《血清蛋白的分离》ppt课件

1、聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (1) 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。(2) 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板及圆盘电泳的操作技术。聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺Acr和交联剂N，N甲叉双丙烯聚酰胺Bis聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分别物质。Acr和Bis单独存在或混合在一同时是稳定的，但在具有自在基团体系时就能聚合。引发自在基团的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸胺Ap，催化剂是四甲基乙二胺TEMED；光化学法是以光敏感物核黄素来替代过硫酸胺，在紫外光照射下引发自在基团。聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶体系有延续和不延续电泳之分。不延

2、续电泳系统由浓缩胶和分别胶两种胶体组成，两种胶体分别由不同的pH 的缓冲液和胶贮液配制而成，构成孔径不同的两种胶体。不延续电泳系统电泳分别过程中包括三种物理效应，即样品的浓缩效应、电泳分别的电荷效应和凝胶的分子筛效应。本次实验采用不延续电泳系统PAGE，经过三种效应将血清中各蛋白质组分按其分子大小、电荷多少不同进展分别。聚丙烯酰胺凝胶电泳有圆盘电泳和垂直板电泳之分，但两者的原理完全一样，只是所用的电泳槽不同。由于时间问题，本次实验将分两组进展，一组运用圆盘，一组运用垂直板。夹心式垂直板电泳槽，圆盘电泳槽，电泳仪，直流稳压电源，玻璃板1313，注射器及微量注射器抽气泵，枯燥器，培育皿，玻璃棒，吸

3、量管，烧杯，滴管，玻璃管，薄膜手套，滤纸，日光灯制备分别胶、浓缩胶有关试剂： 凝胶缓冲液，分别胶储存液，0.8%过硫酸铵； 浓缩胶缓冲液，浓缩胶储存液，40%蔗糖溶液，核黄素。Tris-甘氨酸电极缓冲液PH8.3已参与溴酚蓝指示剂的血清样品染色液氨基黑1%琼脂糖溶液脱色液7%乙酸溶液由学生本人配制一、垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳1.凝胶的制备：1安装夹心式电泳槽 将长短玻璃板分别插到U形硅橡框的凹形槽中留意勿用手接触灌胶面的玻璃，在长玻璃板下端与硅胶橡框交界的缝隙内参与已融化的1%琼脂糖且两玻璃板内下端处处有琼脂糖其目的是封住空隙，凝固后的琼脂中应防止有气泡，琼脂凝固后，将硅胶橡框装入电泳槽内，以

4、对角线的方式将螺丝帽旋紧。 试剂称号试剂称号 用量用量ml) 分别胶缓冲液ph8.9 2.5ml 分别胶凝胶贮液 5.0ml 蒸馏水 2.5ml将以上三种试剂混合均匀后，置于真空枯燥器中 抽气10min过硫酸铵，置于真空枯燥器中，抽气10min 10.0ml按上表格配胶，二者抽气后混合均匀，小心不要在溶液中搅出气泡，以免过多接触空气。迅速用滴管将混合后的分别胶装在二块玻璃板之间至短板上端约3-4cm，并用注射器在起上面加一层水约1mm使凝胶构成时有一程度面，留意加水时，不要引起胶面的大动摇。在室温中放置，当两界面出现不同折射率时阐明已凝胶，时间大约40 分钟，以出现折射率不同的界面为准，再室温

5、下放置非常钟，使凝胶充分。将分别胶上层的水倒去，再用滤纸吸去多余的水留意不要碰破胶面，为下一步做预备。 试剂称号试剂称号用量用量ml) 浓缩胶缓冲液ph6.7) 0.5ml 浓缩胶贮液 1.0ml 40%蔗糖 2.0ml将以上三种试剂混合均匀后，置于真空枯燥器中， 抽气10min 核黄素 0.5ml按上表所示配胶，抽气后加核黄素0.5ml,混匀，立刻参与到已配制好的分别胶上面至短玻璃板上端约0.5cm，插入加样梳，放于日光灯下10 分钟左右浓缩胶就开场凝胶，3050分钟左右凝好凝缩胶变为乳白色为准，凝好后小心拔去加样梳。将 Tris甘氨酸电极缓冲液稀释10 倍后倒入电泳安装的左、右槽中，短玻板

6、一侧要略微超越玻板，长玻板一侧只需越过电泳丝的高度。用微量注射器经过缓冲液在每个加样凹槽中参与约5ul的样品。将样品端(短玻璃的一边)接直流稳压电泳仪的负极，接通冷却水，开场电泳。开场时电流控制在10mA，待样品进入分别胶时，将电流调至30mA左右。当蓝色染料迁移至间隔橡胶框下缘琼脂界面处0.5cm 左右时，电泳完成。将缓冲液回收至试剂瓶中，还可用1-2 次留意将正负级的缓冲液分开回收。4.剥胶 将固定螺丝旋松，取出硅橡胶框，将一块玻璃板悄然剥开，然后用玻璃棒将胶板取下放入培育皿中。5.固定，染色 在培育皿中倒入氨基黑染色液至覆盖胶板，染色分钟左右，此时染色与固定同时进展。染色液要回收利用6.

7、脱色 用 7%乙酸浸泡数次，直至背景蓝色脱去。1.凝胶的制备：1安装圆形玻管 将洗净的玻璃管烘 干后用橡胶玻璃头封 严，放置在一边等待 灌胶。 (2) 分别胶制备 按垂直板的方案进展配胶，混匀后迅速用滴管分装在玻璃管中至玻璃管上端约2-3cm，并用注射器在起上面加一层水约1mm使凝胶构成时有一程度面，在室温中放置，当两界面出现不同折射率是阐明已凝胶，将分别胶上层的水倒去，再用滤纸吸去多余的水留意不要碰破胶面，为下一步做预备。(3) 浓缩胶制备同垂直板： 按垂直板的方案进展配制，配制好后，立刻参与到已配制好的分别胶上面至短玻璃板上端约1cm，然后放于日光灯下10 分钟左右浓缩胶就开场凝胶，305

8、0 分钟左右凝好凝缩胶变为乳白色为准。2.加样将 电极缓冲液稀释10 倍后倒入电泳安装的上.下槽中留意需没过玻璃管的上下端，用微量注射器经过缓冲液在每个玻璃管的凝胶外表加约5ul 的样品3.电泳将样品端(上槽)接直流稳压电泳仪的负极，下槽接直压电泳仪的正极。开场时电流控制在1-2mA/管，待样品进入分别胶时，将电流调至5mA 左右/管。当蓝色染料迁移至间隔玻璃管下缘1-2cm 左右时，停顿电泳。将缓冲液回收至试剂瓶中留意正负极分开回收。4.剥胶将玻璃管从电泳槽中取下，用注射器吸满自来水后将针头插到凝胶与管壁之间，推进注射器，使针头在管壁和胶之间前进，胶条在水的压力及光滑的作用下自玻管中脱出，将

9、其放入培育皿中。5.固定，染色，脱色同垂直板由于与凝胶集合有关的硅橡胶条、玻璃板外表不光滑干净，在电泳时会呵斥凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；剥胶时凝胶板易断裂，为防止此景象，所用器材均应严厉地清洗。安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏。用琼脂糖封底及灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的经过。灌胶时，假设担忧琼脂封底不结实，那么可在上、下贮槽中倒入蒸馏水，液面上面不能超越上贮槽的短玻璃板，防止蒸馏水进入凝胶中。其作用是添加压力，防止凝胶液渗漏。浓缩胶凝胶完全聚合后，必需放置30min左右，使其充分“老化后，才干悄然取出样品槽模