“顽拗植物”DNA提取与纯化的问题与展望

1、“顽拗植物”DNA提取与纯化的问题与展望摘要：植物DNA的提取和纯化是分子生物学研究的基础，然而大多数植物尤其是所谓的“顽拗植物”含有大量的多糖、多酚等其他次生代谢物，因此如何高效地提取高质量的DNA成了植物基因组研究的首要前提，也是目前很多植物分子生物学研究的瓶颈。本文就目前常用的植物DNA提取和纯化的方法及各自存在的问题进行了简单的综述。关键词：DNA提取，DNA纯化，“顽拗植物”The Problems and Prospect of DNA Extraction and Purification in “Recalcitrant Plant”Abstract: The DNA extr

2、action and purification of plants is the basis of the study on Molecular Biology, however, most of the plants, especially the so-called “Recalcitrant plant” contain large amount of polysaccharide, polyphenol and other secondary metabolites, therefore, how to effectively extract high quality DNA beca

3、me the first premise of plant genome research and the bottleneck of many Plant Molecular Biology research. This paper briefly summarized the commonly used DNA extraction and purification methods of plants and their existing problems of a simple review.Key words: DNA extraction, DNA purification, “Re

4、calcitrant plant”分子生物学是一门年轻而又古老的学科。早在1871年，Lankester就提出：生物不同种系间的化学和分子差异的发现和分析，对确定系统发生的关系，要比总体形态的比较研究更为重要 李兴玉. 简明分子生物学M. 北京: 化学工业出版社, 2009:2.。自20世纪50年代Watson和Crick提出DNA双螺旋模型以来，分子生物学在广度和深度上都获得了空前的发展。作为分子生物学研究的基础，DNA在生物学领域的研究日渐深入 张宁, 王凤山. DNA提取方法进展J. 中国海洋药物, 2004, (2):40-46.。而DNA的提取是分子生物学研究的重要手段，是分子标记、

5、基因克隆、基因探测等后续研究的基础 李继东, 毕会涛, 李海涛等. 灰枣成熟叶片DNA提取及ISSR反应体系构建J. 果树学报, 2008, 25(6):837-841.- 孙璐宏, 鲁周民, 张丽. 植物基因组DNA提取与纯化研究进展J. 西北林学院学报, 2010, 25(6):102-106.。然而如果材料中含有大量的多糖、蛋白质、多酚、酯类等次生代谢物，在沉淀过程中产生大量凝胶状物质，就会阻碍实验的进程 顾蔚, 魏南玉, 代立娟等. 华中五味子干燥材料DNA提取方法的研究J. 生物技术, 2007, 17(6):25-27.。因此，快速地提取和纯化结构完整的、高分子量的DNA对于很多分

6、子生物学的应用是至关重要的，例如长片段DNA的PCR扩增、限制性酶切、Southern印迹分析和基因文库的构建等 An Michiels, Wim Van den Ende, Mark Tucker, et al. Extraction of high-quality genomic DNA from latex-containing plantsJ. Analytical Biochemistry. 2003, (315):8589.。虽然目前已经发展了很多从植物中提取纯化DNA的方法，但对于很多特殊的植物材料，如“顽拗植物”、转基因食品以及出土的古老植物材料等，这些方法并不适用，并且即使对

7、这些方法加以改进，也难以提取出高质量的DNA。因此发展更简单、更省时、更经济的DNA提取与纯化方法将在很大程度上推动科研、环保、食品、医药、农业、畜牧业等诸多领域的发展。本文就目前比较常用的植物DNA提取方法和近年来不同学者在研究不同植物时的改良法以及“顽拗植物”DNA的提取仍然存在的问题进行了综述。1 植物材料1.1 “顽拗植物”在特定的条件下，植物的一些重要初生代谢产物，如乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A、莽草酸及一些氨基酸等，会作为原料或前体，进一步经过不同的次生代谢过程而产生一些“天然产物”如黄酮、生物碱、萜类等，这些天然产物称为次生代谢物。近年来研究发现，所有旺盛生长的细胞中都发生着次生

