基因工程药物-概念性问题ppt课件

1、基因工程药物概念性问题基因工程概念性问题 1、基因和基因组的概念 2、基因工程中常用的工具酶 3、基因工程克隆载体 4、基因治疗与转基因动物1、基因和基因组 基因：基因是染色体上呈直线按顺序陈列的遗传单位，基因是携带遗传信息的构造单位，又是控制遗传性状的功能单位。基因除编码序列外还应包括保证转录所必需的调控序列及位于编码区上游5端的启动子非编码序列、内含子和位于编码区下游3端的终止子非编码序列。 编码区是基因功能发扬的构造基因或称功能基因，调控序列和启动子起调控启动作用，终止的非编码区属于调控基因。 染色体总长不到0.5m，而DNA分子总长可达数米。染色体上的基由于DNA分子。1、基因和基因组

2、 基因组是表示某物种单倍体的总DNA，对于二倍体高等生物，其配子的DNA总和即为一组基因组。 重叠基因overlapping genes：不同基因的核苷酸序列有时为相邻的两个基因共用，将核苷酸彼此重叠的两个基因称为重叠基因。 病毒基因组 细菌基因组 真核生物基因组病毒基因组的特点 构造简单，无细胞构造。基因组由DNA或RNA组成，可为单链或双链，亦可呈环状或线状。基因组小，含基因数少。 基因组中存在调控元件和转录单元。 有重叠基因存在。 以RNA为基因组的逆转录病毒。典型的逆转录病毒有三个基因，即由gag中心蛋白、pol逆转录酶和env包膜蛋白组成，其基因构造如下图：病毒基因组的特点 RNA基

3、因组的两端含有U3RU5两个完全一样的正向反复序列，从而在两末端构成了长末端反复序列LTR。LTR为激活、加强和调理病毒复制的重要区段。因此LTR在人类基因组中的整合也可促进其下游基因的活化和表达，如原癌基因被激活后致癌。U3U3RRU5U5病毒DNALTRLTRgagpolenv35DNA+DNA35细菌基因组的特点 由一条双链DNA组成，为无核仁、核膜的原核构造。 蛋白质基因通常是单拷贝基因。而rRNA基因那么是多拷贝的。 细菌中的构造基因中无内含子，无核膜，普通是边转录边在胞浆中直接合成蛋白质。 无基因重叠构造 DNA分子中有多种功能调控区，如复制起始区、复制终止区、转录启动区及转录终止

4、区等，这些区域常具有反向反复序列。细菌基因组的特点 质粒plasmid是染色体以外的遗传物质，是环状的DNA分子。不同细菌中的质粒大小不一103105bp。在酵母和其它真菌中也发现有质粒。 质粒DNA的功能类型有三种：1F质粒F因子由称性质粒。控制菌毛构成，利于定居，质粒可由性菌毛来进展质粒传送和转移；2R质粒抗药性因子能编码一种或几种抗菌素的抗性物质；3col质粒大肠杆菌因子质粒中含有编码大肠杆菌素的基因，编码的大肠杆菌素可使近缘的细菌致死或抑制生长。有的可编码毒素。真核基因组的特点 大而复杂，人的单倍体基因组为3109bp，比原核生物大数千倍，其体细胞基因组为双倍体，即有2份同源的基因组。

5、 存在大量低度、中度和高度反复序列 基因组中功能基因大多是不延续的，为断裂基因splitgene中间被不编码蛋白质的插入序列内含子所隔开。 基因组中非编码区多于编码区，约占总DNA的90%。 基因组DNA大多与蛋白质结合构成染色体，其中DNA约占35%，RNA占5%，其他的60%为组蛋白和非组蛋白。真核基因组 C值和C值矛盾：一个单倍体基因组中的全部DNA量称为该物种DNA的C值C value。 单拷贝序列：一部分与蛋白质及酶类表达有关 中度反复序列：通常是非编码序列，与单拷贝基因间隔陈列，少数成串陈列在一个区域。 高度反复序列 多基因家族：、真核基因组中许多来源一样、构造类似、功能相关的基因

6、在染色体上成串存在，这样一组基因称为基因家族gene family。基因的新概念 挪动基因movable gene又叫转位因子transposable elements，可以在染色体基因组上挪动，甚至可在不同染色体间跃迁，故又称腾跃基因jumping gene，后来称其为insertion sequences如今普通叫IS elements。如今已发如今细菌中存在着三种类型的转位因子，相对分子质量小于2000bp的普通叫插入序列IS，大于2000bp的称为转位子Transposon，Tn，第三种类型为噬菌体Mu和D108。2、基因工程中常用的工具酶 基因的重组与分别涉及一系列相互关联的酶促反响

7、。在众多的核酸酶中，限制性核酸内切酶又称限制酶，restriction enzyme和DNA衔接酶ligase的发现和运用，才真正使分子的体外切割和衔接成为能够。 限制性核酸内切酶是一类可以识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割双链DNA双链构造的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分别纯化出来的。 在核酸内切酶的作用下，侵入细菌的“外源DNA分子被切割成不同大小的片段，而细菌本身的DNA由于修饰酶的维护作用，可免于本身限制酶的降解。限制性核酸内切酶分类和命名 分类：即、型酶主要特性型型型1、限制和修饰作用单一多功能的酶分开的核酸内切酶和甲基化酶具有一种共同亚基的双功能酶2、限制酶

