丙型肝炎病毒实验室检测技术规范

1、丙型肝炎病毒实验室检测技术规范丙型肝炎病毒实验室检测技术规范 中国疾病预防控制中心中国疾病预防控制中心 二二一一年五月二十日年五月二十日 前前 言言丙型肝炎已呈全球性流行。据世界卫生组织统计，全球丙型肝炎已呈全球性流行。据世界卫生组织统计，全球 hcvhcv 的感染率约为的感染率约为 3%3%，估计约，估计约 1.71.7亿人感染亿人感染 hcvhcv，每年新发丙型肝炎病例约，每年新发丙型肝炎病例约 3.53.5 万例。我国病毒性肝炎的发病人数一直位于所有万例。我国病毒性肝炎的发病人数一直位于所有传染病的前列，而丙型肝炎报告发病率在病毒性肝炎中也呈现上升趋势。丙型肝炎是一种主要传染病的前列，而

2、丙型肝炎报告发病率在病毒性肝炎中也呈现上升趋势。丙型肝炎是一种主要经血液传播的疾病，丙型肝炎病毒慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发经血液传播的疾病，丙型肝炎病毒慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。展为肝硬化甚至肝细胞癌，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。丙型肝炎给人类带来了如此巨大的危害，在目前还没有疫苗的情况下，早期发现、早期治丙型肝炎给人类带来了如此巨大的危害，在目前还没有疫苗的情况下，早期发现、早期治疗至关重要。然而，大众对于丙型肝炎认知的欠缺、

3、患者缺乏明显症状、在高危人群中早期发疗至关重要。然而，大众对于丙型肝炎认知的欠缺、患者缺乏明显症状、在高危人群中早期发现丙型肝炎患者的机制的缺乏，都使丙型肝炎防治面临巨大的挑战。现丙型肝炎患者的机制的缺乏，都使丙型肝炎防治面临巨大的挑战。目前丙型肝炎病毒检测已经在疾病预防控制机构、医疗机构、采供血机构、出入境检验检目前丙型肝炎病毒检测已经在疾病预防控制机构、医疗机构、采供血机构、出入境检验检疫机构等广泛开展，但是疫机构等广泛开展，但是我国在丙型肝炎病毒实验室检测方面尚存在检测策略不明确、检测程我国在丙型肝炎病毒实验室检测方面尚存在检测策略不明确、检测程序不标准、检测结果解释不规范等问题。临床实

4、验室检测中存在大量的假阳性、假阴性结果。序不标准、检测结果解释不规范等问题。临床实验室检测中存在大量的假阳性、假阴性结果。鉴于此，为加强全国丙型肝炎检测工作，提高实验室检测质量，急需制订关于丙型肝炎病毒实鉴于此，为加强全国丙型肝炎检测工作，提高实验室检测质量，急需制订关于丙型肝炎病毒实验室检测的技术规范。验室检测的技术规范。受卫生部委托，中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心于受卫生部委托，中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心于 2008 年年 10 月月 25 日在北日在北京召开了首次京召开了首次丙型肝炎病毒实验室检测技术规范丙型肝炎病毒实验室检测技术规范 （以下简称（以下简称规范

5、规范 ）编写组工作会议。卫）编写组工作会议。卫生部及中国疾病预防控制中心的有关领导从全国丙型肝炎防控管理角度，为生部及中国疾病预防控制中心的有关领导从全国丙型肝炎防控管理角度，为规范规范编写内容编写内容提出了几点要求：提出了几点要求：1 规范规范内容要考虑为公共卫生服务，要考虑到基层的具体情况。内容要考虑为公共卫生服务，要考虑到基层的具体情况。 规范规范制订的标准要制订的标准要有实用性及可操作性。有实用性及可操作性。2 规范规范内容要有发展的眼光，要考虑经济发展和技术进步。内容要有发展的眼光，要考虑经济发展和技术进步。 规范规范内容要有一定的前内容要有一定的前瞻性，要有较长的使用寿命。瞻性，要

6、有较长的使用寿命。3 规范规范内容要有大局观念，要考虑有利于各系统的发展。内容要有大局观念，要考虑有利于各系统的发展。 规范规范编写要借鉴国外经验、编写要借鉴国外经验、立足国内具体情况。立足国内具体情况。随后，随后，在卫生部和中国疾病预防控制中心有关领导的支持下，中国疾病预防控制中心性病在卫生部和中国疾病预防控制中心有关领导的支持下，中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心组织国内有关专家，历时近两年，经过反复多次修改，制订完成了我国艾滋病预防控制中心组织国内有关专家，历时近两年，经过反复多次修改，制订完成了我国丙型肝炎病毒实验室检测技术规范丙型肝炎病毒实验室检测技术规范。规范规范共分九章，

7、包括：丙型肝炎病毒，丙型肝炎共分九章，包括：丙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒抗体检测，丙型肝炎病毒抗原检测，丙型肝炎病毒核酸检测，丙型肝炎病毒检测策略，丙病毒抗体检测，丙型肝炎病毒抗原检测，丙型肝炎病毒核酸检测，丙型肝炎病毒检测策略，丙型肝炎病毒细胞培养，实验样品的采集、保存、运输，丙型肝炎病毒检测实验室的室内质量控型肝炎病毒细胞培养，实验样品的采集、保存、运输，丙型肝炎病毒检测实验室的室内质量控制及能力验证和实验室生物安全。制及能力验证和实验室生物安全。现代医学的发展日新月异，新理论、新观点、新的诊断技术和新的防治策略不断出现，中现代医学的发展日新月异，新理论、新观点、新的诊断技术和新的防治策略不