8、代谢物的不断合成和转化，在植物生命活动中起着非常重要的作用 董娟娥, 张康健, 梁宗锁. 植物次生代谢与调控M. 杨凌: 西北农林科技大学出版社, 2009:11-41.。所谓“顽拗植物（Recalcitrant plant）”，就是指那些众所周知的很难提取DNA的植物种类，因为这些植物的细胞结构比较复杂，并且含有很高水平多糖、多酚、皂苷、甾醇、单宁等其他次生代谢物 ZENG Jie1, ZOU Yu-Ping, BAI Jia_Yu, et al. Preparation of Total DNA from “Recalcitrant Plant Taxa” J. Acta Botanica

9、 sinica, 2002, 44(6):694-697.- 王冠明, 韩烈保, 马秀杰等. 麦冬基因组DNA提取方法研究J. 生物技术通报, 2010, (6) :100-106.。植物细胞由原生质体和细胞壁两部分组成，原生质体由细胞核和细胞质组成，细胞质又包括质膜、细胞器和胞基质。植物DNA就存在于细胞核和某些细胞器如叶绿体、线粒体中 马炜梁, 王幼芳, 李宏庆. 植物学M. 北京: 高等教育出版社, 2009:14-20.。因此在提取植物组织DNA之前需要裂解细胞以释放出DNA，常用的裂解植物细胞的方法包括物理和化学方法，在某些情况下需要用酶解法来消化蛋白质或降解一些细胞组分

10、裴杰萍. DNA提取方法的研究进展J. 微生物学免疫学进展, 2004, 32(3):76-78.。正是植物组织具有坚固的细胞壁，核酸含量较少，又含有较多的各种杂质，以及核酸酶活性高等因素，给植物DNA的分离和纯化带来了一定的困难 丁芳林, 彭书练. 黄芩高质量DNA提取方法研究J. 湖南农业科学, 2010, (13):2325.。1.2 植物材料的采集和处理1.2.1 材料的采集植物材料的采集与保存对提取DNA的产量与质量都有很大的影响。随着植物的成熟，植物组织中的多糖和其他一些次生代谢物的积累量会增加 Sue Porebski, L. Grant Bailey, Bernard R. B

11、aum. Modification of a CTAB DNA Extraction Protocol for Plants Containing High Polysaccharide and Polyphenol ComponentsJ. Plant Molecular Biology Reporter, 1997, 15(1): 8-15.，这样势必会增大提取DNA的难度。所以在选取植物材料时，尽量选取新鲜的、生长旺盛的幼嫩组织，对于这些材料通常用70%的乙醇清洗表面或浸泡1min以去除外源的DNA污染，并用灭菌去离子水冲洗干净 张英, 柏干荣, 黄明辉等. 植物基因组DNA提取方法学评

12、析与验证J. 药品评价, 2004, 1(4):292-297.。而对于一些衰老的叶片，可以先在黑暗中4饥饿处理1 2d，以尽量消耗掉组织中的淀粉和其他多糖类物质。Amit Kumar Gupta等 Amit Kumar Gupta, Harish, Manoj Kumar Rai, et al. Isolation of genomic DNA suitable for community analysis from mature trees adapted to arid environmentJ. Gene, 2011, (487):156159.认为提取所用叶片不能太嫩也不能太老，因为

13、太嫩叶的组织中，虽然DNA 含量高，但同时含糖量也高，同样会增加提取的难度。此外，在植物受伤后，多酚类物质很容易被氧化，所以，应尽量选取新鲜、幼嫩、无损伤的植物组织。也有研究者提出，在幼嫩组织不易得到的情况下，木本植物可以考虑使用1年生休眠的枝条韧皮部，这样可以不受季节限制 许婉芳. 去除顽拗植物DNA提取过程中干扰物质的方法J. 闽西职业大学学报, 2002(3):55-57.。1.2.2 材料的保存取样后立即用浸湿的纱布包裹采集的组织材料，放置在密闭的冰盒中，这样可使组织材料35 d仍然保持新鲜。野外远距离采集样本时，在可能的条件下冷冻保存（如放置于液氮中）；当不具备冷冻条件时，最好用无水

