内皮克隆形成细胞旁分泌对人脐静脉内皮细胞生物学功能的影响

1、www.CRTER.org王布霖，等. 内皮克隆形成细胞旁分泌对人脐静脉内皮细胞生物学功能的影响内皮克隆形成细胞旁分泌对人脐静脉内皮细胞生物学功能的影响王布霖1，2，郭晓瑞3，李 勤2 (1南方医科大学，广东省广州市 510515；2解放军广州军区广州总医院，广东省广州市 510010；3广东省中山市第二人民医院，广东省中山市 528447)引用本文：王布霖，郭晓瑞，李勤. 内皮克隆形成细胞旁分泌对人脐静脉内皮细胞生物学功能的影响J.中国组织工程研究，2017，21(8):1221-1228.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.08.013 ORCID: 000

2、0-0001-7097-0131(王布霖)文章快速阅读：内皮克隆形成细胞条件培养基对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及成管能力的影响王布霖，男，1991年生，河南省人，汉族，南方医科大学在读硕士，医师，主要从事整形外科方面的研究。通讯作者：李勤，博士，主任医师，广州军区广州总医院，广东省广州市 510010 中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2017)08-01221-08稿件接受：2017-01-18Wang Bu-lin, Studying for masters degree, Physician, Southern Medical University, Gua

3、ngzhou 510515, Guangdong Province, China; Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA, Guangzhou 510010, Guangdong Province, ChinaCorresponding author:Li Qin, M.D., Chief physician, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA, Guangzhou 510010, Guangdong Provi

4、nce, China文题释义：内皮克隆形成细胞：内皮祖细胞的亚群，来源于骨髓，是内皮细胞的前体细胞，参与出生后血管生成。在体外培养时呈典型的“铺路石”样生长，具有克隆性，增殖能力较强。研究发现，内皮克隆形成细胞可参与生理性或病理性的新血管形成，在治疗缺血性疾病的研究中具有可观的前景。条件培养基：在细胞培养过程中，细胞可能会向培养基中分泌某些活性物质，如生长因子及趋化因子等，这种培养过某种细胞的培养基，可用于培养其他细胞或作为其他细胞培养基的添加成分，即为条件培养基。研究发现，除了自身分化为成熟细胞，干细胞还可通过分泌某些细胞活性因子改善局部微环境，对损伤组织产生修复作用。因此，干细胞条件培养基

5、在再生医学领域有着广阔的应用前景。摘要背景：研究表明，内皮克隆形成细胞移植对缺血损伤组织的血管新生具有促进作用。然而，这一作用是否与其旁分泌效应有关，仍有待进一步研究证实。目的：检测人脐血来源内皮克隆形成细胞条件培养基中细胞因子分泌谱，并观察内皮克隆形成细胞条件培养基对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及成管能力的影响。方法：从人脐血中分离、培养内皮克隆形成细胞，并进行细胞鉴定。采用抗体芯片对无血清内皮克隆形成细胞条件培养基中的细胞因子进行检测。采用无血清EBM-2培养基作为对照组，应用CCK-8、细胞划痕实验、Matrigel成管实验检测内皮克隆形成细胞条件培养基对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及成管能

6、力的影响。结果与结论：原代培养细胞形态：培养的细胞呈“铺路石”样生长，表达CD34，KDR及CD144，不表达CD45及CD133，Dil-acLDL摄取及FITC-UEA-I结合双阳性，在Matrigel基质胶中可形成管腔样结构，以上均符合内皮克隆形成细胞的特征；抗体芯片检测：内皮克隆形成细胞条件培养基高表达30种促血管新生因子；CCK-8检测：实验组人脐静脉内皮细胞在24，48，72 h增殖活性均高于对照组(P < 0.01)；细胞划痕实验结果显示，实验组人脐静脉内皮细胞迁移率在12，24 h均高于对照组(P < 0.01)；与对照组相比，实验组人脐静脉内皮细胞在Matrige

7、l基质胶上可形成更多的管状结构(P < 0.01)。结果表明：内皮克隆形成细胞能通过旁分泌效应促进成熟内皮细胞的生物活性。关键词：组织构建；内皮细胞；内皮祖细胞；内皮克隆形成细胞；细胞培养；旁分泌；条件培养基；细胞增殖；血管新生；血管生成；慢性创面愈合；国家自然科学基金主题词：干细胞；组织工程；细胞增殖基金资助：国家自然科学基金面上项目(81571910)；广东省科技计划项目(2014A020212256)；广州市科技计划项目(201607010394)缩略语：克隆形成内皮细胞条件培养基：endothelial colony-forming cells conditioned mediu

