《核酸分离和纯化》ppt课件

1、找答案？找答案？核酸分别纯化的原那么是什么？为防核酸分别纯化的原那么是什么？为防止核酸降解需求留意什么？止核酸降解需求留意什么？核酸制备根本步骤？核酸制备根本步骤？如何鉴定核酸浓度和纯度？如何鉴定核酸浓度和纯度？核酸的保管方法有哪些？核酸的保管方法有哪些？前言前言 核酸核酸nucleic acidnucleic acid是以核苷酸为根本组成单是以核苷酸为根本组成单位的生物信息大分子。是遗传信息的携带者，是位的生物信息大分子。是遗传信息的携带者，是基因表达的物质根底。基因表达的物质根底。核酸的分类：核酸的分类：DNA DNA 核内染色体核内染色体 DNADNA。核外也有少量核外也有少量DNADN

2、A，如线粒体，如线粒体DNADNA，叶绿，叶绿体体DNADNA。质粒质粒DNADNA。 RNARNA存在于细胞质中，如存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNAmRNA, rRNA, tRNA等。等。除上述除上述DNADNA，RNARNA外，还有非细胞方式存外，还有非细胞方式存在的病毒和噬菌体，其或只含在的病毒和噬菌体，其或只含DNADNA，或，或只含有只含有RNARNA。主要内容主要内容1. 1. 核酸分别与纯化的原那么及要求核酸分别与纯化的原那么及要求1.1 1.1 核酸分别与纯化的普通原那么核酸分别与纯化的普通原那么(1) (1) 坚持核酸分子一级构造的完好性，坚持核酸分子一级构

3、造的完好性，是核酸构造和功能研讨的最根本要是核酸构造和功能研讨的最根本要求。求。 (2) (2) 排除其他分子的污染，保证核酸排除其他分子的污染，保证核酸的纯度。的纯度。1.2 核酸分别与纯化的要求核酸分别与纯化的要求(1) 为保证核酸的完好性，为保证核酸的完好性，防止降解，在实验中应留意：防止降解，在实验中应留意：尽量简化步骤，缩短提取时间，减少各尽量简化步骤，缩短提取时间，减少各种有害要素对核酸的破坏。种有害要素对核酸的破坏。减少化学要素对核酸的降解，减少化学要素对核酸的降解，pH5-9。化学要素？化学要素？生物要素？生物要素？物理要素？物理要素？q防止核酸的生物降解细胞内或外的防止核酸的

4、生物降解细胞内或外的各种核酸酶水解。各种核酸酶水解。q 所用器械和一些试剂需高压灭菌，所用器械和一些试剂需高压灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。操提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。操作温度为作温度为04。qDNA酶需求金属离子酶需求金属离子Mg2+、Ca2+的的激活，因此运用金属离子螯合剂，如激活，因此运用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等；阴离子外表活或柠檬酸盐等；阴离子外表活性剂性剂SDS。qRNA酶分布广泛，极易污染样品，而酶分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，生物且耐高温、耐酸碱、不易失活，生物降解是降解是RNA提取过程中的主要危害要提取过程中的主要危害要素。素。0

5、.1%DEPC焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯 浸泡，器械浸泡，器械180干烤干烤8h。n减少物理要素对核酸的降解，主要减少物理要素对核酸的降解，主要是机械剪切力，其次是高温。是机械剪切力，其次是高温。n机械剪切力包括强力高速的振荡、机械剪切力包括强力高速的振荡、忽然暴露于低渗液、样品反复冻融忽然暴露于低渗液、样品反复冻融等。等。n高温，如长时间的煮沸。高温，如长时间的煮沸。(2) 核酸纯度的要求：核酸纯度的要求：非核酸生物大分子的污染降低到最低程度，非核酸生物大分子的污染降低到最低程度，如蛋白质、多糖和脂类分子；如蛋白质、多糖和脂类分子；排除其它核酸分子的污染，如制备排除其它核酸分子的污染，如制备R