8、断出现，中国疾病预防控制中心将根据最新的临床医学证据适时组织专家组对本国疾病预防控制中心将根据最新的临床医学证据适时组织专家组对本规范规范进行修改和更新。进行修改和更新。本本规范规范主要起草单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心。主要起草单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心。本本规范规范参加编写单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心、中国疾参加编写单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制中心、北京大学医学部、北京人民医院、上海巴斯德研究病预防控制中心病毒病预防控制中心、北京大学医学部、北京人民医院、上海巴斯德研究所、中

9、国药品生物制品检定所、浙江大学医学院、北京市疾病预防控制中心。所、中国药品生物制品检定所、浙江大学医学院、北京市疾病预防控制中心。本本规范规范编写组织者：蒋岩。编写组织者：蒋岩。本本规范规范编写组人员：庄辉、魏来、鲁凤民、钟劲、祁自柏、陈智、周林福、汪宁、编写组人员：庄辉、魏来、鲁凤民、钟劲、祁自柏、陈智、周林福、汪宁、蒋岩、邢文革、邢玉兰、毕胜利。蒋岩、邢文革、邢玉兰、毕胜利。本本规范规范编写联系人：邢文革。编写联系人：邢文革。本本规范规范适用于全国所有的丙型肝炎病毒检测实验室。适用于全国所有的丙型肝炎病毒检测实验室。本本规范规范解释权属于中国疾病预防控制中心。解释权属于中国疾病预防控制中心

10、。本本规范规范自发布之日起施行。自发布之日起施行。丙型肝炎病毒实验室检测技术规范丙型肝炎病毒实验室检测技术规范编写组编写组20102010年年5 5月月2020日日 于北京于北京i目目 录录第一章第一章 丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒.11病毒形态和基因组结构.12基因型.23复制和细胞嗜性.24致病性和免疫性.3第二章第二章 丙型肝炎病毒抗体检测丙型肝炎病毒抗体检测.51概述.52试剂.53检测方法及程序.54抗体检测注意事项.105抗体检测的意义.116结果报告和解释.11第三章第三章 丙型肝炎病毒抗原检测丙型肝炎病毒抗原检测.131概述.132试剂.133检测方法及程序.144抗原检测注意事项

11、.145抗原检测的意义.156结果报告和解释.15第四章第四章 丙型肝炎病毒核酸检测丙型肝炎病毒核酸检测.161丙型肝炎 rna 定性检测.162丙型肝炎病毒 rna 定量检测.173丙型肝炎病毒基因型检测.23第五章第五章 丙型肝炎病毒检测策略丙型肝炎病毒检测策略.261疫情监测相关的检测策略.262临床诊断相关的检测策略.273血液筛查相关的检测策略.30第六章第六章 丙型肝炎病毒细胞培养丙型肝炎病毒细胞培养.321丙型肝炎病毒的细胞培养模型.322体外细胞培养技术在丙型肝炎病毒检测中应用的展望.33第七章第七章 实验样品的采集、保存、运输实验样品的采集、保存、运输.351样品采集.352

12、样品保存与运输.35ii第八章第八章 丙型肝炎病毒检测实验室的室内质量控制及能力验证丙型肝炎病毒检测实验室的室内质量控制及能力验证.371室内质量控制.372能力验证.41第九章第九章 实验室生物安全实验室生物安全.461丙型肝炎病毒相关检测的生物安全级别.462实验室生物安全保障措施.473实验室安全操作.484职业暴露及其处理.50参考文献参考文献.521第一章第一章 丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒（hcv）于 1989 年被正式命名，在此之前被称为肠道外传播的非甲非乙型肝炎病毒。1991 年被归为黄病毒科（flaviviridae） 。虽然丙型肝炎作为疾病早已被发现，但直到 200

13、5 年 hcv 体外细胞培养才获得成功。这对进一步认识 hcv 结构与功能、深入研究 hcv 的发病机制、研究和开发抗 hcv 药物和疫苗具有重要意义。1 1病毒形态和基因组结构病毒形态和基因组结构hcv 是一种有包膜的 rna 病毒。病毒体为直径 4060nm 的球状颗粒，包膜表面有刺突结构。用有机溶剂提取去除包膜后，可暴露其中心的核衣壳，直径约 33nm。经蔗糖梯度离心后，血清中的 hcv 颗粒分布于 3 个组分：浮密度为 1.041.06g/ml 者为与血清中脂蛋白结合的病毒颗粒；1.091.1g/ml 者为游离的病毒颗粒；浮密度为 1.171.24g/ml 的病毒颗粒与血清中抗体结合以

14、免疫复合物形式存在。在分类学上hcv属黄病毒科（flaviviridae）丙型肝炎病毒属（hepacivirus） 。hcv是单股正链rna病毒，基因组总长约9.6kb，编码单一的开放读框（open reading frame，orf） ，可翻译成一个约3000个氨基酸的前体蛋白。在hcv orf两侧分别有一个5非编码区和3非编码区，均具有复杂的二级结构。5非编码区含有内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，ires） ，可直接与40s核糖体亚单位结合，启动hcv前体蛋白的翻译。翻译启动后首先产生hcv前体蛋白。由宿主细胞的信号蛋白酶和hcv自身编码的蛋白

15、酶加工成约10个成熟的hcv编码蛋白。hcv结构蛋白位于前体蛋白的氨基末端1/3处，由宿主细胞的信号蛋白酶加工，包括核心蛋白（core） 、2个包膜糖蛋白（e1、e2）和一个小的p7蛋白。非结构蛋白（ns）位于前体蛋白的羧基末端2/3处，包括ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a和ns5b，其加工由hcv自身编码的蛋白酶介导，其中ns2-3自身蛋白酶切割ns2和ns3间的连接，而ns3丝氨酸蛋白酶负责下游ns3至ns5b间的加工成熟（图1） 。2图图1 hcv基因组结构及病毒蛋白基因组结构及病毒蛋白注：阿拉伯数字代表各成熟蛋白的第一位氨基酸残基位置；细箭头所指处由宿主细胞的信号蛋白酶切割