8、m，ECFCs-CM3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083Paracrine effect of endothelial colony-forming cells on biological functions of human umbilical vein endothelial cells Wang Bu-lin1, 2, Guo Xiao-rui3, Li Qin2 (1Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; 2Guangzhou Gen

9、eral Hospital of Guangzhou Military Command of PLA, Guangzhou 510010, Guangdong Province, China; 3Zhongshan Second Peoples Hospital, Zhongshan 528447, Guangdong Province, China)AbstractBACKGROUND: Endothelial colony-forming cells (ECFCs) transplantation exerts beneficial impact on angiogenesis of im

10、paired tissues caused by ischemia. However, whether this impact is related to the paracrine effect of ECFCs needs to be studied further. OBJECTIVE: To detect the cytokine secretion profile of human umbilical cord blood derived-ECFCs conditioned medium (ECFCs-CM) and explore the effect of ECFCs-CM on

11、 the proliferation, migration and tube formation ability of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).METHODS: Human cord blood derived-ECFCs were isolated, cultured in vitro, and then identified based on the previous studies. The cytokines in serum free ECFCs-CM were detected using a cytokine

12、s antibody array. HUVECs were cultured with ECFCs-CM, serum free EBM-2 as control. The proliferation, migration and tube formation abilities of HUVECs were examined by cell counting kit-8, scratch test and Matrigel assay, respectively.RESULTS AND CONCLUSION: The cultured cells demonstrated typical c

13、haracteristics of ECFCs, which showed cobblestone appearance and were positive for CD34, KDR and CD144, but not CD45 or CD133, uptook Dil-acLDL and bond FITC-UEA-I, and tube-like structures were formed on Matrigel. The cytokine antibody array showed that ECFCs-CM significantly upregulated the expres

14、sions of 30 kinds of angiogenic factors. Compared with the control group, the HUVECs cultured with ECFCs-CM showed significantly improved proliferation ability at 24, 48 and 72 hours (P < 0.01). The migration rate of HUVECs in the experimental group was significantly higher than that in the contr

15、ol group at 12 and 24 hours (P < 0.01). There were more tubular structures in the experimental group than those in the control group (P < 0.05). These results indicate that ECFCs can promote the bioactivity of mature endothelial cells through paracrine action.Subject headings: Stem Cells; Tiss

16、ue Engineering; Cell ProliferationFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81571910; the Science and Technology Program of Guangdong Province, No. 2014A020212256; the Science and Technology Program of Guangzhou, No. 201607010394Cite this article: Wang BL, Guo XR, Li Q. Paracrin

17、e effect of endothelial colony-forming cells on biological functions of human umbilical vein endothelial cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(8):1221-1228. 1223ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction创面愈合是一个由各种复杂的生物学和分子学事件有序组合构成的过程，包括细胞的迁移和增殖、细胞外基质沉积和重塑等1。这一过程中任一环节出现异常，都

18、有可能造成创面愈合延迟，甚至形成慢性难愈合创面，这不仅对患者的日常生活和心理健康造成了严重影响，同时也给整个社会带来了沉重的经济负担2-3。在创伤发生后，血管内壁的内皮细胞受到缺氧、促血管因子等的刺激，开始消化其周围的细胞外基质成分，进而通过迁移、增殖并彼此连接，延续原有血管形成新的血管结构4。血管新生不足是引起慢性难愈合创面的重要原因1，因此，促进血管新生是慢性难愈合创面的主要治疗靶点之一。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)作为内皮细胞的前体细胞，因其可通过动员、归巢、侵入及募集等参与到生理性或病理性缺血部位的新血管形成过程2，近年来备受关注。内

19、皮祖细胞主要分为2个亚群，即克隆形成单位内皮细胞(colony-forming unit-endothelial cells，CFU-ECs)和内皮克隆形成细胞(endothelial colony- forming cells，ECFCs)5。有关内皮祖细胞移植在慢性缺血性疾病中的研究已取得了令人瞩目的成果6-8，然而，将其从基础研究转化到临床应用的过程仍存在许多障碍，如移植后归巢至靶器官的细胞数量较少，利用率低9；在一些有基础疾病，尤其是心血管疾病或糖尿病的患者体内，内皮祖细胞的数量和功能都有所削弱10，自体移植效果欠佳，并且因免疫排斥反应而难以实现异体移植；此外，内皮祖细胞移植的安全性也

