国家自然科学基金2

1、项目类别投送学科代码1科 学 部 编 号CC03031102国家自然科学基金申 请 书项目名称：口腔癌肺高转移相关抗原基因的筛选及其核酸疫苗的研究申 请 者：所在单位：邮政编码：通讯地址：电 话：传 真：申请日期：国 家 自 然 科 学 基 金 委 员 会 19 填 报 说 明一、填写申请书前，请先查阅国家自然科学基金有关项目申请办法及规定。申请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。表达要明确、严谨，字迹要清晰易辨。外来语要同时用原文和中文表达。第一次出现的缩写词，须注出全称。二、申请书为十六开本，复印时用B5复印纸，于左侧装订成册。第三页起各栏空格不够时，请自行加页。一式六份（至少一份为原件

2、），由所在单位审查签署意见后，按申报学科投送国家自然科学基金委员会对口科学部。地区科学基金项目，申请书另报送省（自治区）科委一份原件。三、封面上右上角“科学部编号”由对口科学部填写，项目类别和申报学科代码1由申请者填写。四、申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请（含参加）的项目数，连同在研的国家自然科学基金项目数(不含重点项目、重大项目)，不得超过两项。五、 同一申请者研究内容相近的项目，只允许报送一个科学部。六、 申请者可因同类项目竞争等原因,提出不宜评议本项目的专家名单（姓名与单位，3人以内）,附另页于申请书原件中，供科学部选择同行评议人时参考。科学部将对此信息保密。七、 国家

3、自然科学基金委员会通信地址:北京海淀区花园北路35号东门 邮政编码：100083一、简表名中文口腔癌肺高转移相关抗原基因的筛选及其核酸疫苗的研究研称英文 Screen and nucleic acid immunization of lung highly metastatic related antigen gene in oral cancer ccancercancer究类别 A. 自由申请 B. 高技术探索 C. 青年 D. 地区 E 重大 F. 重点 H. 专项 AAAC 高技术探索 项目主题号项申报名称1口 腔 颌 面 外 科 学名称2A. 基础研究目学科代码1C03031102代

4、码2B. 应用基础B申请金额所用实验室姓中文名拼音申请专业技术职务名称代码所名称者在单性 质位所在地总人数6主姓 名签 字项要何荣根成陈万涛邓永强目员林李嵩周晓健组不含申研究内容和意义摘要采用生物芯片技术,对人腺样囊性癌的肺低转移细胞系及其高转移克隆株进行大规模的基因表达定量对比分析,筛选鉴定肺高转移相关抗原基因,设计构建同源的核酸疫苗,建立动物模型,运用分子外科转基因技术将核酸疫苗导入动物模型中,分析其抗肿瘤免疫效果,进一步阐明恶性肿瘤的肺转移机理,寻找新的有效靶位点,为防治癌转移提供新方法。主题词1.主题词数量不多于3个；2.主题词之间空一格（英文用/分隔）中文肿瘤转移基因英文 tumor

5、 / metastasis / gene简 表 填 写 要 求一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码以最新发布的国家自然科学基金申请项目分类目录及代码为准填写。高技术探索课题主题号按高技术新概念新构思课题项目指南中主题号填写，申请其重点项目时项目类别也填写B，并在申请书封面右上角加注“高技术探索课题重点项目”。二、凡选择性栏目,将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。三、部分栏目填写要求：项目名称应确切反映研究内容和范围,最多不能超过25个汉字(包括标点符号)。基础研究指以认识自然现象、探索自然规律为目的的,不直接考虑应用目标的研究活动。应用基

6、础研究指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。报审学科申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个,先填为主学科。申请金额以万元为单位,用阿拉伯数字表示,注意小数点。起止年月起始时间从申请的次年的1月算起。完成时间为完成年度的12月。所用的实验室系指研究项目将利用的实验室,仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的开放实验室。所在单位名称及代码按单位公章填写全称。例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填写“中科院西安光机所”或“西安光机所”。全称中的数字,一律写中文，例如：航空航天工业部七O一研究所。 首次申请国家自然科学基金的单位,尚未编入单位代码,其