16、；实心粗箭头所指处由hcv ns2-3自身蛋白酶切割；空心粗箭头所指处由hcv ns3/4a丝氨酸蛋白酶切割。其中ns3-4a间的连接为顺式切割，而ns4a-ns5b为反式切割。2 2基因型基因型依据基因序列的差异，可将 hcv 分为 6 个主要基因型及不同亚型，按照国际通行的方法，以阿拉伯数字表示 hcv 基因型，以小写的英文字母表示基因亚型（如 1a、2b、3c等） 。基因 1 型呈全球性分布，占所有 hcv 感染的 70%以上，欧洲、美洲和亚洲的流行株以 1 型和 2 型为主；4 型主要流行于中东地区；南非以 5 型和 6 型为主。我国以 1b 和 2a基因型较为常见，但以 1b 型为主

17、；某些地区有 1a、2b、3b 和 6a 型的报道。3 3复制和细胞嗜性复制和细胞嗜性hcv主要感染肝细胞。首先，hcv与靶细胞表面的受体结合，进入细胞后脱壳将其基因组rna释放到细胞浆中。在hcv5非编码区内的ires指导下，hcv基因组rna可作为信使rna被翻译为一个大的前体蛋白，后者经宿主细胞和hcv自身编码的蛋白酶加工成为成熟的hcv基因产物，其中ns3到ns5b可组成hcv的复制复合体，以hcv基因组rna为模板，启动负链hcv rna的合成。新合成的负链hcv rna又可作为模板进行新正链及新负链hcv rna的合成，其中一些正链hcv rna可包装成为子代病毒，经高尔基体转运系

18、统释放到细胞外（图2） 。3图图 2 hcv 复制周期示意图复制周期示意图4 4致病性和免疫性致病性和免疫性丙型肝炎的潜伏期为226周，平均约67周。多数（约80%）hcv感染者无症状或仅有轻微症状，如疲劳、食欲减退、右上腹部不适、搔痒等，黄疸很少见（20%） 。50%80%的患者可发展成慢性丙型肝炎。有些患者不出现症状，发病时已呈慢性感染，慢性丙型肝炎的表现轻重不等。约20%的慢性丙型肝炎患者可在20年内发展为肝硬化，一旦到肝硬化阶段，每年约有1%7%可进展为原发性肝细胞癌。我国约10%肝癌患者血中存在抗-hcv。目前丙型肝炎尚无有效疫苗可以预防，切断传播途径尤其是控制血液传播仍是最主要的预

19、防措施。丙型肝炎的标准治疗方法是-干扰素和利巴韦林联合治疗，有助于尽早从血液和肝脏中清除hcv，并使患者的血液生化学指标及组织学改变恢复正常。人感染hcv后，可呈现四种类型的抗-hcv反应：（1）被动输入抗-hcv反应。多见于输入含高滴度抗-hcv血液者，于输血后抗-hcv即为阳性，5周后阴转，而后感染者自身产生抗-hcv，并可持续存在。 （2）迟发性抗-hcv持续阳性反应。一般于输血后2022周或发病后1416周抗-hcv阳转，并迅速达高水平，可持续阳性10年以上。 （3）迟发性抗-hcv短期阳性反应。于输血后1921周或发病后911周抗-hcv阳转，但1年后转阴。（4）无反应。此种反应多见

20、于一过性hcv感染者或免疫力低下者，抗-hcv始终阴性。目4前多认为，hcv感染所致肝脏损伤主要来自机体对hcv的免疫应答。此外，有研究显示，hcv的核心蛋白可通过损伤线粒体功能，引起肝细胞氧化应激，间接导致肝细胞损伤。hcv感染者大约有25%能自动清除体内病毒。有证据表明，这是机体产生了较强的体液和细胞免疫应答所致，hcv感染后的转归被认为与细胞免疫关系更为密切。丙型肝炎患者康复后，仅有较低免疫力，可再次被同种或异种hcv株所感染。也有同一患者感染多种基因型hcv的报道。 5第二章第二章 丙型肝炎病毒抗体检测丙型肝炎病毒抗体检测1 1概述概述丙型肝炎病毒抗体检测是丙型肝炎诊断的重要依据。自从

21、1989年建立了抗-hcv检测方法以来，检测技术不断发展。到目前为止，已经在临床广泛应用的丙型肝炎病毒抗体检测技术包括酶免疫技术、胶体金快速检测技术、化学发光技术、荧光技术等。抗体检测广泛用于血液筛查、流行病学调查、临床诊断，为早期发现感染者和病人、早期治疗提供可靠的依据。2 2试剂试剂抗-hcv 目前常用的检测试剂包括：酶联免疫吸附试验、胶体金法快速试验、化学发光试验、免疫荧光试验、免疫印迹试验和蛋白芯片。使用抗-hcv 试剂，必须是经过国家食品药品监督管理局注册，在有效期内的试剂。应根据目的和试剂使用范围，选择抗体检测试剂。推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。3 3检测方法及程序检

22、测方法及程序3.1 抗体筛查试验包括酶联免疫试验、胶体金法快速试验、化学发光试验和免疫荧光试验。3.1.1 抗-hcv 酶联免疫试验3.1.1.1 试剂和原理间接酶联免疫法（elisa）是抗-hcv 检测常用的筛查方法。其基本原理是以 hcv 抗原包被固相载体，用辣根过氧化物酶标记的抗人 igg 与被检样品中的抗-hcv 反应，以邻苯二胺（opd）或 3，3，5，5四甲基联苯胺（tmb）等底物显色后，利用检测仪器根据颜色的深浅进行阴阳性结果判断。其主要反应过程如下：（1）试剂中包含重组抗原与固相载体连接形成的固相抗原。（2）加入经样本稀释液稀释的被检样品，样本中的抗-hcv 与抗原结合，形成固

