琼脂糖凝胶电泳检测质粒

1、琼脂糖凝胶电泳检测质粒琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA一、实验原理一、实验原理 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：是常用的用于分离、鉴定及纯化DNA分子标准方法，这种电泳方法以琼脂糖凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。 实验仪器实验仪器：电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等 实验试剂实验试剂：琼脂糖，TAE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），上样缓冲液 琼脂糖琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。电泳缓冲液电泳缓冲液 1. Tris乙酸（乙酸（TAE）2. Tris硼酸（硼酸（T

2、BE）3. Tris磷酸（磷酸（TPE） PH为为7.58.0,这些缓冲液均含有这些缓冲液均含有EDTA。溴化乙锭（溴化乙锭（EB） 溴化乙锭（溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的的EB就插入就插入DNA分子中形成荧光络合物，使分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。 上样缓冲液上样缓冲液 0.25%溴酚蓝溴酚蓝

3、，0.25%二甲苯青二甲苯青 ，40%蔗蔗糖水溶液糖水溶液 0.25%溴酚蓝溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青二甲苯青 ，30%甘甘油水溶液油水溶液各成分的作用？各成分的作用？常用的常用的10X10X上样缓冲液上样缓冲液 加样缓冲液可以增大样品密度，以确保加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔内，均匀进入样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利。还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利。 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青FF的的2.2倍倍, 溴溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长3

4、00bp的双链线性的双链线性DNA相同相同,而二甲苯青而二甲苯青FF在琼脂糖凝胶中移动的速率则与在琼脂糖凝胶中移动的速率则与4kb双链线双链线性性DNA相同。相同。 迁移方向迁移方向 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷分子在碱性缓冲液中带负电荷 DNA迁移方向？迁移方向？ 点样孔朝向？点样孔朝向？影响影响 线形的双链线形的双链DNA分子在凝胶中迁移的速率与其碱基数的对数成分子在凝胶中迁移的速率与其碱基数的对数成反比。反比。 分子越大，迁移越慢。一是摩擦阻力越大，二是大分子通过凝分子越大，迁移越慢。一是摩擦阻力越大，二是大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。胶孔径的效率低于较小的分子。 不同构象

5、不同构象DNA分子在电场中移动的距离不同。具有相同分子量分子在电场中移动的距离不同。具有相同分子量的线状、开环状和超螺旋的线状、开环状和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度不同。在琼脂糖凝胶中移动速度不同。 迁移速度？迁移速度？二、实验方法二、实验方法 制备制备1%的琼脂糖胶液：的琼脂糖胶液：取取0.4g琼脂糖溶于琼脂糖溶于40mL TAE中。中。在短时间里加热琼脂糖全部熔化。使溶液冷却至在短时间里加热琼脂糖全部熔化。使溶液冷却至60。(加加入入EB ，使，使EB的终浓度为的终浓度为1g/mL)。 将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在35mm之间，凝固之间，凝固约约30min。 在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子，将胶床放在电泳槽内，在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子，将胶床放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。加样孔一侧靠近阴极（黑极）。 向电泳槽中注入适量的向电泳槽中注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面缓冲液，通常缓冲液高于胶面1cm。将适量的质粒样品与加样缓冲液混合将适量的质粒样品与加样缓冲液混合,用移液枪将样品用移液枪将样品加入加样孔。加入加样孔。