WB实验步骤详细总结

1、蛋白提取（所有操作在冰上进行）1 .裂解1） 配裂解液：PMSF=100: 1,（裂解液和 PMSF在-20C保存，提前一天 4c解冻）取2ml裂解液，力口 20日PMSF混匀2） 称取30mg组织，切碎放入标记好的 AP管中，加入600 /上述1中液体（加入液 体与组织比例为 20： 1）,冰上静置10min2 .匀浆先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头）在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s,两次（间隔5s）,冰上静置30min3 . 离心（在基础4楼416室）1）自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（，两个标记，加少量超纯水，号是为了离心平衡

2、，对称放置）2） 将离心机预冷至 4 c为止，以1200X10r/min离心15min3）用移液枪将上层清液取出放入号管中4 .变性（上样缓冲液：样品=4: 1）将样品转移至23个0.5mlAP管中加上样缓冲液，100 c变性10min仪器屏幕：S500： 10S5100. 000: 10温度（°C） 时间（时：分钟）5 . 保存变性结束后，打开 AP管盖放一下气，然后 4 c保存，点样是取出即可用WB实验步骤1. 清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。2. 配制分离胶1） 准备：1ml枪（蓝色枪头），200 /枪（黄色枪头）10/

3、 （白色枪头）2） 10%分离胶的配置：（用 50ml烧杯。1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板）5.91ml超纯水4.95ml丙烯酰胺（30% ）避光保存极易失效3.75mlPh8.8Tris ?HCL150日10%SDS150AP （催化剂促凝作用）9 .TEMED混合摇匀（用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡）3. 灌胶沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止4. 水封立即用1ml超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响 电泳效果，等待20-30min5. 浓缩胶的

4、配制（5%）4.13ml超纯水1ml丙烯酰胺（30% ）避光保存极易失效750日Ph6.8 Tris ?HCL60 /10%SDS60 /AP （催化剂促凝作用）6 .TEMED搅拌混匀立即灌胶至溢出，插入梳子（10孔或15孔）凝胶30min或20min6. 电泳（电泳液最多使用两次）1） 安装电泳装置低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔 出防止拔歪）2） 点样（不易时间过长，防止样品条带扩散）Mark4 1(Protern ladder )推荐9 g ,实际4 g已经足够样品8 17-10 均可内参挑齐即可组数少时尽量靠中间点样，边缘易跑歪

5、3） 连接电泳仪电泳池与电泳盖连接：黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，打开开关恒压电泳先调电压至70mV,跑约20min。（ Mark跑开，分出彩带即可）再调电压至120mV ,跑约60min。（不能跑过下面的玻璃板）注：Mark的条带从红色条带往下依次为：70-55-40-35-20,待测蛋白的分子量再哪一区域就在哪一段剪。用绿色的切板切割待测区域，边缘留点空余，以防止切到条带。放入装有转移液的皿中浸 泡7 . 转膜（转移液可用3-4次）1） 剪四层滤纸（大小与膜相，近可大不可小）浸入转移液皿中。然后再讲其剪成与胶一致大小（胶始终 保持湿润）2） 剪PVDF膜（用上述滤纸，勿用手

6、直接接触PVDF膜），然后用甲醇活化 10s以上3） “夹三明治”再大塑料盆中加入少量转移液，将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡，夹板黑板在下、两层滤纸-胶-膜-两层滤纸（胶的大分子量条带在上方，即在右上方）4） 安装转膜装置：黑板对黑板，电极黑对黑，红对红。加入转膜液至满（否则仪器无法启动）5） 打开开关，调节电流至 100mA ,转膜2h （恒流）盆中加满冰转膜成功标志：胶上的条带均转移的膜上，胶呈无色8 . 封闭1） 配制5%脱脂奶粉：2.5g脱脂奶粉小烧杯中混匀加入皿中50mlTBST.2） 将膜取出放入上述加入了 5%脱脂奶粉中的皿中常温慢摇 60min （转移液回收其余清理掉，转移液