14、CaSO4和变色硅胶等干燥剂使其迅速干燥，这种方法可将材料保存数月，返回后应尽快进行DNA的提取工作。对具有大量次生代谢物的“顽拗植物”，除应尽可能采集幼嫩组织外，最好进行冷冻保存并在短时间内进行DNA提取。植物组织材料的化学保存法，如乙醇、丙二醇处理法，通常会导致DNA剧烈降解，因此，不作为推荐的保存方法。对于采集回来的样品如要长期保存，应经液氮处理后贮存在80冰箱或直接储放于液氮中，且在与提取缓冲液接触前，应防止冰冻的样品在空气中融化，否则酚类易被氧化16- 易庆平, 罗正荣, 张青林. 植物总基因组DNA提取纯化方法综述J. 安徽农业科学, 2007, 35(25):7789-7791.

15、。2 DNA的提取植物DNA的提取方法很多，主要包括物理法（研磨）、化学法（高盐低pH、CTAB、表面活性剂SDS、热酚等）和酶解法（裂解酶、溶菌酶、蛋白酶K等）。由于不同植物间以及同一植物的不同部位所含的化学成分差异较大，因此对不同植物DNA提取应采取不同的方法12， 马月萍, 戴思兰. 高盐沉淀CTAB法提取温室菊花基因组DNAJ. 生物技术通报, 2009, (7):90-93.。无论新鲜或其它方式保存的植物材料，在提取DNA之前，一般都要在液氮中研磨成细粉以便在裂解液中充分裂解，以得到更高的产率，同时低温可抑制DNase的活性，防止DNA降解。应注意要在液氮挥发尽后再将提取液加入样品粉

16、末中，以避免形成泡沫，浪费实验材料14。2.1 传统提取法2.1.1 CTAB法CTAB（Cetyltrimethyl Ammonium Bromide）即十六烷基三甲溴化铵，是一种阳离子去污剂，既能裂解细胞，又能有效沉淀多糖，还能与核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液中可解离，而在低盐溶液中会因溶解度的降低而沉淀，使DNA和多糖分开，最后再用乙醇沉淀DNA而除去CTAB 闫庆祥, 黄东益, 李开绵等. 利用改良CTAB法提取木薯基因组DNAJ. 中国农学通报, 2010, 26(4):30-32.。CTAB法是目前应用最多的植物DNA提取法，但是传统的CTAB法并不适用于“顽拗植物”DNA的

17、提取，故很多学者提出了各种适合不同植物的改良CTAB法，在不同程度上提高了DNA的提取效率。如刘锦等 刘锦, 罗成, 顾蔚等. 适于AFLP分析的华中五味子DNA提取方法改进J. 陕西师范大学学报（自然科学版）, 2009, 37(6):68-70.采用改良的CTAB法从华中五味子硅胶干燥嫩叶中提取获得了高质量的DNA。Jitendra Kumar等 Jitendra Kumar, Gyan P. Mishra1, Pradeep K. Naik, et al. Genomic DNA isolation from Artemisia species grown in cold desert

18、high altitude of IndiaJ. African Journal of Biotechnology, 2011, 10(37):7303-7307.对传统的CTAB法进行了修改，从含有大量多糖和次生代谢物的艾属植物中有效地提取出了高纯度的基因组DNA。张艳红等 张艳红, 沈向群, 刘旭颖等. 北方露地杜鹃 D N A的提取J. 江苏农业科学, 2011, (1): 31-32.在使用CTAB法对杜鹃进行基因组DNA提取时，作了3处改进：一是同时使用较高浓度的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和巯基乙醇（3），以消除杜鹃叶内复杂的次生代谢物的影响；二是增加酚仿抽提次数，以充分去除各种杂质；