23、相抗原抗体复合物。6（3）洗涤：固相载体上只留下抗-hcv。其他免疫球蛋白及样品中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。（4）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。（5）加底物显色：利用分析仪分析结果。elisa 中通常用聚苯乙烯为固相载体，有微孔板、小管、小珠（beads）、微粒（microparticle）、磁性微粒等类型，后发展为硝酸纤维素膜、活化滤纸、硅片、尼龙、利用高分子材料合成的各种固相微粒等。不同形式的固相载体要求不同的洗涤装置，并有其特殊的自动分析系统。目前临床诊断和采供血机构广泛采用第三代

24、 elisa 试剂，即采用基因工程制备的重组蛋白做为包被抗原制备的抗-hcv elisa 试剂进行抗体筛查。3.1.1.2 试验程序板式 elisa 试剂均采用规格统一的 812 的 96 微孔板，与板式 elisa 试剂配套使用的洗涤装置（洗板机等）、自动分析仪（酶标仪等）均为开放式的，适用于各家产品。其主要的试剂组分和试验程序如下：（1） 配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水按照规定倍数稀释。（2） 稀释：每孔加入规定量样品稀释液。（3） 加样：分别在相应孔中加入一定量的被检样品或阴、阳性对照，轻轻振荡混匀。（4） 温育：按照说明书用封板膜封板后置 37温育。（5） 洗涤：小心揭掉封板膜，

25、用洗板机设置相应洗涤时间和次数，最后一次尽量扣干。（6） 加酶：每孔加入规定量的酶标试剂。（7） 温育：按照说明书用封板膜封板后置 37温育。（8） 洗涤：操作同 5。（9） 显色：每孔按照说明书要求加入显色剂，轻轻振荡混匀，37避光显色。（10） 测定：每孔加入规定量终止液，轻轻振荡混匀，按照说明书设定酶标仪检测波长测定各孔 od 值。微孔板以外的固相载体形式，其洗涤装置和自动分析系统均为试剂与仪器配套型的。自动化程度较高，精密度和重复性等指标也达到较高水平，但检测成本较昂贵。73.1.1.3 判定标准（1）阴性对照的正常范围：一般情况下，阴性对照孔读数规定值（若有 1 孔阴性对照读数大于规

26、定值应舍弃，若有两孔或两孔以上阴性对照读数大于规定值，应重复试验）。（2）阳性对照的正常范围：正常情况下，阳性对照孔读数规定值（若有 1 孔阳性对照读数小于规定值应舍弃，若两孔阳性对照读数小于规定值，应重复试验）。（3）根据试剂盒提供方法计算临界值（cutoff）。（4）阴性判定：样品读数临界值（cutoff）者为抗-hcv 阴性。（5）阳性判定：样品读数临界值（cutoff）者为抗-hcv 阳性反应。如试剂有配套的自动分析系统，则系统会自动计算 cutoff 值，并判定结果。3.1.2 抗-hcv 胶体金法快速试验3.1.2.1 试剂和原理近年来胶体金免疫渗滤试验（胶体金法）方法日趋成熟，逐

27、步在临床上得到广泛应用。该方法利用免疫胶体金技术，以间接法检测样品中的抗-hcv。检测时，样品中的抗-hcv与固定在硝酸纤维膜上的金标蛋白反应，形成复合物，经层析移动至检测条的检测区，被固定在硝酸纤维素膜上的 hcv 抗原捕获，形成一条阳性色带。未被结合的金标抗体移动至检测条的质控区，与包被在此的抗金标蛋白的二抗反应形成另一色带。该试剂具有操作简单、检测快速、特异性好、灵敏度较高、无需特殊的实验条件及仪器设备，可用于抗-hcv 筛查。此外，一些以纳米磁微粒作为标记物的新型抗-hcv 快速检测试剂也开始投入使用。3.1.2.2 试验方法胶体金试剂一般采用试纸条或检测板：（1）检测板：根据试剂说明

28、书取规定量的待检样品加入检测板的样品孔或样品池中，再滴加入缓冲液；（2）试纸条：将试剂条箭头所指方向插入样品收集器内，待检样品液面直到标记线为止，确保浸没时间大于 1015 秒。然后将试剂条从样品收集器中拿出，将之粘贴到测试卡上，再观察测试结果。不要将试剂条浸没位置超过标记线（具体时间规定按照说明书所示）。3.1.2.3 判定标准（1）阳性反应（+）：两条紫红色条带出现。一条位于测试区（t）内，另一条位于8质控区（c）。（2）阴性（-）：仅质控区（c）出现一条紫红色条带，在测试区（t）内无紫红色条带出现。（3）无效：质控区（c）未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂条已变质损坏。在此情况

29、下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试剂条重新测试。如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。（4）注意事项：测试区（t）内的紫红色条带可显现出颜色深浅的现象。但是，在规定观察时间内，不论该色带颜色深浅，即使只有非常弱的色带也应判为阳性反应。3.1.3.化学发光试验3.1.3.1 试剂和原理化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，clia）是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种：（1）化学发光标

30、记免疫分析法：化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析（clia），是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物acridiniumester（ae），是有效的发光标记物，通过起动发光试剂作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成，为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，其化学反应简单、快速、无须催化剂；检测小分子抗原采用竞争法，大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低；与大分子的结合不会减小所产生的光量，从而增加灵敏度。（2）化学发光酶免疫分析法：从标记免疫分析角度，化学发光酶免疫分析（chemiluminescent enzyme i