20、未得到明确证实11。干/祖细胞除了可自身分化成参与组织修复的成熟靶细胞外，还可通过旁分泌途径分泌一些细胞因子来改善局部微环境，间接参与损伤组织的修复12。Lin等13研究发现内皮克隆形成细胞和间充质干细胞共同移植时，前者可通过旁分泌形式经PDGF-BB/ PDGFR-信号通路降低后者的早期凋亡，并促进其成脂、成骨分化。Flex等14在后肢缺血小鼠体内移植人脐血来源内皮克隆形成细胞后发现，缺血部位新生血管密度显著增加，在局部血液循环重建过程中，人源CD31阳性细胞数目逐渐减少，而受体小鼠血浆中血管内皮生长因子，白细胞介素18，LIF，白细胞介素15及成纤维细胞生长因子等促血管新生因子持续高表达数

21、周，表明内皮克隆形成细胞可能一部分通过旁分泌途径间接促进缺血组织的内生血管修复。内皮克隆形成细胞具备一定的旁分泌能力，但其在血管新生中所起的作用以及具体机制目前尚无研究报道。实验旨在通过检测人脐血来源内皮克隆形成细胞条件培养基(ECFCs conditioned medium，ECFCs-CM)中细胞因子的表达谱，及其对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)增殖、迁移及成管能力的影响，从而证实内皮克隆形成细胞的旁分泌在血管新生中的作用，同时为ECFCs-CM通过促进血管新生治疗慢性难愈合创面方面提供理论依据。1 材料和方法

22、 Materials and methods 1.1 设计 细胞学实验。1.2 时间及地点 于2015年9月至2016年7月在解放军广州军区广州总医院医学实验科完成。1.3 材料 1.3.1 细胞 皮克隆形成细胞从人脐血中分离进行原代培养；人脐静脉内皮细胞购自美国Sciencell公司。1.3.2 人脐血标本 实验中所用脐血通过广州军区广州总医院妇产科在剖宫产或自然分娩后抽取获得，5份人脐血取自5名健康志愿者，年龄20-28岁，均经产妇本人或其家属同意，签署知情同意书。1.4 实验方法 1.4.1 人脐血内皮克隆形成细胞的原代培养及人脐静脉内皮细胞的培养 剖宫产或自然分娩胎盘取出后，用无菌注射

23、器采集脐血20-50 mL，按25 U/mL肝素钠抗凝。脐血标本采集完毕后4 h之内分离单个核细胞：在室温(25 )条件下，于离心管中加入适量Ficoll淋巴细胞分离液，将离心管倾斜45°放置，按21比例将PBS等倍稀释后的血液沿管壁倾斜缓缓加入分离液之上，注意动作轻柔，不要使两者混合；水平离心机(日本Kubota公司)760×g 去闸离心25 min，缓慢取出离心管，可见管内液体分为3层，由上至下分别为血浆、分离液及红细胞，用巴斯德吸管吸取血浆与分离液之间云雾状层，即单个核细胞层。加入5倍体积PBS，760×g 离心 8 min，弃上清，再次加入PBS重复洗涤2

24、次。用含体积分数10%胎牛血清(FBS)的EGM-2 Bullet Kit培养基(美国Lonza公司)重悬细胞并计数，以1×106 个/cm2的浓度将细胞接种于包被人纤维连接蛋白(美国Corning公司)(2.5 µg/cm2)的 25 cm2培养瓶中，置于饱和湿度，37 ，体积分数5%CO2的孵箱中培养。第4天首次换液以去除未贴壁细胞，随后隔天换液，待细胞融合率约90%时消化传代，实验均使用第3-5代细胞。倒置相差显微镜观察细胞形态并拍照记录。人脐静脉内皮细胞在含体积分数10%FBS的ECM培养基(美国Sciencell公司)中培养，实验用细胞为第8代以内。1.4.2 流

25、式细胞分析及免疫荧光染色对原代培养细胞进行鉴定 取第3-5代原代培养细胞，用体积分数0.25%胰蛋白酶消化收集，然后用含体积分数0.5%BSA的PBS重悬并计数获得单细胞悬液，细胞浓度为1×1010 L-1。分5组，每组取100 µL细胞悬液，分别加入FITC-CD34，PE-CD133，FITC-CD45，FITC-CD144(德国Miltenyi公司)和PE-KDR (美国BD公司)，4 避光孵育20 min，PBS洗涤2次，200 µL PBS重悬细胞后用流式细胞分析仪(美国BD公司)检测。另取一组细胞，按上述方法获取细胞悬液，接种于放置了细胞爬片的24孔板