6、NA时，时，DNA分子是污染物；分子是污染物；去除对后续实验有影响的物质，如有机溶剂去除对后续实验有影响的物质，如有机溶剂和过高浓度的金属离子。和过高浓度的金属离子。2. 核酸制备的根本步骤核酸制备的根本步骤I. I.资料预备资料预备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分别核酸分别IV.IV.沉淀或吸附核酸，纯化并去除杂质沉淀或吸附核酸，纯化并去除杂质 V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中2.1 破碎细胞 (1) (1)玻璃匀浆器匀浆玻璃匀浆器匀浆(2)(2)液氮研磨法液氮研磨法多用于巩固植物资料，多用于巩固植物资料，研磨时常

7、参与少量石英研磨时常参与少量石英砂，玻璃粉或其他研磨砂，玻璃粉或其他研磨剂，以提高研磨效果剂，以提高研磨效果肝、肾等肝、肾等 冰上冰上 少量少量(3)(3)高速组织捣碎机捣碎高速组织捣碎机捣碎(4)(4)超声波处置法超声波处置法(5)(5)化学处置法化学处置法(SDS(SDS、吐温、吐温8080油酸酯等油酸酯等(6)(6)生化法溶菌酶、纤维素酶等生化法溶菌酶、纤维素酶等2.2 2.2 核酸分别，去除蛋白核酸分别，去除蛋白 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力( (核酸与碱性蛋白的结合核酸与碱性蛋白的结合) )、氢键和非极性的范德、氢键和非极性的范德华力。

8、华力。 分别核酸最困难的是将与核酸严密结合的蛋白分别核酸最困难的是将与核酸严密结合的蛋白质分开，同时防止核酸降解。质分开，同时防止核酸降解。1参与参与SDS SDS除有破膜和抑制核酸酶的作用除有破膜和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；出来的功能；2 参与浓盐溶液如参与浓盐溶液如NaCl 核酸核酸-蛋白质参与蛋白质参与NaCl后，破坏后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；聚；3酚酚/氯仿抽提氯仿抽提酚氯仿混合运用能添加去除蛋白的酚氯仿混合运用能添加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制造用。效果，并对核酸酶有抑制造

9、用。氯仿比艰苦，能加速有机相与水相分氯仿比艰苦，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。用。在酚在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需求氯仿抽提核酸提取液时，需求振摇，为防止起泡和促使水相与有振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分别，再加上一定量的异戊机相的分别，再加上一定量的异戊醇酚：氯：异戊醇醇酚：氯：异戊醇=25：24：1。 (1 (1运用留意运用留意 酚通常是透明无色的结晶，假设酚结晶呈酚通常是透明无色的结晶，假设酚结晶呈现粉红色或黄色，阐明其中含有酚的氧化产物，现粉红色或黄色，阐明其中含有

10、酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，由于氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。实验，由于氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 (2(2平安操作平安操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。作时应戴手套。运用酚时应留意运用酚时应留意2.3 沉淀核酸沉淀核酸n重新调整核酸的浓度，起到浓缩核酸的作用；重新调整核酸的浓度，起到浓缩核酸的作用； n去除溶液中某些盐离子与杂质；去除溶液中某些盐离子与杂质；n改动核酸的溶解缓冲液。改动核酸的溶解缓冲液。DNA纯化柱纯化柱核酸提取离心柱型核酸提取离心柱型利用硅胶

11、膜特异吸附核酸利用硅胶膜特异吸附核酸Na+Mg2+Li+2.3.1 核酸的有机溶液沉淀法核酸的有机溶液沉淀法 当核酸溶液的当核酸溶液的pH值值大于大于4时，核酸分子呈时，核酸分子呈多聚阴离子形状。多聚阴离子形状。 钾、钠、镁、锂及铵钾、钠、镁、锂及铵根等阳离子构成的盐，根等阳离子构成的盐，经过屏蔽带负电的磷酸经过屏蔽带负电的磷酸基团使基团使DNA分子聚结在分子聚结在一同而不溶于许多有机一同而不溶于许多有机溶剂。溶剂。启示什么？启示什么？核酸沉淀的盐类及浓度核酸沉淀的盐类及浓度盐盐储存液浓度储存液浓度mol/L)终浓度终浓度(mol/L)MgCl210.01NaAc3 (pH5.2)0.3KAc