31、mmunoassay，cleia）应属酶免疫分析，只是反应的底物是发光剂，操作步骤与 elisa 分析完全相同。以酶标记生物活性物质（如酶标记的抗原或抗体）进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。该方法又分为如下几类： hrp 标记的 cleia：常用的底物为鲁米诺或其衍生物如异鲁米诺，是一类重要的发光试剂。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧（过氧化阴离子 o2-，单线态氧 o2，羟自由基 oh-，过氧化氢 h2o2）存在下生成激发态中间体，当其回到基态时发光，其波长为 425nm。早期用鲁米诺直接标记抗原或

32、抗体，但标记后发光强度9降低而使灵敏度受到影响。近来用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后利用鲁米诺作为发光底物， 在过氧化物酶和起动发光试剂（naoh2h2o2）作用下，鲁米诺发光，发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。 增强发光酶免疫分析（enhanced luminescence enzyme immunoassay，eleia）在发光系统中加入增强发光剂以增强发光信号， 并在较长时间内保持稳定， 便于重复测量， 从而提高分析灵敏度和准确性。 alp 标记的 cleia 所用底物为环 1，22 二氧乙烷衍生物，用于化学发光酶免分析底物而设计的分子结构中包含起稳定作用的基团金刚烷基，其分子中

33、发光基团为芳香基团和酶作用的基团，在酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。3.1.3.2 试验方法操作步骤与elisa分析类似或完全相同。3.1.3.3 判定标准在阴性和阳性对照符合试剂盒质控要求的情况下，以信号值（signal）/临界值（cutoff）试剂盒注明的s/co判定为抗-hcv阳性反应。根据试剂盒注明的（signal/cutoff）范围内或对弱阳性反应样本进行复试或补充试验，或判定为阴性。3.2 抗体补充试验抗体补充试验包括免疫印迹试验和蛋白芯片检测方法。3.2.1 抗-hcv 免疫印迹试验3.2.1.1 试剂和原理目前获美国fda正式批准的抗-hcv补充试验试剂只有一种，即美国ch

34、iron公司的重组免疫印迹法试剂（riba）。riba hcv 3.0将c100、c22和ns3、ns5四种成分喷涂在硝酸纤维薄膜条上，并设置了两种不同浓度的人igg对照带和一条hsod对照带，用于内部对照和结果判断。其诊断hcv感染的敏感性高、特异性强，可检测针对hcv不同编码区抗原的抗体，且不需要特殊的仪器设备。因此常用来确证elisa检测的结果。3.2.1.2 试验方法 依照试剂说明书操作。3.2.1.3 判定标准依照试剂判定标准判定结果。riba 试剂检测时出现两条以上阳性带，判定为阳性。其中 igg control和 igg control均显色，且前者颜色深于后者，hsod 带不显

35、色或色带低10于 igg control，以上条件成立则试验成立。抗体产生条带的判定依次为ns4、ns3、core 和 ns5。若两条抗体带显色，判定为抗体阳性；若 1 条抗体带显色，判为疑似抗体阳性；若所有抗体带均不显色，判为抗体阴性。3.2.2 蛋白芯片检测技术3.2.2.1 试剂和原理蛋白芯片检测技术是一种自动快捷、灵敏特异、高通量的蛋白组学研究方法，是伴随着基因芯片发展起来的一项新型诊断技术，已成功地运用于自身抗体、肿瘤标志物等的检测。 用蛋白芯片的方法检测抗-hcv 分片段，主要采用先进的蛋白芯片膜处理技术、点样技术、洗涤技术、标记技术等检测技术。检测原理基于间接免疫法，采用化学发光

36、的方法。突破了传统的 hcv 酶联免疫试验（elisa）检测试剂盒一次只能检测抗-hcv 的局限，样品用量仅为 elisa 的 1/5，能同时检测样品中抗 hcv core、抗 hcv ns3、抗 hcv ns4、抗 hcv ns5 以及抗 hcv 总抗体 5 项指标，能使临床方便地了解抗-hcv 中，core，ns3，ns4 和 ns5 4 种不同功能区抗体出现的情况及不同的临床意义。如抗-hcv core 滴度持续明显降低反映 hcv rna 可能消失；抗-hcv ns3 可用于早期诊断，下降或转阴提示治疗有效，是病毒血症水平降低或消失的敏感标志；抗-hcv ns4 与疾病慢性化有关，反映

37、总抗体水平；抗-hcv ns5 与肝细胞坏死有关，用于急性感染的诊断。3.2.2.2 试验方法取出制备好的芯片，加试剂盒规定倍数倍稀释的一定量血清样本以及阴阳性对照，37 温浴 30 分钟，反应终止后加入洗涤液，按照说明书要求的时间和次数进行洗涤，然后加入一定量相应标记的抗人 ig g 结合物，37 温浴 30 分钟，再按照说明书要求进行洗涤，根据试剂盒内二抗的不同标记类型直接进行扫描检测，或者加入底物或显色液进行检测。3.2.2.3 判定标准需要两条阳性带，才可判定为阳性，且抗原反应性1。4 4抗体检测注意事项抗体检测注意事项4.1 检测要点（1）严格按照试剂说明书操作，不得擅自更改；11（

38、2）注意防止交叉污染；（3）严格遵守实验室操作规程。4.2 检测中常见错误（1）稀释错误；（2）在加样时刮擦已包被抗原的微孔；（3）不适当的使用滴管，用滴管加试剂时滴管应处于垂直位置且液滴要自由落下；（4）使用不适当的加样器枪头，加样器与枪头一定要匹配，否则会使取样加样不准；（5）不连贯的操作技术，每份样本及质控品要同样对待，同时要同一个技术人员加所有的样本及质控；使用全自动处理处理系统有助于减少人为因素的影响；（6）使用不适当的设备，设备使用前要保证经过了校准；（7）不适当的温度，试剂使用前要平衡至室温，孵育温度要准确，否则会改变反应的动力学，产生错误结果；（8）不同批号试剂中的组分混合使用