19、三是大量提取，微量提纯，以降低次生代谢物的影响，通过改进的CTAB法提出了较高质量的DNA。2.1.2 SDS法SDS（Sodium Dodecyl Sulphate, 十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下可直接裂解细胞17。SDS通过破坏蛋白质的次级键，如氢键、盐键和疏水力，引起天然构象的解体，使染色体离析，同时与蛋白质和多糖结合，从而释放出核DNA。通过提高盐（KAc或NH4Ac）浓度并降低温度（冰浴），使SDS-蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式，再通过离心后除去SDS-蛋白质及多糖杂质沉淀。SDS法操作简单，温和，但在植物基因组DNA的提取应用中较少，因为该

20、方法不能有效去除多糖和多酚类物质，所提取的DNA纯度较低。因此SDS法主要应用于本身多糖含量不高的材料或其含量不致影响后续实验分析的样品以及对模板DNA质量要求不太高的RAPD分析。但有时SDS法或经过改进的SDS法也可提取到高质量的DNA，其效果等同于或更甚于CTAB法 肖婷婷, 朱艳, 叶波平等. 鸢尾属药用植物总DNA提取方法的比较研究J. 中国野生植物资源, 2010, 29(3):47-50.- 邹利波,黄升谋. 月季总DNA提取方法的比较研究J. 安徽农学通报, 2007, 13(1):57-58.。如巩艳红等4在SDS提取液中加入低浓度PVP来提高提取纯度，得出了改良的SDS法。

21、又如马兵钢等14在提取过程中同时加入抗氧化剂2-巯基乙醇和Vc，得到了颜色为白色至透明状的DNA粗提液，较好的解决了其DNA褐变严重的问题。2.1.3 果胶酶法Steven等采用果胶酶对植物细胞破碎后的抽提混合物进行消化处理，使与DNA共沉淀的胶状物质分解成小的片段，从而无法与DNA一起沉淀下来，降低了DNA的纯化难度，提高纯化效率2。2.1.4高盐低pH法高盐低pH值法中的提取试剂仅为无机盐和异丙醇，通常采用的无机盐为醋酸钾。高盐是有效的蛋白质沉淀剂，与一般氯仿-异丙醇反复抽提去除蛋白质的操作相比该法操作更方便省时，所需样品量少，适用于濒危植物DNA的提取；低pH则可有效地防止组织破碎及沉淀

22、大量材料时的电离化作用和酚类化合物的褐变，所得的DNA纯度高，无须进一步纯化，可直接进行后续反应2,23,24。如王培训等14改进邹氏等的方法，从干品药材西洋参根部和布渣叶中成功提取了纯度和产率都较好的基因组DNA；王冠明等9在对“顽拗植物”麦冬基因组DNA提取方法的研究时就发现，使用改良的SDS法比改良的CTAB法能得到更高的产率。高盐低pH法的优越性还在于，不采用酚、氯仿等有毒试剂，不需CTAB、SDS、酶等价格较高的试剂，技术环节也容易掌握 周凤, 张东旭, 吕洪飞. 4种金丝桃属植物基因组DNA提取及RAPD分析J. 山西大同大学学报（自然科学版）, 2010, 26(4):64-67

23、.。植物基因组 DNA 的提取方法还有Dellaporta和Wood及Hicks法Zigenhagen法CsCl 离心法。植物DNA提取的经典方法简单、高效，无需使用昂贵的仪器和药品，提取的DNA纯度较高，能够满足大部分分子生物学的需要，因此一直作为DNA提取的常规方法。然而这些经典的技术操作步骤复杂、耗时长、易交叉污染 D. E. Howland, R. P. Oliver, A. J. Davy. A Method of Extraction of DNA from BirchJ. Plant Molecular Biology Reporter. 1991, 9(4):340-344.，