12、3 (pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.8乙醇乙醇优点：优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实乙醇易挥发除去，不影响以后实验。验。缺陷：缺陷： 需求量大，普通要求低温操作。需求量大，普通要求低温操作。常用的有机沉淀剂常用的有机沉淀剂异丙醇异丙醇优点：优点： 需体积小，速度快，适于浓度需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的低、体积大的DNA样品沉淀。样品沉淀。普通不需低温长时间放置。普通不需低温长时间放置。缺陷：缺陷： 易使盐类、蔗糖与易使盐类、蔗糖与DNA共沉共沉淀异丙醇难以挥发除去。所淀异丙醇难以挥发除去

13、。所以，最后用以，最后用70乙醇漂洗数次。乙醇漂洗数次。聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG优点：优点： 可用不同浓度的可用不同浓度的PEGPEG选择沉淀不同相对分子质量选择沉淀不同相对分子质量的的DNADNA片段。运用片段。运用60006000相对分子质量的相对分子质量的PEGPEG进展进展DNADNA沉淀时，运用浓度与沉淀时，运用浓度与DNADNA片段的大小成反比。片段的大小成反比。留意：留意： PEGPEG沉淀普通需加沉淀普通需加0.5mol/L0.5mol/L的的NaClNaCl或或10 mmol/L10 mmol/L的的MgCl2MgCl2。精胺精胺 精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀精胺不

14、是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNADNA。 原理是：原理是： 精胺与精胺与DNADNA结合后，使结合后，使DNADNA在溶液中构造凝缩在溶液中构造凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与与DNADNA分开，到达纯化分开，到达纯化DNADNA的目的。的目的。 2.3.2 2.3.2 核酸沉淀的温度和时间核酸沉淀的温度和时间 普通强调，核酸沉淀在低温长时间下进展。普通强调，核酸沉淀在低温长时间下进展。但时间过长，易导致盐与但时间过长，易导致盐与DNADNA共沉淀，影响以共沉淀，影响以后的实验。普通运用后的实验。普通运用00冰水，冰水，10-15min10-

15、15min， DNADNA样品足可到达实验要求。样品足可到达实验要求。3. 3. 核酸的浓度和纯度的测定核酸的浓度和纯度的测定 3.1 3.1 紫外分光光度法鉴定核酸紫外分光光度法鉴定核酸 3.2 3.2 荧光光度法鉴定核酸荧光光度法鉴定核酸3.1 3.1 紫外分光光度法鉴定核酸紫外分光光度法鉴定核酸 3.1.1 3.1.1 紫外分光光度法测紫外分光光度法测DNADNA和和RNARNA的含量的含量 前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 g/ml 0.25 g/ml 。结论

16、：在波长结论：在波长260nm260nm紫外光下，紫外光下，1 OD1 OD值的吸光度相值的吸光度相当于双链当于双链DNADNA浓度为浓度为50 g/ml50 g/ml；单链；单链DNADNA为为37 37 g/mlg/ml；RNARNA为为40 ug/ml40 ug/ml。紫外分光光度计测定核酸浓度紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤的操作步骤a a分光光度计先用一定量的水校正零点。分光光度计先用一定量的水校正零点。b b汲取一定量的汲取一定量的DNADNA样品或样品或RNARNA样品，参与到盛有一样品，参与到盛有一定体积水的石英比色杯中。定体积水的石英比色杯中。c c测定待测样品在测定待测

17、样品在230nm230nm、260nm260nm和和280nm280nm的的ODOD值值d d计算浓度。计算浓度。 双链双链DNADNA样品浓度样品浓度(g/l) = OD260(g/l) = OD260核酸核酸稀释倍数稀释倍数 50/1000 50/1000； RNA RNA样品浓度样品浓度(g/l) (g/l) = OD260= OD260核酸稀释倍数核酸稀释倍数40/100040/1000。e e分析纯度。分析纯度。核酸定量仪核酸定量仪可直接获得浓度，可直接获得浓度，不用计算。不用计算。小分子杂质小分子杂质核酸核酸蛋白质蛋白质核酸的紫外吸收光谱核酸的紫外吸收光谱超微量核酸超微量核酸定量仪

