《植物脱毒快繁技术》ppt课件

1、第五章、植物离体脱毒快繁技术 一、病毒危害 多数栽培植物，尤其无性繁衍植物，都易遭到一种或几种，甚至几十种病毒的侵染。例如，草莓染60多种病毒。并且随着培育时间的推移，侵染病毒的种类越来越多。 植物病毒病原体可经过维管束传导。因此，对无性繁衍的植物来说，一旦感染上病毒之后，就会代代相传越趋严重。 受病毒侵染的植物生长缓慢、畸形、产量大幅度下降，质量变劣，甚至完全丧失商品价值。 目前，对细菌和真菌侵染的病害，可经过药物处置到达治愈的目的。但还没有治病毒的特效药。种子普通不带病毒(豆类植物除外)，种子繁衍可得无毒植株。但对于无性繁衍植物，必需采取一些特殊方法脱除病毒。 脱毒快繁的普经过程 1、诊断

2、：首先了解供试资料感染病毒的种类 2、茎尖培育脱毒或结合热处置 3、鉴定 4、繁衍 5、驯化移植 1、热处置脱毒原理： 病毒进入植物细胞后，随植物细胞DNA一同复制。热处置并不能杀死细胞，只是钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停顿，而失去病毒的侵染才干。热处置是一种物理效应，可加速植物细胞分裂，在猛烈分裂的细胞中正常核蛋白合成占优势，使植物细胞在与病毒繁衍的竞争中取胜。因此加速分生组织细胞的分裂，可以获得无病毒植株。 二、脱毒方法 (一) 热处置脱毒 根据病毒对高温的敏感，寄主耐高温。利用这一差别，选择适当的温度和处置时间，进展高温处置，就能使寄主体内病毒浓度降低，传送速度减慢或失

3、去活性，而寄主细胞依然存活，并加快分裂和生长。(1)温汤浸渍处置 (2)热空气处置 2、热处置脱毒方法1温水浸渍处置 适用于休眠器官，在50左右的温水中浸渍10min至数小时，方法简便易行，但易使资料受伤。 2热空气处置 热空气处置对活泼生长的茎尖效果较好。将生长的盆栽植株移入温热治疗箱内，普通35-40。处置时间因植物而异，短那么几非常钟，长可达数月。热处置广泛运用于葡萄、草莓、马铃薯和菊热处置广泛运用于葡萄、草莓、马铃薯和菊花等植物。如：葡萄置于花等植物。如：葡萄置于38 可去除扇叶病毒。可去除扇叶病毒。热处置对葡萄扇叶病毒、草莓斑驳病毒、苹热处置对葡萄扇叶病毒、草莓斑驳病毒、苹果花叶病毒

4、等球形病毒有作用，而对另一些病毒果花叶病毒等球形病毒有作用，而对另一些病毒不起作用，因此，必需与茎尖培育相结合脱毒效不起作用，因此，必需与茎尖培育相结合脱毒效果更好。果更好。 植物的去病毒技术，本质上就是采取不含病毒颗植物的去病毒技术，本质上就是采取不含病毒颗粒或病毒颗粒含量甚少的粒或病毒颗粒含量甚少的0.10.5mm带带12个叶原基的茎尖作为外植体，进展微繁衍，使个叶原基的茎尖作为外植体，进展微繁衍，使其培育成完好的无病毒小植株的技术。其培育成完好的无病毒小植株的技术。二茎尖培育脱毒 1、茎尖培育脱毒原理 病毒在植物体内分布不均匀，其数量随植株部位及年龄而异，越接近茎顶端区域，病毒感染的程度

5、越低，生长点即分生组织约0.1-1mm几乎不含或含病毒很少。 1、传导抑制。植物体病毒的挪动主要靠2条途径：一是经过维管系统，而分生组织中尚未构成维管系统；二是经过胞间连丝，但这条途径病毒挪动速度非常慢，赶不上茎尖和根尖细胞不断分裂和活泼的生长速度。 2、酶缺乏。茎尖中缺乏病毒合成所需的酶系，存在高程度内源激素，可抑制病毒的增殖。 茎尖分生组织不带病毒，能够有茎尖分生组织不带病毒，能够有4方面的缘由：方面的缘由： 3、能量竞争。当植物细胞分裂、能量竞争。当植物细胞分裂DNA复制复制时，病毒时，病毒DNA随着复制。因此，植物细随着复制。因此，植物细胞分裂和病毒繁衍之间存在相互竞争。胞分裂和病毒繁