7、代码暂不填。参加单位数指研究项目组成员所在单位数,包括主持单位和合作单位,以阿拉伯数字表示。项目组主要成员指在项目组内对学术思想、技术路线的制定与理论分析及对项目的完成起主要作用的人员。本栏双线右侧内容不输入计算机。研究内容和意义摘要与主题词均录入软盘。二、立论依据(包括项目的研究意义、国内外研究现状分析,并附主要的参考文献及出处)对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合科学前沿，围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用前景。 项目的科学意义 恶性肿瘤肺转移的防治是临床上进一步提高患者生存率和治愈率的关键所在，具备肺转移潜能的癌细胞亚群是肿瘤

8、组织与宿主组织之间长期相互作用、相互选择的结果,在此过程中,这些癌细胞亚群产生了不同于其它亚群的特点,包括转移相关基因及由其所决定的细胞和群体水平的特点,其中，肺高转移相关抗原基因是一个相当重要的方面1，因而，筛选和鉴定肺高转移相关抗原基因，有助于深入理解和阐明肺转移的机制。在此基础上，设计和构建有效的核酸疫苗，发展紧密结合临床实际的转染方法，激活机体的特异性主动免疫，必将对杀伤肺高转移性癌细胞亚群，进而控制肺转移有十分重要的意义。 国内外研究现状分析 迄今为止,与口腔癌侵袭转移相关的基因只局限在P53 C-erB-2nm23等少数几个基因上2,其根本原因在于以往的研究方法受到分子生物学技术的

9、极大限制,只能研究单个或少数几个基因。1996年, 在人类基因组计划的研究中，Steven Fodor等3充分结合并灵活运用了计算机、DNA合成、探针杂交、照相平板印刷、激光共聚焦扫描等技术,创造了完整的DNA生物芯片,可同时定量检测成千上万个基因的表达谱,结合生物信息学可从整体上分析疾病。1998年，Gress等4采用含20,736个基因片段的DNA芯片,检查了胰腺癌细胞株、胰腺癌组织与对照胰腺组织的基因表达谱,发现胰腺癌存在129个新基因序列和97个EST,从而找出了形成胰腺癌恶性表型的相关基因。 现阶段，国内已建立DNA生物芯片技术和人腺样囊性癌细胞系ACC-2及其肺高转移克隆株ACC-

10、M5，我们采用含14，000个基因片段的DNA生物芯片首次对遗传背景相同而生物学行为不同的ACC-2和ACC-M进行了大规模的基因表达定量对比分析，结果表明，低转移性的ACC2细胞系和肺高转移性的ACCM细胞株比较，有显著差异的基因36个，有差异的基因213个。这些基因涉及跨膜蛋白、细胞信号传导、细胞代谢过程等诸方面。其中的肺高转移相关抗原基因可通过生物信息学分析、反义核酸、血小板凝集试验和裸小鼠移植瘤肺转移模型来筛选和鉴定。 对肿瘤抗原加工递呈过程和机体免疫反应的深入研究表明,影响肿瘤免疫治疗效果不理想的重要原因在于肿瘤相关抗原是正常细胞中有或曾经有表达的蛋白质,只是在肿瘤细胞中有不适当的表

11、达,因而引起了机体的免疫耐受,为了克服免疫耐受,1998年Disis等6采用同源的人HER-2/neu蛋白免疫小鼠,诱导了比使用小鼠自身neu蛋白大得多的机体免疫。同时发现不使用完整的肿瘤抗原,而只使用肿瘤抗原多肽片段,能更有效地诱发机体免疫反应。但以上研究均采用的是肽疫苗，近年来发展的核酸疫苗因安全、热稳定和能引发持久的细胞和体液免疫等特点,从而比肽疫苗更具发展潜力7。 核酸疫苗集中了减毒疫苗和亚单位疫苗的优点,既可以不断表达抗原蛋白,又可以克隆所需基因片段,以激发理想的免疫反应,国内外对以T细胞识别的肿瘤抗原为中心的抗肿瘤核酸疫苗免疫治疗进行了大量的研究8.9,表明能诱发机体的抗肿瘤免疫反