18、定量仪更加方便更加方便A：测：测DNA： 纯的纯的DNA样品样品OD260/OD280=1.8 1.71.9 OD260/OD2302.01) OD260/OD2801.9, RNA污染。污染。2) OD260/OD2801.6，存在蛋白质或酚污染；，存在蛋白质或酚污染；3) OD260/OD2302.0 OD260/OD2302.01 1OD260/OD280OD260/OD280比值太小，蛋白质或酚的污染；比值太小，蛋白质或酚的污染；2 2OD260/OD2802.0OD260/OD2802.0，能够被异硫氰酸胍等污，能够被异硫氰酸胍等污染；染；3 3OD260/OD2302.0OD260

19、/OD2302.0，阐明有小分子及盐存在。，阐明有小分子及盐存在。3.2 3.2 荧光光度法鉴定核酸荧光光度法鉴定核酸 3.2.1 3.2.1 测定核酸含量：测定核酸含量：原理：原理：DNADNA、RNARNA在荧光染料溴乙锭在荧光染料溴乙锭(EB)(EB)嵌入嵌入碱基平面之间后，碱基平面之间后，DNADNA、RNARNA样品在紫外光样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。运用一系列知的不同浓度酸含量成正比。运用一系列知的不同浓度DNADNA溶液作规范对照，可比较出被测溶液作规范对照，可比较出被测DNADNA溶溶液浓度。液浓度。 留意：

20、此法的比较主要基于目测，是估计程留意：此法的比较主要基于目测，是估计程度。度。常用的荧光染料还有常用的荧光染料还有:golden view, gel red, sybr green3.2.2 3.2.2 荧光光度法鉴定核酸纯度荧光光度法鉴定核酸纯度原理：溴化乙锭原理：溴化乙锭(EB)(EB)等荧光染料示踪的核等荧光染料示踪的核酸电泳结果。酸电泳结果。基基因因组组DNARNA核酸鉴定实践常用操作程序核酸鉴定实践常用操作程序核酸定量仪测定浓度，核酸定量仪测定浓度，OD260/OD280及及OD260/OD230比值。比值。琼脂糖电泳，琼脂糖电泳，UV下察看下察看验证纯度及判别能否降解验证纯度及判别

21、能否降解(1) (1) 对对DNADNA DNA DNA样品溶于样品溶于pH8.0pH8.0的的TETE，4 4 或或-20 -20 保管；保管； 长期保管样品中可参与长期保管样品中可参与1 1滴氯仿。滴氯仿。(2) (2) 对对RNA RNA RNA RNA样品溶于样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)0.3 mol/L NaAc (pH5.2) 可以沉淀方式贮于乙醇，可在可以沉淀方式贮于乙醇，可在-20 -20 中长期保中长期保管管; ; 最常用无最常用无RNaseRNase水或高压后的水或高压后的DEPCDEPC水溶解水溶解RNARNA，冻贮于冻贮于-70-80 -70-8

22、0 。3.3 3.3 核酸的保管核酸的保管TE：Tris-Cl, EDTA4 4、核酸提取方法简单引见、核酸提取方法简单引见4.1 基因组基因组DNA的提取方法的提取方法4.2 质粒的提取和纯化质粒的提取和纯化4.3 Trizol法提取总法提取总RNA4.1 基因组基因组DNA的提取方法的提取方法4.1.1 酚抽提法酚抽提法以含以含EDTA、SDS及及RNase的裂解缓冲液裂解细胞，的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶经蛋白酶K处置后，用处置后，用pH8.0的的Tris饱和酚抽提。饱和酚抽提。DNA原理：原理：在正常情况下，核酸外表覆盖了一层由水分子组成在正常情况下，核酸外表覆盖了一层由水分子组成的

23、亲水薄膜，以维持其水溶性。高浓度盐离子的的亲水薄膜，以维持其水溶性。高浓度盐离子的参与破坏了核酸外表亲水薄膜的相对有序陈列，参与破坏了核酸外表亲水薄膜的相对有序陈列，构成了疏水环境。在此环境中，核酸与硅胶膜能构成了疏水环境。在此环境中，核酸与硅胶膜能有效结合，而蛋白质、代谢产物和其他污染物那有效结合，而蛋白质、代谢产物和其他污染物那么不能结合。么不能结合。特点：特点： 不需求运用有毒的苯酚等试剂，也不需求乙醇沉淀不需求运用有毒的苯酚等试剂，也不需求乙醇沉淀等步骤。等步骤。 快速，简捷。快速，简捷。4.1.2 基因组基因组DNA提取试剂盒离心柱型提取试剂盒离心柱型常用的试剂盒：Qiagenn甲酰