6、衍之间存在相互竞争。在旺盛分裂的分生组织中，代谢活动很在旺盛分裂的分生组织中，代谢活动很高，正常核蛋白合成占优势，使病毒无高，正常核蛋白合成占优势，使病毒无法进展复制。法进展复制。 4、抑制因子存在。在植物体内存在有一、抑制因子存在。在植物体内存在有一种种“病毒钝化系统抑制因子假说，病毒钝化系统抑制因子假说，在分生组织中的活性最高，因此使分生在分生组织中的活性最高，因此使分生组织不受侵染。组织不受侵染。2、培育基 普通以White、MS为根本培育基，提高钾盐和铵盐含量有利于茎尖生长。MS培育某些植物茎尖时，有些离子浓度过高应稀释。在双子叶植物中，激素能够在第2对叶原基中合成，所以茎尖的圆锥组织

7、生长激素不能自给，必需参与生长素与细胞分裂素，浓度要适宜。在生长素中应防止用易促进愈伤组织化的2，4-D，宜用NAA或IBA；细胞分裂素用KT或BA；GA3对某些植物茎尖培育有用。资料选择、消毒资料选择、消毒 微茎尖的剥取微茎尖的剥取 接种接种3、茎尖的培育方法3、茎尖的培育方法 需求一台解剖镜8-40倍。 剥离茎尖要迅速并尽快接种，或在一个衬有无菌湿滤纸的培育皿内进展操作，以防茎尖变干。 茎尖分生组织由于有彼此重叠的叶原基的严密维护，只需仔细解剖，(无须外表消毒)就可得到无菌的外植体。有时消毒处置睬添加培育物的污染率。即：叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只须75%酒精中浸蘸一下，而叶片包被松

8、散的芽，如香石竹、马铃薯等，那么要用0.1%次氯酸钠外表消毒10min。茎尖长茎尖长叶原基数叶原基数 小植株数小植株数 脱毒植株脱毒植株数数脱毒率脱毒率0.1215024480.272421842.90.646400离体茎尖大小对马铃薯脱毒效果的影响离体茎尖大小对马铃薯脱毒效果的影响 切取茎尖越小脱毒效果越好，但太小不易切取茎尖越小脱毒效果越好，但太小不易成活，过大又不能保证完全除去病毒，所以茎成活，过大又不能保证完全除去病毒，所以茎尖大小要适宜。尖大小要适宜。 剥取茎尖过程剥取茎尖过程: 解剖镜下用解剖针将叶片剥掉，解剖针要常消毒。当解剖镜下用解剖针将叶片剥掉，解剖针要常消毒。当一个半圆球的

9、顶端分生组织充分暴显露来之后，用解剖刀一个半圆球的顶端分生组织充分暴显露来之后，用解剖刀片将带片将带1-2个叶原基的分生组织切下，接到培育基上。个叶原基的分生组织切下，接到培育基上。 将接种的茎尖置于将接种的茎尖置于22左右温度下。左右温度下。 2000-3000lx 16h/d 光照下培育。由于在低温暖短日照下，茎尖有能够光照下培育。由于在低温暖短日照下，茎尖有能够进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必需保证。进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必需保证。微茎尖需数月才干胜利。微茎尖需数月才干胜利。 茎尖培育的继代培育和生根培育和普通器官的培育一样。 茎尖培育脱毒，由于其脱毒效果好，

10、后代稳定，所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径。 4、影响微茎尖成活及脱毒的要素 1母体资料病毒侵染程度被单一病毒感染的植株脱毒较容易，复合感染的较难。 2外植体大小 在最适培育条件下，外植体的大小决议茎尖的存活率，外植体越大，产生再生植株的时机也就越多。除了外植体的大小之外，叶原基的存在与否也影响分生组织构成植株的才干，普通以为，叶原基能向分生组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。2培育条件 在茎尖培育中，光下培育的效果通常比暗培育效果好，如马铃薯茎尖培育时，当茎已长到1cm高时，光照强度便添加到4000lx。 3外植体的生理形状 茎尖最好要由活泼生长的芽上切取。 取芽的时