12、应,杀伤癌细胞。但目前关于肺转移相关抗原核酸疫苗的研究尚未见报道。 本研究在筛选鉴定肺高转移相关抗原基因的基础上，设计构建同源的核酸疫苗，建立癌细胞动物模型，采用已建立的紧密结合临床实际的分子外科转基因方法，研究其抗肿瘤效果，将对深入理解肺转移的机制和临床外科治疗模式的发展产生积极影响10。 参考文献 1. Resser-JR; Carbone-DP. Immunotherapy of head and neck cancer. Curr-Opin- Oncol. 1998 May; 10(3): 226-322 Clayman-GL; Frank-DK;et al Adenovirus-me

13、diated wild-type p53 gene transfer as a surgical adjuvant in advanced head and neck cancers. Clin-Cancer-Res. 1999 Jul; 5(7):268-2713. Strachan.T,Abitbol.M, et al.A new dimension for the human genome project : towards comprehensive maps. Nature Genetic.1997,16;126-1314. Gress T M, Muller-Pillasch F,

14、 et al. A pancreatic cancer-specific expression profile .Oncogene,1998,13:1819-18305.关晓峰,邱蔚六等.肺高转移性腺样囊性癌细胞株的筛选.中华口腔医学杂志, 1996;2:74-77.6.M.L.Disis, F.M shiota etb al .Human HER-2/neu protein immunization circumvents tolerance to rat neu :a vaccine strategy for self tumor antigens .Immunology . 1998,9

15、3:192-199.7. Seder, Robert A.; Gurunathan, Sanjay. DNA Vaccines: Designer Vaccines for the 21st Century The New England Journal of Medicine.1999;341(4):277-2798.Ciernik IF,Berzofsky JA et al .Induction of cytotoxic T lymphocytes and antitumor immunity with DNA vaccines expressing single T cell epito

16、ps. J Immunol 1996,156:2369-23759.Gary L .Clayman, Adel K.EI-naggar et al In vivo molecular therapy with p53 adenovirus for microscopic residual head and neck squamous carcinoma.Cancer Research ,1995;55:1-6.10.Jack A.Roth .Molecular surgery for cancer. Arch Surg.1992;127:1298-1302.三、研究方案1.研究目标、研究内容和

17、拟解决的关键问题 研究目标: 已建立人腺样囊性癌细胞系ACC-2及其肺高转移性克隆株ACC-M,采用DNA生物芯片技术对这两个遗传背景相同而生物学行为不同的癌细胞系的基因表达谱进行定量对比扫描，运用生物信息学、反义核酸技术、分子杂交来筛选鉴定肺高转移相关抗原基因，同时建立癌细胞动物模型，设计构建与口腔癌肺高转移相关抗原基因序列同源的核酸疫苗，采用已建立的紧密结合临床实际的分子外科转基因方法，深入研究其抗肿瘤免疫效果。 研究内容 1.运用DNA生物芯片技术（含14，000个基因）对腺样囊性癌细胞系ACC-2及其肺高转移性克隆株ACC-M进行大规模的基因表达谱定量对比分析。 2.结合生物信息学的聚

18、类分析和同源分析、反义核酸技术、血小板凝集试验、裸小鼠移植瘤肺转移模型来筛选鉴定肺高转移相关抗原基因,通过RT-PCR和分子杂交进一步在临床手术标本和其它口腔癌细胞系中确证. 3.选用含巨细胞病毒（CMV）启动子和-Gal基因的真核表达载体,设计构建与肺高转移相关抗原基因同源的核酸疫苗。 4.建立癌细胞动物模型，应用分子外科转基因方法，通过荷瘤动物模型的COX生存分析、T细胞亚群功能测定、抗-Gal抗体测定来研究其体内抗肿瘤效应的强度。 拟解决的关键问题： 1 对DNA芯片所获得的大量基因信息进行有效的分析筛选和鉴定。 2.核酸疫苗的设计。 3.抗肿瘤效应的分析。 2.拟采用的研究方法、技术路