24、需要作若干步操作和材料与试剂的转移，这些不容易做到自动化，也不适合加工大量标本，当仅有少量材料供分析时就格外不适用。另外，酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染，有损操作者的健康11。而且多数方法只能用于草本植物幼嫩组织DNA的提取，而不适用于木本植物成熟的组织，因此经典方法的应用具有一定的局限性。2.2 新提取法针对传统提取法无法满足各种特殊植物的DNA提取工作，近年来出现了许多新的DNA提取法，如利用螯合树脂、特异性DNA吸附膜、离子交换纯化柱及磁珠或玻璃粉吸附等方法。这些方法主要应用于提取病毒、微生物、动物和人细胞、福尔马林固定、石蜡包埋和冰冻组织样品、古生物标本、含PCR抑制剂的样本及土壤环

25、境样品DNA。张博等用硅珠（SiO2）颗粒吸附DNA纯化方法，从不同树木叶片中均得到了高质量的DNA样品4。黄椰林等对常规CTAB法提取的DNA用玻璃粉悬浮液纯化，所获DNA的PCR产物能直接测序，较适于“顽拗植物”等富含黏多糖、单宁、多酚和萜类化合物等次生代谢物的植物样品和长期保存的标本材料。目前国内外开发了多种商品化的DNA提取纯化试剂盒，有的是利用核酸的分子量差异，有的是利用特异性膜与DNA结合，从而达到分离、回收的目的。这些试剂盒根据材料来源的不同设计了不同的提取方法，操作简单、高效，所提取的DNA质量高，但价格昂贵，提取量较少，适用于样品数量有限及DNA含量少的珍稀材料。所以有些厂家

26、推出了将DNA提取和PCR扩增结合起来的试剂盒，极大地提高了提取的工作效率。另外，还有高通量的DNA提取产品，如高通量组织细胞研磨仪MM301，在常温和冷冻条件下对硬性、中硬性、韧性、脆性及纤维材料研磨破碎，每次处理样品的个数可以多达48个甚至192个。3 DNA的纯化3.1 去除多糖类杂质由于“顽拗植物”中富含多糖，而多糖的许多理化性质与DNA很相似，很难将它们分开，因此在“顽拗植物”DNA的提取中，多糖污染是最常遇到的问题16。多糖不但与DNA共沉淀，使DNA提取物呈粘稠的胶状，给实验操作带来不便，更重要的是多糖会抑制多种酶的活性，严重影响分子生物学研究的下游工作。如抑制某些DNA修饰酶的

27、活性，影响用分光光度法对核酸进行定量分析等 张继红,陶能国,张小云等. 三种豆科植物总DNA提取方法的比较J. 湖南农业科学, 2007, (2):31-33.。经典的CsCl梯度离心能有效除去植物中的多糖而得到高纯度的DNA，但由于梯度离心需要用到超速离心，不但耗时、设备昂贵、涉及EB、操作不便，而且DNA得率很低，因此并不用于一般的研究 Scott O. Rogers, Arnold J. Bendich. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissuesJ. P

28、lant Molecular Biology , 1985, (5): 69-76. 。近年来有很多去除植物组织中多糖的报道。Qin-Bao Li等 Qin-Bao Li, Qinyin Cai, Charles L. Guy. A DNA Extraction Method for RAPD Analysis from Plants Rich in Soluble PolysaccharidesJ. Plant Molecular Biology Reporter, 1994, 12 (3):215-220.用葡聚糖凝胶S-1000分离和PEG 8000沉淀的方法来纯化DNA，成功地从那些之