11、间也很重要，普通选萌动期较好。否那么采用适当的处置，突破休眠才干进展。 三茎尖与热处置相结合方法 能抑制单独茎尖培育时，茎尖过小成活率太低，能抑制单独茎尖培育时，茎尖过小成活率太低，茎尖太大又脱除不掉病毒的缺陷。茎尖太大又脱除不掉病毒的缺陷。 1、热处置后取较大茎尖培育获得脱毒苗。、热处置后取较大茎尖培育获得脱毒苗。 2、取茎尖或茎段培育获得无菌苗。然后将试管、取茎尖或茎段培育获得无菌苗。然后将试管苗热处置，再取茎尖培育获得脱毒苗。苗热处置，再取茎尖培育获得脱毒苗。 四其它途径脱毒 1、愈伤组织培育脱毒 2、茎尖微体嫁接 3、化学疗法脱毒 1、愈伤组织培育脱毒 愈伤组织细胞带病原菌不均一，部分

12、细胞不带病毒，由这些细胞再生的植株是无病毒的。多次继代的愈伤组织中病毒含量下降，甚至检测不出病毒。 愈伤组织的某些细胞不带病毒缘由：愈伤组织的某些细胞不带病毒缘由： 1、病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度；、病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度； 2、有些细胞经过突变获得了抗病毒的抗性。、有些细胞经过突变获得了抗病毒的抗性。 愈伤组织脱毒的缺陷是植株遗传性不稳定，能够会产愈伤组织脱毒的缺陷是植株遗传性不稳定，能够会产生变异植株。生变异植株。2、茎尖微体嫁接 木本植物茎尖培育难以生根成植株，将实生苗砧木在人工培育基上种植培育，再从成年无病树枝上切取0.4-1mm茎尖，在砧木上进展试管微体嫁接，以获

13、得无病毒幼苗。3、化学疗法脱毒 病毒抑制剂 三、脱毒快繁资料的选择 应留意以下几点： 1种类要可靠 2要选择经当地栽培确认的高产优质的种类来作 为脱毒资料 3名贵的植物良种 4植物生长旺盛期，再生率高，脱毒效果好 四、植物病毒的鉴定 1、外观判别法 2、指示植物法 3、抗血清鉴定法 4、电子显微镜检查法 5、酶联免疫鉴定法(ELISA) 1、外观判别法： 带病毒株往往叶片发黄，凹凸不平，畸形，可根据这些表现来判别。但有些病毒表现不明显，仅靠这一方法还不够。 2、指示植物检测法： 指示植物又称鉴别寄主，指的是对某种或某些特定病毒非常敏感，而且病症表现十清楚显的植物。 通常不同病毒应选用不同的植物

14、。马铃薯病毒常用指示植物有千日红、曼陀罗、豇豆、辣椒等。 分为2种 汁液感染法摩擦接种法 嫁接检测法 3、抗血清鉴定法抗原抗体反响 原理：由于病毒是由蛋白质和核酸组成的，是一种较好的抗原。将病毒给动物注射后产生抗体。抗原和抗体结合产生血清反响。抗原：病毒。抗体：是指生物体在外来抗原的刺激下产生的一种免疫球蛋白，主要存在于血清中，含抗体的血清称为抗血清。 4、电子显微镜检查法 直接察看有无病毒存在，并根据病毒的大小、外形和构造等来判别病毒种类。 5 5、酶联免疫吸附测定法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)(ELISA) enzyme linked immunosorbent assay enzy

15、me linked immunosorbent assay 把抗原把抗原- -抗体的免疫反响于酶的催化反响相抗体的免疫反响于酶的催化反响相结合而开展起来的一种综合性技术，灵敏度高，结合而开展起来的一种综合性技术，灵敏度高，特异性强，开展最快运用最广的方法。特异性强，开展最快运用最广的方法。 原理：采用酶标志的特异抗体指示抗原原理：采用酶标志的特异抗体指示抗原- -抗抗体的结合，从而检测样品中的抗原定量测定法。体的结合，从而检测样品中的抗原定量测定法。双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：步骤如下：(1)(1)将特异性抗体与固相载体衔接，构成固

16、相抗将特异性抗体与固相载体衔接，构成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。(2)(2)加受检标本：使之与固相抗体接触反响一段加受检标本：使之与固相抗体接触反响一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，构成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合，构成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。合的物质。(3)(3)加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质此时固相载体上带有

17、的酶量与标本中受检物质的量正相关。的量正相关。(4)(4)加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反响的程度进展该抗原的有色产物。根据颜色反响的程度进展该抗原的定性或定量。定性或定量。 五、快速繁衍 茎尖培育得到的脱毒苗不多，用于消费需扩展繁衍。 扩繁方法： 1组培快繁 2无毒苗栽到土壤中进展扩繁。如甘薯、草 莓等利用蔓，马铃薯、姜、蒜等利用地下部分繁衍。为了预防病毒再感染，扩繁应在培育温室或防虫罩内，由于昆虫传播病毒。 3两种方法相结合，试管内扩繁，移栽后再扩繁。 留意：留意： 1、培育变异的产生，应及时去除、培育变异的产生，应及时去除