19、线、实验方案及可行性分析 实验方案和研究方法1. 分别培养人腺样囊性癌细胞系ACC-2及其肺高转移克隆株ACC-M，抽提总RNA，分离mRNA，逆转录成cDNA并用P33标记.2. 制备cDNA阵列膜片,包含约14,000个基因,每个基因的序列已测出,分别与标记的cDNA片段杂交,采用专用软件和生物信息学分析基因表达量的差异。3. 运用生物信息学的聚类分析、同源分析和各种基因库信息对有差异的基因进行初步筛选,采用反义核酸技术,结合细胞学试验、血小板凝集试验和腺样囊性癌裸小鼠移植瘤肺转移模型,鉴定初步筛选的靶基因在细胞生长和转移中的作用，通过RT-PCR和分子杂交进一步在临床手术标本和其它口腔癌

20、细胞系中确证。4. 通过国际互联网查询美国国立卫生研究院(NIH)的生物信息科技中心(NCBI),可获 得与靶基因不同同源度的序列,据此选用含巨细胞病毒（CMV）启动子和-Gal基因的真核表达载体,设计构建与肺高转移相关抗原基因同源的核酸疫苗。同时,查找含相同序列的鼠癌细胞系,并从中科院上海细胞所细胞库中获取相应的鼠癌细胞系,在小鼠（非裸鼠）上种植癌细胞建立癌细胞鼠模型。5. 利用已建立的分子外科缝线和注射转基因的方法,将核酸疫苗转入癌细胞鼠模型 中, 通过荷瘤鼠模型的COX生存分析、T淋巴细胞亚群分析、抗-Gal抗体测定来研究其体内抗肿瘤的效应,从中找出最有效的抗肿瘤作用因子. 可行性分析

21、1.本实验室长期从事腺样囊性癌肺转移机理及其防治的研究,积累了丰富的理论知识和实验经验,并取得了公认的成就. 2.已进行的预初试验表明, 肺低转移性的ACC2细胞系和肺高转移性的ACCM细胞 株比较，已发现有显著差异的基因36个，有差异的基因213个。3.申请者本人在攻读研究生期间致力于肿瘤的分子外科和核酸疫苗的研究，该研究首次将含报告基因的质粒导入兔舌肌和胸锁乳突肌，建立了分子外科转基因技术。并已熟练掌握分子克隆和基因重组技术. 4.实验所需的基因分析软件、真核表达载体质粒、免疫分析试剂等已具备3. 本项目的创新之处1.首次采用DNA芯片对遗传背景相同而生物学行为不同的口腔癌细胞进行大规模的

22、基因定量对比分析。2.筛选和鉴定新的肺高转移相关抗原基因.3.本研究设计构建了与肺高转移相关抗原基因同源的核酸疫苗,深入研究了其抗肿瘤免疫作用.技术路线： 低转移细胞系ACC-2和肺高转移性克隆株ACC-M 抽提总RNA，分离mRNA，逆转录成cDNA,P33标记. DNA芯片技术（含14，000个基因）的基因表达谱定量对比扫描分析 生物信息学 反义核酸技术、血小板凝集试验 RT-PCR和分子杂交聚类和同源分析 腺样囊性癌裸小鼠移植瘤肺转移模型鉴定 进一步确证 肺高转移相关抗原基因 设计构建同源核酸疫苗 建立癌细胞鼠模型 将核酸疫苗转入癌细胞鼠模型中 COX生存分析、T淋巴细胞亚群分析、抗-G

23、al抗体测定来研究其体内抗肿瘤效应 4.年度研究计划及预期进展1. DNA芯片技术对低转移性的ACC2细胞系和肺高转移性克隆株ACCM细胞株的基因的大规模扫描分析. 2. 肺高转移相关抗原基因筛选。 肺高转移相关抗原基因的分析和鉴定。1. 构建核酸疫苗。 1. 建立癌细胞动物模型。 2. 测定分析抗肿瘤效应。 5.预期研究成果 1. 获得人腺样囊性癌细胞系ACC-2及其肺高转移性克隆株ACC-M二者完整的基因表达差异谱。 2. 口腔癌肺高转移相关抗原基因的筛选和鉴定。 2. 核酸疫苗抗肿瘤方法的应用。 4. 在国内、外专业刊物上发表论文5-6篇,参加国际、国内会议交流2-3次。 5. 预期研究