39、。5 5抗体检测的意义抗体检测的意义抗-hcv 检测最初被推荐用于检出 hcv 感染。在临床上，针对大多数患有肝脏疾病的病人，筛查检测的敏感性和特异性均较高，抗-hcv 假阳性较为少见。然而，在 hcv 感染率低的人群中（如无偿献血员、现役或退役军人、普通人群、卫生保健从业人员、性病门诊就诊者），假阳性率较高，阳性预期值较低。抗-hcv 产生假阳性的主要原因是：（1）高 igg 血症：目前国内外的抗-hcv 试剂均采用间接酶联免疫检测原理，间接法的一个重要影响因素是血清中所含的高浓度的非特异性 igg，igg 对聚苯乙烯有较强的吸附力，非特异性 igg 可吸附到固相载体上或包被的抗原上造成假阳

40、性；（2）类风湿因子的干扰：类风湿性关节炎患者血清或血浆中的类风湿因子为巨球蛋白 igm，可非特异性地吸附到固相载体上或包被的抗原上造成假阳性；（3）超氧化物歧化酶（sod）的干扰：如 eia 试剂所含的重组基因片段 c-100 为酵母菌产生的sod 融合蛋白，样品中 sod 升高会造成抗-hcv 假阳性结果；（4）用于试剂制备的 hcv抗原不纯。用于生产抗-hcv 的抗原主要有 hcv 核心区、ns3、ns4 及 ns5 区蛋白，均为基因工程产物，如抗原的纯度太低，可产生非特异性反应。由于以上原因，不能单独依靠筛查试验阳性反应结果来判断一个人是否感染 hcv。因12此，筛查试验阳性反应的样品

41、需应用具有更高特异性的补充试验进行确证分析。免疫印迹试验是具有高特异性的抗-hcv 补充试验，用来确认筛查实验阳性反应的样品，其结果表示为“阳性”、“阴性”、“不确定”。免疫印迹试验阳性结果可判定抗-hcv 阳性。确认抗-hcv 阳性结果提示需要进行有关 hcv 感染的咨询和医学评价，包括进行 hcv rna 和肝脏生物化学（如 alt）检测。6 6结果报告和解释结果报告和解释6.1 根据筛查和补充试验结果进行报告的基本原则6.1.1 对于筛查试验阴性样品，无需做进一步检测，可报告为“抗-hcv 阴性” 。6.1.2 对于筛查试验阳性反应样品，可选择“根据其 s/co 比值”的方案或选择“不根

42、据其s/co”的方案直接进行补充试验。6.1.2.1 根据其 s/co 比值进行补充试验：对于高 s/co 比值的筛查试验阳性反应样品，可报告为“抗-hcv 阳性”，无需再做补充试验；对于低 s/co 比值的筛查试验阳性反应样品，应进一步做补充试验。6.1.2.2 直接进行补充试验：对所有筛查试验阳性样品，进行免疫印迹试验；或先做核酸放大检测(nat)，nat 阴性的样品，再进行免疫印迹试验。6.2 试剂盒规定的 s/co 阈值的说明6.2.1 高 s/co 比值：当 s/co 比值特定的阈值时，其补充试验结果阳性的预测值95；6.2.2 低 s/co 比值：其 s/co 比值0.99） ，斜

43、率（反映扩增的效率）在指定的范围内。但采用外标法定量的试剂盒标准品扩增良好也不一定意味着样品一定扩增良好，因为还涉及rna提取质量的问题，因此特别要注意考察阳性质控和阴性质控的结果，阴性结果必须没有扩增曲线，而阳性质控必须扩增曲线良好，结果落入指定的区间内。2.3 b-dna 技术2.3.1 原理分支 dna（bdna）技术基于其独特的信号放大系统，即 bdna 信号放大系统，这是一个人工合成的 bdna，bdna 的分枝可结合多个酶标记物，从而将病毒的信号放大，以便进行检测。利用序列特异的寡聚核苷酸探针杂交捕捉 hcv rna，hcv rna 随后与支链dna（bdna）二级探针杂交，bdn

44、a 再与酶联三级探针结合，随后加入酶底物，产生的化学发光信号强度与靶 rna 的量成正比。2.3.2 操作程序首先将血浆样品离心，浓缩其中的病毒颗粒，hcv rna 释放后加入微孔板中，板孔中包被有可与病毒特异结合的一系列靶探针，另一系列靶探针的一端可标记在游离的病毒核酸链上，另一端可与 bdna 结合，加入酶标记物对结合的 bdna 进行标记，经过清洗后加入底物进行反应，测定反应强度。本方法定量系统中没有内标记物，每次实验设置一系列外部标记，通过实验样品反应强度与外部标记样品强度的比较确定实验样品的病毒拷贝数。由于此实验不涉及核酸扩增过程，因此全部操作可在同一区域内进行，对此区域的要求相对较

45、低，但应保证此区域内不含有与本实验目的基因相同的大量核酸扩增产物或克隆22产物。试验区应配置 2 个温浴箱（在使用前分别调至 37和 63）、高速恒温离心机和bdna 测定分析仪。2.3.3 特点bdna 检测系统的优势在于：不涉及核酸扩增反应，污染的可能性小，因此对实验室的要求较 pcr 低；不需要核酸提取，直接用微量的血浆即可进行检测；检测的重复性好。但其不足在于线性范围较窄，操作耗时较长，并且结果在很大程度上依赖于质控品与标准品的表现。bdna 在国外实验室有较为广泛的应用，但在我国应用很少。2.4 hcv rna 定量检测的临床意义hcv rna水平与肝脏损害的严重程度及纤维化无关，也