7、可以重复利用2次）9 . 一抗1） 用TBST配，每一格加 5ml TBST ,再分别加入抗体抗体的量:2l (Psmad2l)免抗1:10005皿5ml58 （分子量）2l (Psmad2l)免抗1:50010 gl5ml58Jnk免抗1:10005皿5ml双带内参（小鼠抗GAPH） 单抗，中杉金桥1:50001 gl :5ml362） 膜上用圆珠笔标记，分别放入小格中（正面朝上）3） 4c冰箱中，慢摇过夜（正面朝上，摇床 416室）10 .洗脱用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。11 .二抗1） 用3%的脱脂奶粉1.5g的脱脂奶粉；>小烧杯中混匀加入皿中50mlTBST

8、2） 每格吸入5ml 3%脱脂奶粉，抗体与奶粉比例均为1:5000 ,即加入1/注意：吸入微升时，一定要检查是否吸到液体，一抗用鼠抗则二抗用鼠抗，一抗用免抗二抗用 免抗3） 膜分别加入小格，慢摇 1-2h （常温）12 .洗脱用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次13.显影:U盘A液，B液（显影液。4c保存）所需物品 200 M枪+枪头（黄）< 膜（置于皿中）1） 开机后自动预冷，温度降到 1-20 C才可2） 显影液现配现用（A液：B液=1: 1）3） 膜正面朝上放于暗箱，（即大分子量再左上角）用移液枪吧显影液均匀涂在膜上4） 先点击自动曝光，看下效果，显示不清晰再手动该曝光

9、时间，内参一般显影15s （影像的条带粗细深浅一致则说明已调齐）内参好说明各步实验操作均无误，目的蛋 白结果好坏就取决于抗体的专一性。5） 每张图保存多张不同清晰度的以备用，拷贝至 U盘试剂配方:5) 30% A仃 Bic C373H )丙搐酰胺(Act)23.1 g甲叉双丙烯酰胺(Bk)。七5 g赳纯水至100 iniIR Acr 28J g,加热纯水(约80 nil),搅拌,待As溶解后,力口 Bic 075 g,溶解 后定容3 100ml,转移至硬质玻筒瓶(LOOM)中.4 c避光保存口6) L5MTris HCl (pH8 8)Tfis (MW 12LI4)4543 £超纯水

10、200 ml溶静后，用法瑟酸调pH至S3.室温保存.7) LOMTris HCl CpH7,5)Tris (MW 12J.1D30.29 s融纯水200 ml溶解后，用浓款悔调pH至7.5 (浓相战加入体枳约16血)，空犷保存，8) 0.5MTris HCl CpH6.8)Tris （MW 12144）15.14 g超纯水200 nil溶解后，川浓盐酸调pH至6a室温保存， 95 10/SDS （ I :烷基硫酸钠）SDS10 官妞触水100n】l50 C水溶，至充分溶解，室温保存（如果长期保存中出现沉淀，水溶溶化后,可 继续使用）10） 10%AP （过流酸嵌）AP0,1 g超纯水1 ml潘

11、解后,常C觥光保存,保存时间为1周.11） 20% IXvecnlOTween2O20 ml超存水80 nil混匀后，4=C保存由10%分离股（1块股）胡姓水3.94 ml3004Acr<BicK33 mlLSMTns HClpH&8）25mllO°i>SDS00p10% AP100 plTEMED6见13） 分离股（1块股） 闻纯水23 ml30%AcrBic5,0 ml1 5MT11S HC1 （pH8.8）2.5 ml10% SDS100 Lil .10% AP100贝TEMED6 Lil r14) 5%浓缩胺(2块胶)超纯水4.13 ml前Q 口 Aci Bic10 ml0 5 MTiis HC1(pH6.8)0 75 ml10% SDS60 Lil10% AP60 jdTEMED6 M15)电泳液 (1000ml)甘氨酸18.S sTris3.04 gSDS1g超纯水J 000 ml搅拌溶解后备用,应在三天内使用“16)转移液(1000 ml)廿氨酸14.4 gTiis3.04 gSDS0 7” 二.超纯水800 nil搅拌溶解后，加甲醇200 ml混勾.静置2(huin后,转移至硬质俄璃瓶中,盖上瓶