24、胺解聚法：细胞裂解步骤与酚抽提法一致，甲酰胺解聚法：细胞裂解步骤与酚抽提法一致，但以高浓度甲酰胺裂解液裂解但以高浓度甲酰胺裂解液裂解DNA与蛋白质与蛋白质复合体，再以透析除去杂质复合体，再以透析除去杂质n玻璃棒缠绕法：将基因组玻璃棒缠绕法：将基因组DNA沉淀缠绕于带沉淀缠绕于带钩玻璃棒上带出，溶于钩玻璃棒上带出，溶于pH8.0的的TEn异丙醇沉淀法异丙醇沉淀法n玻璃珠吸附法玻璃珠吸附法4.1.3 其他的基因组其他的基因组DNA提取方法提取方法裂解液裂解液+蛋白酶蛋白酶K裂解细胞裂解细胞缓冲液缓冲液GB+乙醇乙醇DNA柱子吸附柱子吸附缓冲液缓冲液GD去除蛋白去除蛋白漂洗液漂洗液漂洗漂洗DNA两次

25、两次洗脱液洗脱液TE洗脱洗脱DNA离心柱型离心柱型基因组基因组DNA提取步骤提取步骤n透析，沉淀，电泳，选择性沉淀透析，沉淀，电泳，选择性沉淀4.1.4 DNA4.1.4 DNA样品的进一步纯化样品的进一步纯化4.1.5 DNA4.1.5 DNA片段的回收片段的回收n原那么：提高回收率，去除杂质污染原那么：提高回收率，去除杂质污染n从琼脂糖凝胶中回收：从琼脂糖凝胶中回收：n DEAE纤维素膜插片电泳法，纤维素膜插片电泳法，n 电泳洗脱法电泳洗脱法n 冷冻挤压法冷冻挤压法n从聚丙烯酰胺凝胶中回收：压碎与浸泡从聚丙烯酰胺凝胶中回收：压碎与浸泡4.2 4.2 质粒的提取和纯化质粒的提取和纯化n质粒的

26、构造：超螺旋，半开环，线性质粒的构造：超螺旋，半开环，线性DNAn理化性质：与普通核酸类似，但抗切割和理化性质：与普通核酸类似，但抗切割和抗变性才干更强抗变性才干更强n一切分别质粒一切分别质粒DNA的方法都包括的方法都包括3个根本步个根本步骤：骤：n 培育细菌使质粒扩增；搜集和裂解细菌；培育细菌使质粒扩增；搜集和裂解细菌；分别质粒分别质粒DNA(有时还要求纯化质粒有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需根据实验所需)。n 选择哪一种方法主要取决于以下几个要选择哪一种方法主要取决于以下几个要素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求。用于纯化的

27、技术和实验要求。4.2.1 4.2.1 质粒提取原理质粒提取原理4.2.2 4.2.2 质粒质粒DNADNA的纯化与回收的纯化与回收n纯化纯化nCsCl-EB法法n聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法n柱层析法柱层析法n回收：与基因组回收：与基因组DNA类似类似4.3 RNA4.3 RNA的分别和纯化的分别和纯化nRNARNA易被易被RNaseRNase水解，水解，RNaseRNase除细胞内还广泛存除细胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中nRNaseRNase分子构造中的二硫键使其生物学活性非分子构造中的二硫键使其生物学活性非常稳定常稳定n排除排除RNaseRNase的污染是的污染是RNARNA制备胜利与否的关键制备胜利与否的关键4.3.1 RNA4.3.1 RNA制备的条件与环境制备的条件与环境n干净的实验室干净的实验室n操作人员带口罩，勤换手套操作人员带口罩，勤换手套n玻璃器皿如匀浆器、镊子玻璃器皿如匀浆器、镊子180干烤干烤8 h或更长时间或更长时间n枪头、枪头、EP管管0.1%DEPC水浸泡过夜，再高水浸泡过夜，再高压；或直接购买无压；或直接购买无RNase的枪头和的枪头和EP管管n冰上匀浆，冰上匀浆，4