46、不能预测感染的自然史和疾病预后，因此，临床上患者常规处理和监测并不需要反复检测hcv rna。hcv rna定量检测的意义主要体现在作为抗病毒治疗疗效的判断指标。表现在：仅hcv rna阳性的患者才考虑抗病毒治疗；持续病毒学应答（svr）（抗病毒治疗24周后hcv rna低于检测限，即50iu/ml）是抗病毒治疗的目标；而治疗过程中快速病毒学应答（rvr，即4周hcv rna低于检测限，50iu/ml）和evr（即治疗12周时血清hcv rna定性检测阴性或定量检测小于最低检测限，或定量检测降低2个数量级以上）则是svr的预测工具，能帮助更合理地进行个体化治疗。因此更优化的治疗方案是根据治疗中

47、的应答来指导用药方案（rgt策略）。2.5 结果报告现阶段对hcv rna定量检测的单位尚未完全统一，有的报拷贝/ml，有的报告国际单位（iu）/ml，不同的试剂所用的标准不一样，造成iu和拷贝之间的转换系数不同。国产hcv rna定量检测试剂盒的检测范围一般在103108拷贝/ml，国外知名试剂灵敏度要高于国产试剂，最低检测限约低一个数量级。一个合格的 hcv rna 定量检测报告单应该具备如下内容：检测方法（如荧光定量pcr） 、检测试剂名称、单位及检测范围。临床样品的结果可能有几种情况：结果在检测范围内，则按检测的结果直接发报告，如每毫升 3.2105拷贝/ml（有的临床实验室表示为3.

48、20e+05 拷贝/ml） ；结果高于检测上限，则应用 hcv 阴性的混合血浆（清）将样本进行 101000 稀释后再重新进行检测，直到结果落入检测范围内；样本未出现扩增曲线，则报告为低于检测下限。如果低于检测下限，但又有扩增曲线出现，则应重新进行检测，若在检测限内，按照实际数发报告，若仍低于检测下限，则报告为“低于检测下限” 。目前很多实验室对这部分样品不进行复检就直接发出报告，会造成相当部分阳性样品的漏检。233 3丙型肝炎病毒基因型检测丙型肝炎病毒基因型检测3.1 hcv 基因型1993 年 simmonds 等提出的分型方法得到了大多数学者的认同。simmonds 等分析不同毒株编码非

49、结构蛋白 5（ns5）区域核苷酸序列的同源性，按照发现的先后将 hcv 主要分为 16 个型，每个型有若干亚型，以 a，b，c 等表示。这样，hcv 被分为 6 个型和 70多个亚型。simmonds 分型方法对临床慢性丙型肝炎的抗病毒治疗具有重要指导意义，美国肝病学会、欧洲肝病学会、亚太肝病学会和中国制定的系列丙型肝炎防治指南都采用了该法进行分型。在我国，最主要的基因型为 1b（66%） ，其次为 2a（14%） ，还有其他较少见的型别，如西南地区的 3 型和广东等地区的 6 型等。3.2 hcv 基因型检测方法与试剂传统的 hcv 血清学分型与分子生物学分型相比，只有 62.1%的符合率。

50、现阶段检测hcv 基因型的分子生物学方法有限制性片段长度多态性（rflp） 、测序法及反相线性探针杂交法（reverse hybridization line probe assay，lipa）等，目前商品化试剂盒所用的方法主要是后两种。如 bayer 的 trugene hcv 分型试剂盒和 inno-lipa hcv 基因分型 2.0 试剂盒。分型试剂的检测靶位点主要集中于保守的 5端非编码区，trugene hcv 分型试剂直接对 hcv rna 序列测定来分型，lipa 则是基于反相杂交原理pcr 扩增目的基因（扩增的 dna 被生物素标记） ，与硝酸纤维膜上线形区带上的寡核苷酸探针杂

51、交，再加入标记有碱性磷酸酯酶的亲和素，与杂交产物上标记的生物素结合，加入显色底物 nbt/bcip 孵育后，显现紫色或棕色的条带，不同的条带组合对应不同的基因型。相比第一代产品，二代 lipa hcv 增加了核心区序列，可准确地区分 1a 和 1b 型，并可避免东南亚地区和我国南部地区较常见的 6c-6l 型被误分为 1 型，但仍约有 8%的 2a 型易被 lipa 误判为 1a 型，而这两种型别的 hcv 感染的治疗和预后均存在较大差异。需要注意，不论是 trugene 还是 lipa，均要经过 pcr 扩增，对 hcv 混合感染进行分型时，不可避免会因不同型别 rna 扩增效率不一造成的劣

52、势扩增毒株的漏检。3.3 直接测序法 hcv 分型操作程序随着核酸测序技术的发展，直接测序分型成为目前具有推广潜力的 hcv 基因型检测方法。该方法需要对 hcv rna 进行巢式 pcr（nested pcr，亦称套式 pcr）扩增，套式pcr 是 pcr 衍生技术中最常用的方法，它使用两对引物，进行两次 pcr 反应，能够极大24地增加 pcr 扩增反应的敏感性和特异性。套式 pcr 第二次反应的引物（内引物）位于第一次 pcr 扩增区域内。外引物进行第一次 pcr 扩增后，将第一次 pcr 扩增产物转移至第二次 pcr 反应管内，使用一对内引物进行第二次 pcr 扩增反应，最后用凝胶电泳