8、的蛋白构造3种不同的酶单一的成分2种不同的亚基3、限制造用所需辅助因子ATP、mg2+、S- 腺苷甲硫氨酸mg2+ATP、mg2+S- 腺苷甲硫氨酸4、切割位点能够随机切割位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3端2426bp5、序列特异性的切割不是是是6、在DNA克隆中的用途无用非常有用有用限制酶的命名 1用属名的头一个字母和种名的头两个字母，组成的3个字母的略语表示寄主菌的物种称号。例如大肠杆菌escherichia coli用Eco表示，流感嗜血菌haemophilus influenzae用Hin表示。 2用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型，例如 EcoR。假设限制和修饰体系在

9、遗传上是由病毒或质粒引起的，那么在缩写的寄主菌的种名右下方附加一个标注字母，表示为染色体外成分。例如EcoR I, EcoP I。 3假设一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体系，那么以罗马数字。如流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为Hind I、Hind II、Hind III等。 4原先的命名如今得到简化，原那么为：把一切略语字写成一行；命名酶称号不再特别标出限制酶或修饰酶，即略去R与M字母。II型限制性核酸内切酶的根本特性 1在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子构成链的断裂； 22个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的； 3断裂的结

10、果构成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端，但平末端例外。 绝大多数的II型限制酶都能识别由4、5、6或7个核苷酸组成的特定核苷酸序列。该序列称为识别序列。切割位点C-C-G-C-G-G切割位点G-G-C-G-C-C5335对称轴DNA衔接酶和DNA分子的体外衔接 目前知有3种方法可以用来在体外衔接DNA片段：第一种是用DNA衔接酶衔接具有粘性末端的DNA 片段；第二种方法是用T4DNA衔接酶直接将平末端的DNA片段加上PolydA-Poly(dT)尾巴之后，再用DNA衔接酶将它们衔接起来；第三种是，先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物，使之构成粘性末端之后，再用DNA衔接酶衔接。其它

11、工具酶 1大肠杆菌DNA聚合酶IE. Coli DNA Pol I DNA聚合酶I由两种亚基组成，带有3种酶活性。它的大亚基相对分子量为7900，带有聚合活性和3外切核酸酶活性，小亚基只需5外切核酸酶的活性。其它工具酶 2DNA聚合酶I大片段klenow酶 klenow酶的相对分子量为7600。是经过Subtillisin枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶分解DNA聚合酶，切除小亚基，只保管大亚基部分。所以这种酶具有DNA聚合酶的活性和3外切酶的活性，但是没有5外切核酸酶活性。其它工具酶 3T4DNA衔接酶 此酶是从噬菌体T4感染的E. coli中分别的，和klenow大片段一样，具有5-3聚合酶活性和

12、3-5外切酶活性。其外切酶活性比E. coli DNA聚合酶I的活性高200倍，此外，T4聚合酶有第三种活力取代反响。其它工具酶 4逆转录酶 这是一种有效的转录RNA为DNA的酶。又称为依赖RNA的DNA聚合酶。其产物DNA又称为cDNA，即互补DNA。最普遍运用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒AMV的逆转录酶，由和两条亚基组成，其相对分子质量分别为65000和95000，这种酶具有聚合酶活性和外切割酶活性。外切活性：如从DNA-RNA杂交链中特异性地降解RNA链，进而保管新合成的DNA链。其它工具酶 5末端脱氧核苷酰转移酶 从小牛胸腺或髓细胞中分别得到的，它催化DNA片段上的3-OH端加接脱氧

13、核苷酸。合成的方向是从底物的5端向3端进展。 6核酸酶S1 是从半曲霉菌中分别得到，可以降解单链DNA和RNA，产生5磷酸化单核苷酸或寡聚核苷酸。又称单链特异的核酸酶。其它工具酶 7核酸酶BAL31 从乳白短杆菌细胞中分别的。它能以渐进的方式从线型DNA分子的3、5两边同时降解，构成小的寡聚核苷酸片段或单核苷酸。 在基因工程中可被用于组建DNA的物理图谱以及呵斥克隆DNA分子的末端缺失。其它工具酶 8外切核酸酶III 从大肠杆菌中分别得到，功能是将带有3-OH末端的双链DNA从3到5端方向切除，产生5单核苷酸。此外该酶还带有内切核酸酶活性、RNaseH活性和3磷酸酶活性。 在基因工程中制备单链

14、DNA，以便用作DNA聚合酶反响的DNA模板； 在基因工程中制备对DNA有特异性的探针。其它工具酶 9T4多聚核苷酸激酶 此酶能将ATP上的位磷酸转移到DNA或RNA的5-OH上，酶作用底物是 单链或双链带有5-OH末端的DNA或RNA。其它工具酶 10碱性磷酸酶 从细菌中分别得到的碱性磷酸酶称为BAP酶，从小牛内脏中分别制备的酶称为CAP酶。该酶的功能是以单链或双链DNA、RNA为基质，将DNA或RNA片段5端的磷酸切除。其它工具酶 11甲基化酶 大部分大肠杆菌菌株中含有两种与DNA甲基化作用有关的酶，有dam甲基化酶和dcm甲基化酶。3、基因克隆载体 基因工程中所用的载体，主要有5类：a、质粒，主要指人工构建的质粒；b、噬菌体的衍生物；c、cosmid；d、单链DNA噬菌体M13；e、动物病毒。 载体的本质是DNA少数为R