24、成果1.获得人腺样囊性癌细胞系ACC-2及其肺高转移性克隆株ACC-M二者完整的基因表达差异谱。 2.口腔癌肺高转移相关抗原基因的筛选和鉴定。 3.核酸疫苗抗肿瘤方法的应用。 4.在国内、外专业刊物上发表论文5-6篇,参加国际、国内会议交流2-3次。四、研究基础1. 与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩 1 2.预初实验结果表明，肺低转移性的ACC2细胞系和肺高转移性的ACCM细胞株比较，有显著差异的基因36个，有差异的基因213个。这些基因涉及细胞信号传导、细胞代谢过程、跨膜蛋白等诸方面，为进一步进行肺高转移相关抗原基因的筛选和鉴定及核酸疫苗的设计提供了宝贵的数据。 3.申请者本

25、人在攻读研究生期间致力于肿瘤的分子外科和核酸疫苗的研究，该研究首次将含报告基因的质粒导入兔舌肌和胸锁乳突肌中，建立了分子外科转基因技术。并已熟练了掌握分子克隆和基因重组技术.2.已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径（包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划和落实情况） 1.口腔肿瘤生物实验室具备细胞生物学和分子生物学的各项有关设备,包括达到GFP标准的细胞培养室、进口培养箱、无菌标准操作台、低温超高速离心机、-80低温冰箱、PCR扩增仪、核酸蛋白分析仪等。 2.拥有DNA 芯片分析的全套设备,包括96孔板和384孔板、PCR仪自动点膜仪、信号扫描仪、杂交炉等。 3.建有达SPF

26、标准的实验动物中心。 主要预初实验结果1. DNA芯片对肺低转移性的ACC2细胞系和肺高转移性克隆株ACCM细胞的14,000个基因的定量对比扫描分析结果表明,有显著差异的基因36个，有差异的基因213个。下面列出的是部分显著差异基因的基因序列号及其相关信息。2. 这些基因涉及细胞信号传导、细胞代谢过程、跨膜蛋白等诸方面，为肺高转移相关抗原基因的筛选和核酸疫苗的设计提供了可靠的数据和坚实的基础。Hs.201967 cds=(26,997) /gb=U05861 /gi=487134 /ug=Hs.201967 /len=1222Hs.79748 cds=(111,1700) /gb=AB018

27、010 /gi=5926733 /ug=Hs.79748 /len=1879Hs.183698 cds=(29,508) /gb=Z49148 /gi=793842 /ug=Hs.183698 /len=630Hs.111515 gb=AA484881 /gi=2213948 /ug=Hs.111515 /len=436Hs.78183 cds=(51,1022) /gb=D17793 /gi=457407 /ug=Hs.78183 /len=1204Hs.255772 clone_end=5' /gb=AA186737 /gi=1774854 /ug=Hs.255772 /len=5

28、11Hs.58593 cds=(119,868) /gb=X16901 /gi=35864 /ug=Hs.58593 /len=1408Hs.75069 cds=(0,1451) /gb=U23143 /gi=746435 /ug=Hs.75069 /len=1452Hs.150741 clone_end=3' /gb=AW072071 /gi=6027069 /ug=Hs.150741 /len=467Hs.109798 cds=(41,421) /gb=AJ249732 /gi=5921472 /ug=Hs.109798 /len=711Hs.14779 clone_end=3&#

29、39; /gb=N64822 /gi=1212651 /ug=Hs.14779 /len=636Hs.132390 cds=(0,977) /gb=U09848 /gi=495567 /ug=Hs.132390 /len=3505Hs.43800 clone_end=5' /gb=W20128 /gi=1295998 /ug=Hs.43800 /len=526Hs.241829 clone_end=3' /gb=AI254779 /gi=3862304 /ug=Hs.241829 /len=359Hs.71819 clone_end=3' /gb=AI005336 /g