29、前发现很难用苯酚/氯仿提取法除去多糖的植物DNA样品中除去了多糖类物质。郑泉等 郑泉, 郭维明, 郑勇平等. “顽拗”植物春石斛基因组DNA的提取研究J. 安徽农业科学, 2010, 38(3):1156-1159, 1166.在对“顽拗”植物春石斛基因组DNA提取的研究中，对CTAB法进行改进，即采用区室分隔法，用核分离缓冲液在核裂解之前先将细胞核从细胞质中游离出来，同时保持细胞核的完整性，之后再裂解细胞核，这样便达到了在细胞核裂解之前就已经去除了大部分多糖、多酚等物质的目的；将CTAB的浓度提高到3%（W/V），增强了裂解细胞和去除杂质的能力；在采样前将材料置于4暗处饥饿24 h，消耗自身

30、的养分，也起到了一定地减少多糖干扰的作用。Yong-Ki Hong等 Yong-Ki Hong, Sang-Dal Kim, Miriam Polne-Fuller, et al. DNA extraction conditions from Porphyra perforata using LiClJ. Journal of Applied Phycology, 1995, (7):101-107.，在用LiCl从某种紫菜中提取DNA的条件的研究中指出，用LiC1法提取总DNA没有任何困难，并且不需要作任何去除多糖的处理。最主要的一点是，用LiCI 法不需要研磨组织，这样可以节省很多程序：液

31、氮研磨以及后续的去除多糖的复杂步骤。Sghaier ZIDANI等 Sghaier ZIDANI, Ali FERCHICHI, Mohamed CHAIEB. Genomic DNA extraction method from pearl millet (Pennisetum glaucum) leavesJ. African Journal of Biotechnology, 2005, 4(8):862-866.在研究珍珠稗叶片基因组DNA提取法时用了改良的CTAB法，包括在提取液中加入1.4 M NaCl、1% PVP、1%-巯基乙醇和100%的乙醇，以及减少分离沉淀DNA的离心时间

32、，解决了由于淀粉及其他多糖与DNA的结合和共沉淀而导致的产率低的问题。3.2 去除多酚类杂质“顽拗植物”中除了富含多糖外，多酚及其他次生代谢物也是DNA提取的中很棘手的问题。酚类化合物是指芳香烃中苯环上的氢原子被羟基或功能衍生物取代所生成的化合物，是植物体内重要的次生代谢物，广泛分布于植物组织中。在DNA提取实验中，组织研磨时，酚类物质容易氧化并与DNA的蛋白质及核酸共价结合，而产生很难与细胞器分开的胶状物质，使DNA不再适于PCR扩增和限制性酶切等后续分析27。对植物中酚类化合物的去除，一般是在提取DNA时加入适量的抗氧化剂和螯合剂，如在提取缓冲液中加入巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇、谷胱甘

33、肽及抗坏血酸等巯基试剂，在液氮研磨及提取液中加入高子螯合剂PVP（聚乙烯吡咯烷酮）或PVPP（聚乙烯聚吡咯烷酮）等能络合多酚和萜类物质，再由离心或氯仿抽提出去，都能有效的防止多酚物质氧化成醌类，避免溶液发生褐变。Aline Borges等 Aline Borges, Mariana Silva Rosa,Gustavo Henrique Recchia, et al. CTAB METHODS FOR DNA EXTRACTION OF SWEETPOTATO FOR MICROSATELLITE ANALYSISJ. Agric. (Piracicaba, Braz.), 2009, 66(

34、4): 529-534.在用CTAB法提取甘薯DNA时，将-巯基乙醇的浓度从1%提高到了3%，并且指出在温箱中干燥DNA时，较低的温度对于获得较高质量的DNA也是很重要的。Kamal Sharma等 Kamal Sharma, Ajay Kumar Mishra, Raj Shekhar Misra. A simple and efficient method for extraction of genomic DNA from tropical tuber cropsJ. African Journal of Biotechnology, 2008, 7(8):1018-1022.，在研究热