53、鉴定扩增产物。之后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化回收目的片段，然后测序。3.3.1 引物设计原则除遵循 pcr 引物设计的一般原则以外，hcv 分型主要考虑的是选择哪一段基因组序列进行分型才能获得更高的分辨效率。临床上用于 hcv 基因分型的方法有多种，最常用的是根据 5端非编码区（5ncr）序列差异而进行的基因分型方法，如 inno-lipa、5ncr 序列的直接测序、限制性片段长度多态性（rflp）-pcr 等，但基于 5ncr 的基因分型方法对不同亚型的分型准确率有较大的差异，对 1b、1a、2a、2b、2c、3a亚型的分型准确率分别为 76%、91%、20%、50%和 96%，

54、几乎不能对 4a、4b 和 4c 亚型进行区分，总准确率仅有 76%，这与 5ncr 序列过于保守有关。因为同一基因型、不同亚型 hcv5ncr 序列的差异度仅为 1.0%3.3%，而 ns5b 基因序列的差异度为16.5%20.1%，ns5b 基因更适合用于 hcv 的基因分型。列举常用的 pcr 引物：外侧引物：5-tggggatcccgtatgatacccgctgctttga-3 （上游引物）5-ggcggaattcctggtcatagcctccgtgaa-3 （下游引物）扩增的片段长度为401bp内侧引物：5-ctcaaccgtcactgagagagacat-3 （上游引物）5-gct

55、ctcaggttccgctcgtcctcc-3 （下游引物，测序引物）扩增的片段长度为339bp3.3.2 扩增体系引物各10100pmol/l4种dntp（datp、dttp或dutp、dctp和dgtp） 各200mol/ltaq dna聚合酶12umg2+1.52.0mmol/l模板dna100ng2000g三蒸水加至50l3.3.3 pcr 条件42 60min，94 5min第 1 轮 pcr 条件为：94 2min94 30s，50 35s，68 2.5min，35 个循环68 9.5min。第 2 轮：取第 1 轮 pcr 产物 1l 作为模板，进行第 2 轮 pcr，反应条件与

56、第 1 轮相同。253.3.4 切胶纯化1%琼脂糖凝胶电泳之后，对目的片段切割，回收及纯化。测序，纯化后的 dna 片段测序一般由专业的测序公司帮助完成，目的片段大小在500600bp 以下可以单向测序，超过 500600bp 的需要双向测序。3.3.5 结果分析根据序列，使用 bioedit 软件进行基因亲缘关系分析并绘制系统进化树，得到分型结果。3.4 hcv 基因分型的临床意义不同基因型对抗病毒治疗的应答不同，采取的治疗方案也不同，对rna定量结果也有一定的影响。基因型的测定有助于决定抗病毒疗程和药物剂量。根据临床研究结果，在1型患者中，抗病毒治疗的疗程和利巴韦林的用药剂量不同对持续病毒

57、学应答（sustained virologic response，svr）有明显的影响，建议疗程为1年，利巴韦林的用量要达到l000l200mg/d，尽管如此，其持续病毒学应答仅达到40%45；而2和3型患者，疗程半年，利巴韦林的用量只要800mg/d即可达到70%80的持续病毒学应答。延长疗程或增加利巴韦林的用量都不能进一步提高svr率。根据不同的基因型和患者肝脏病理学改变情况调整疗程和利巴韦林的用药剂量，可以减少不必要的浪费，同时减轻药物不良反应，提高患者对治疗的依从性。26第五章第五章 丙型肝炎病毒检测策略丙型肝炎病毒检测策略实验室对丙型肝炎病毒的检测可用于诊断、血液筛查、监测等。以诊断

58、为目的的检测是为了确定个体 hcv 感染状况，包括临床检测、自愿咨询检测、根据特殊需要进行的体检等；以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播 hcv，包括献血/浆员筛查和原料血浆筛查；以监测为目的的检测是为了解不同人群 hcv 感染率及其变化趋势，包括各类高危人群、重点人群和一般人群。1 1疫情监测相关的检测策略疫情监测相关的检测策略使用高敏感性筛查试剂进行初筛，结果呈阴性，报告抗-hcv 阴性，不再进行复检；结果阳性反应，进入复检程序。所有初筛阳性反应的样品使用高特异性筛查试剂进行复检，结果阴性反应，报告抗-hcv 阴性；结果阳性反应，报告抗-hcv 阳性。hcv 感染疫情报告检测流程见图

59、3。样品阴性反应初筛试验初筛试验阳性反应复检试验复检试验阴性反应阳性反应报告阴性筛查试剂（高敏感性）报告阳性筛查试剂（高特异性）图 3 hcv 感染疫情报告检测流程272 2临床诊断相关的检测策略临床诊断相关的检测策略2.1 初筛试验样品验收合格后，用筛查试剂进行初筛。结果呈阴性反应，报告抗-hcv阴性；结果呈阳性反应，进入复检试验。2.2 复检试验对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂双孔或原有试剂加另一种不同原理（或厂家）试剂进行复检试验。如均呈阴性反应，报告抗-hcv阴性；如均呈阳性反应或一阴一阳反应，则进入补充试验进行确证。2.3 补充试验2.3.1 “根据试剂s/co比值”的方案进行确证对

60、于高s/co比值（当s/co比值特定的阈值时，其补充试验结果阳性的预测值95）的筛查试验（包括初筛及复检）阳性反应样品，可报告为抗-hcv阳性，无需再做补充试验；对于低s/co比值（其s/co比值特定的阈值）的筛查试验（包括初筛及复检）阳性反应样品，应进一步做免疫印迹补充试验。结果阴性者，报告抗-hcv阴性；结果阳性者，报告抗-hcv阳性；结果可疑者，报告“可疑”并进行随访。2.3.2 补充试验直接进行确证2.3.2.1 复检试验阳性反应样品，进行免疫印迹试验。结果阴性者，报告抗-hcv 阴性；结果阳性者，报告抗-hcv 阳性；结果可疑者，报告“可疑”并进行随访。2.3.2.2 复检试验阳性反