毛细血管进入微囊。通过计数囊内新生毛细血管数和生长率可评价TAT对血管新生的抑制作用。3.3 肿瘤模型 肿瘤模型是用来检测药物的抗血管生成和抗肿瘤作用的最终模型，前者以小鼠Lewis肺癌、黑素瘤B16为主，后者最常用的是裸小鼠异种移植模型：把肿瘤细胞接种到裸小鼠皮下，给药期间测量肿瘤的三维直径，同时还可测定肿瘤组织中的血管密度，电镜观察血管内皮细胞的状态，检测体液中血管生成因子及其受体的表达量来判定该物质抑制体内血管生成的能力。4、讨 论抑制肿瘤血管生成已被公认为一种崭新的抗癌手段。随着TAI研究开发的深入，新的药物将不断涌现并逐步从实验室走向临床，为抑制肿瘤的增殖、预防肿瘤的转移和复发，提高患者的生存质量起到重要的作用。目前，TAI的研究中仍有许多值得关注、亟待解决的问题，如：TAI作用的具体的分子机制还不十分清楚；TAI不仅抑制肿瘤血管生成，长期使用有可能会影响正常情况下如伤口愈合期、女性月经期和妊娠期的血管生成；且TAI只是抑制肿瘤的生长，不能彻底杀死肿瘤细胞，停药后肿瘤即可恢复生长。因此，必须将它与放疗、化疗及介入疗法等相结合，以达到最佳的治疗效果。近年来，发现许多中药的有效成分能抑制肿瘤血管生成，促进肿瘤细胞凋亡，如：姜黄素、雷公藤红素、