18、2、脱毒苗并非永远是无毒苗，由于昆虫等的传播，、脱毒苗并非永远是无毒苗，由于昆虫等的传播，难免会再感染病毒，所以要经常脱毒，普通脱毒苗难免会再感染病毒，所以要经常脱毒，普通脱毒苗用用13代代 。 脱毒试管苗为原原种繁衍一代为原种原脱毒试管苗为原原种繁衍一代为原种原1代原代原2代代枫树快繁图示枫树快繁图示枫树快繁图示枫树快繁图示月季快繁图示月季快繁图示月季快繁图示月季快繁图示月季快繁图示月季快繁图示月季快繁图示月季快繁图示 腋芽在生根培育基中生长两周，即可有小的幼根生成，腋芽在生根培育基中生长两周，即可有小的幼根生成，三周后，幼根可长至三周后，幼根可长至2 cm2 cm长。长。 将上述月季苗经过

19、炼苗后，从培育基中取出，小心地将上述月季苗经过炼苗后，从培育基中取出，小心地洗去根上的培育基，然后将其接种在培育介质中洗去根上的培育基，然后将其接种在培育介质中( (营养营养土土: :蛭石蛭石: :珍珠岩珍珠岩= 3:1:1)= 3:1:1)，再将培育介质浇透水，用，再将培育介质浇透水，用保鲜膜封上，以防止水分的散失，然后将其放在弱光、保鲜膜封上，以防止水分的散失，然后将其放在弱光、湿度大的培育室中培育，待长出新根后，可移入田间湿度大的培育室中培育，待长出新根后，可移入田间土壤中。详细过程如以下图：土壤中。详细过程如以下图：月季快繁图示月季快繁图示植物快繁的普通程序植物快繁的普通程序 1.1.

20、无菌母体植株的制备：无菌母体植株的制备： 取材、植物激素、取材、植物激素、 防止褐化和有害物积累防止褐化和有害物积累 2.2.不定芽增殖不定芽增殖 ： 增殖的途径：诱导构成大增殖的途径：诱导构成大量胚状体；诱导构成大量不定芽；促进腋芽的量胚状体；诱导构成大量不定芽；促进腋芽的快速构成；愈伤组织增殖快速构成；愈伤组织增殖 3. 3. 完好植株的构成：完好植株的构成： 4. 4. 再生植株的驯化再生植株的驯化 ： 5. 5. 再生植株的鉴定：再生植株的鉴定： 植物形状学鉴定；细植物形状学鉴定；细胞学鉴定胞学鉴定 一离体繁衍的普通技术一离体繁衍的普通技术 1.1.外植体的选择外植体的选择 (1)(1

21、)根据培育目的选择根据培育目的选择 (2)(2)思索种质、取材大小、时期和资料的生理思索种质、取材大小、时期和资料的生理形状，具有代表性形状，具有代表性 2 2培育物的增殖培育物的增殖 植物的种类和自然生长习性不同，其植物的种类和自然生长习性不同，其增殖方式及所采取的相应技术措施也不一样。增殖方式及所采取的相应技术措施也不一样。普通来讲，培育物的增殖有以下普通来讲，培育物的增殖有以下4 4种方式种方式 芽增殖特点主要芽增殖特点主要表如今培育方法简表如今培育方法简单，能高度坚持遗单，能高度坚持遗传稳定性，能长期传稳定性，能长期继代繁衍。目前采继代繁衍。目前采用这一方式快速繁用这一方式快速繁衍的植物有石竹、衍的植物有石竹、马铃薯、甘薯、草马铃薯、甘薯、草莓、葡萄和月季等。莓、葡萄和月季等。 不定芽增殖不定芽增殖 从从现存的芽以外的任现存的芽以外的任何器官和组织上经何器官和组织上经过器官发生重新构过器官发生重新构成的芽称之为不定成的芽称之为不定芽。芽。 特点主要表如今繁特点主要表如今繁衍系数高，有较好衍系数高，有较好的遗传稳定性。的遗传稳定性。 胚状体增殖胚状体增殖 特点是增长率高，胚的特点是增长率高，胚的双极性免去了生根环节，但胚状体休眠双极性免去了生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除还难以把握，其成苗率还的诱导和解除还难以把握，其成苗率还不高。因此，目