30、i=3214846 /ug=Hs.71819 /len=685Hs.189083 clone_end=3' /gb=AA582554 /gi=2359914 /ug=Hs.189083 /len=461Hs.123057 cds=(11,385) /gb=X84003 /gi=791052 /ug=Hs.123057 /len=413Hs.177687 cds=(7,978) /gb=S68287 /gi=544761 /ug=Hs.177687 /len=1167Hs.50966 cds=(118,4620) /gb=D90282 /gi=219552 /ug=Hs.50966 /l

31、en=5215 Hs.76686 cds=(320,925) /gb=Y00483 /gi=31918 /ug=Hs.76686 /len=1136Hs.18136 cds=(143,3403) /gb=U40490 /gi=1110519 /ug=Hs.18136 /len=4232Hs.119689 cds=(100,450) /gb=S70585 /gi=1683259 /ug=Hs.119689 /len=703Hs.82837 cds=UNKNOWN /gb=L13435 /gi=291845 /ug=Hs.82837 /len=1056 Hs.181101 cds=(32,802)

32、 /gb=X60221 /gi=509290 /ug=Hs.181101 /len=11343.申请者和项目组主要成员的学历和研究工作简历，近期已发表与本项目有关的主要论著目录*和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务;青年科学基金申请者还应注明学位论文名称及导师姓名与工作单位 *论文：作者·题目·刊名·年份·卷（期）·页码 专著：作者·书名·出版者·年份 五、经费预算 支出科目金额（万元）计 算 根 据 及 理 由1 . 合计0.50办公用品0.50学术交流及会议费用0.40科研成果鉴定0.40资料检索、复印和论

33、文打印、幻灯等0.20论文发表、版面、审稿费3.实验材料费6.002.00分子生物学试剂2.00生化分析试剂0.50免疫分析试剂· 0.50普通试剂0.50基因库查询及软件分析费0.50实验动物4.仪器设备费1.00 0.50仪器设备添置费0.50伐器设备维修费、折旧费5.协作费0.50科研极作6.管理费0.50科研管理、水电费16.002.科研业务费0.50办公用品0.50学术交流及会议费用0.40科研成果鉴定0.40资料检索、复印和论文打印、幻灯等0.20论文发表、版面、审稿费3.实验材料费6.002.00分子生物学试剂2.00生化分析试剂0.50免疫分析试剂· 0.5

34、0普通试剂0.50基因库查询及软件分析费0.50实验动物4.仪器设备费1.00 0.50仪器设备添置费0.50伐器设备维修费、折旧费5.协作费0.50科研极作6.管理费0.50科研管理、水电费2.000.50办公用品0.50学术交流及会议费用0.40科研成果鉴定0.40资料检索、复印和论文打印、幻灯等0.20论文发表、版面、审稿费3.实验材料费12.004.00分子生物学试剂4.00生化分析试剂1.00免疫分析试剂1.00普通试剂1.00基因库查询及软件分析费1.00 实验动物4.仪器设备费1.001.00 仪器设备添置费5.协作费0.50 科研协作6.管理费0.50 科研管理、水电费注：预算

35、支出科目按下列顺序填写： 1.科研业务费 2.实验材料费 3.仪器设备费 4.实验室改装费 六、申请者正在承担的其它研究项目(包括攀登计划、863计划、攻关任务和各部委、省市任务等项目的名称及编号、任务来源、起止年月、负责或参加等情况)七、申请者承担（负责或参加）国家自然科学基金资助项目的情况批准号项目名称起止年月负责或参加进展或完成情况对申请者负责的前一个已结题科学基金资助项目（项目名称及批准号）完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目 研究工作总结摘要（300字）及已发表主要相关论文首页复印件（限三篇）。八、申请者承诺我保证上述填报内容的真实性。如果获得资助，我与本项目组成员将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，按计划认真开展研究工作，按时报送有关材料。申请者（签章） 九、推荐意见(不具有高级专业技术职务的申请者,须有两名具有高级专业技术职务的同行专家推荐。 推荐时,请认真负责地介绍申请者及其项目组成员的业务基础、