35、带薯类基因组DNA的提取时提出了一个简单而高效的方法。即改良CTAB法，其关键的步骤中就包括加入：2%-巯基乙醇和2% PVP，以消除多酚类物质的影响。丁晓东等 丁晓东, 吕柳新. 从顽拗植物荔枝中提取基因组DNA技术的研究J. 应用与环境生物学报, 2000, 6(2):142145.在进行从“顽拗植物”荔枝中提取基因组DNA技术的研究时发现，为了避免多酚等杂质被氧化，有很关键的两步：第一是用液氮研磨材料后要立刻转入核分离液中，否则暴露在空气中稍一化冻，材料就会很快发生褐变，棕褐色物质就会不可逆地与DNA结合，影响DNA的质量；第二是在65水浴过程中，温度回升会使多酚氧化酶恢复活性，这时要避

36、免材料与空气接触，管壁和管盖上不能残留植物组织，在液面用一层新鲜的核分离液来隔离空气，在水浴过程中尽量不要摇动eppendorf管，可最大程度上防止多酚的氧化。其次还根据多酚等次生物质主要分布于细胞质和液泡中这一特点，在裂解细胞核之前先破碎细胞以除去细胞质中的杂质，这样得到的DNA虽然产率降低，但纯度更高，完整性更好。此外，还利用活性炭在高温（65）对色素等杂质有很强的吸附力，在裂解液中加入了2 mg活性炭粉末，也在一定程度上减轻了多酚类杂质的影响。3.3 去除蛋白质及RNA杂质生化试验表明，DNA在紫外区有强的光吸收，最大吸收波长为260 nm，而蛋白质的为280 nm。天然双链DNA的紫外

37、吸光值OD260/OD280应该大约等于1.8，小于1.8说明提取的DNA中可能有蛋白质及酚类的污染，大于1.8则说明提取的DNA中可能还混有RNA 刘萍, 代红军, 张立杰等. DNA提取方法与植物种类的效应比较J. 宁夏农林科技, 1998, (1):15-18.。马艳芝等 马艳芝, 张玉星. 梨属植物基因组DNA提取部位对RAPD扩增的影响J. 西南农业学报, 2009, 22(4):1042-1045.在研究“顽拗植物”梨属植物基因组DNA提取部位对RAPD扩增的影响时指出，DNA模板中含有较少量的RNA和蛋白质不会影响RAPD的扩增结果，因为影响RAPD扩增的DNA杂质往往不是RNA

38、或蛋白质这些大分子物质，而是多糖类和酚类等小分子物质。即使如此，除去DNA中混杂的蛋白质及RNA，得到纯度更高的DNA对其他分子生物学的后续研究仍然是必须的。Sghaier ZIDANI等32在研究珍珠稗叶片基因组DNA提取法时对于大部分的蛋白质是通过在提取液中加入的氯仿和/或苯酚使其变性沉淀而除去，RNA则通常是用热的RNase A来消化。肖婷婷等 肖婷婷, 朱艳, 叶波平等. 鸢尾属药用植物总DNA提取方法的比较研究J. 中国野生植物资源, 2010, 29(3): 46-50.在鸢尾属药用植物总DNA提取方法的比较研究中还提出醋酸钾是有效的蛋白质沉淀剂，相比用氯仿-异戊醇分层反复抽提去除

39、蛋白质的方法，操作更加方便、省时，反应更加温和，避免了DNA不必要的污染或损失。周凤等25，在研究4种金丝桃属植物基因组DNA提取及RAPD分析时提出高浓度K+有利于SDS与蛋白质形成复合物，再经离心或过滤得以除去。得到的DNA纯度较理想，OD260/OD280值都在1.852.0之间，DNA得率高，用于RAPD扩增的结果也比较好。Kamal Sharma等34，在研究热带薯类基因组DNA的提取时使用改良CTAB法，及加入PEG和蛋白酶K来完全去除了蛋白质污染。黄萱等 黄萱, 高丽美, 张永彦等. 一种优化的植物总DNA提取方法J. 西北植物学报, 2004, 24(6):1103-1106.，在研究一种优化的植物总DNA提取方法时对前人使用RNase A的步骤作了适当的调整，