26、中，孵箱中培养，待细胞90%融合时，加入2.4 mg/L的Dil-acLDL(美国Thermo Fisher公司)，37 避光孵育4 h后，PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛固定细胞10 min，再加入10mg/L的FITC-UEA-I(美国Sigma公司)，37 避光孵育1 h，PBS洗涤后取出细胞爬片，甘油封固后在荧光显微镜(日本Olympus公司)下观察，随机选取5个视野，计算双染色阳性细胞百分率。1.4.3 原代培养细胞功能学鉴定 以100 µL/孔在48孔板中铺Matrigel基质胶(标准型；美国Corning公司)，置于 37 孵育30 min使其充分凝固，消化收集培养

27、的细胞，以2×104个/孔接种于Matrigel基质胶上，37 孵育6 h后于倒置相差显微镜下观察管腔样结构形成情况，以人脐静脉内皮细胞作为阳性对照。1.4.4 ECFCs-CM的收集及细胞因子抗体芯片检测 将皮克隆形成细胞传代接种于75 cm2培养瓶中，在37 、体积分数5%CO2的孵箱中培养，待细胞融合率达到90%时弃去旧培养基，PBS洗涤3次，更换为无血清EBM-2培养基继续培养24 h，收集培养基，400×g离心10 min，温度设为4 ，离心后取上清，即ECFCs-CM，使用孔径0.22 µm的无菌滤器过滤，收集后于-80 冻存，备用。以无血清EBM-2

28、培养基(EGM-2 Bullet Kit套装中的基础培养基，不含血清、生长因子等添加物)作为对照，制备条件相同。采用人抗体芯片试剂盒AAH-CYT-G2000(美国RayBiotech公司)对ECFCs-CM中的细胞因子进行检测，芯片共包含174种人细胞因子抗体，每个蛋白有2个位点，并设阳性对照及阴性对照。步骤如下：玻片芯片每孔加100 µL封闭液，室温孵育30 min；去除封闭液，每孔加100 µL样品，4 振荡孵育过夜；芯片洗板机清洗玻片，每孔加入配制好的 70 µL生物素标记抗体，室温孵育1.0-2.0 h；重复清洗玻片，每孔加入70 µL的1 5

29、00倍稀释的荧光剂-链霉亲和素，避光室温孵育1.0-2.0 h；重复清洗玻片后，将玻片框架拆掉，用InnoScan 300荧光扫描仪(法国Innopsys公司)扫描信号，采用芯片数据分析软件进行数据分析。1.4.5 CCK-8检测细胞增殖能力 将人脐静脉内皮细胞用体积分数0.25%胰蛋白酶消化、离心，收集细胞，用含体积分数10%FBS的ECM培养基重悬计数，以103 /孔的密度接种于96孔板中，分为实验组和对照组，每组每个时间点设5个复孔，置于孵箱中培养。待细胞完全贴壁后，按分组更换培养基：实验组采用含体积分数2%FBS的ECM培养基和ECFCs-CM等体积混合的培养基，对照组采用含体积分数2

30、%FBS的ECM培养基和EBM-2培养基等体积混合的培养基，每孔液体体积均为100 µL。继续孵箱中静置培养，分别在24，48，72 h共3个时间点于每孔加入CCK-8溶液(日本Dojindo公司)10 µL，孵箱中孵育1 h，用酶标仪(美国Thermo Fisher公司)测定450 nm波长处的吸光度值。1.4.6 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 按上述方法收集人脐静脉内皮细胞，用含体积分数10%FBS的ECM培养基制成单细胞悬液，以2×105个/孔的浓度接种于6孔板中，实验组和对照组每组设3个复孔，孔板底面标记5条间距相等的平行线，便于拍照定位，待细胞长满单层时

31、换为无血清ECM培养基，去血清同步化24 h后，用200 µL枪头在孔板中划一垂直线制作细胞划痕，PBS洗涤3次去掉漂浮的细胞。然后按如上所述分组加入2 mL/孔的混合培养基，于0，12，24 h分别于倒置相差显微镜下观察、拍照，用Image-Pro Plus软件测量划痕面积，并按如下公式计算细胞迁移率：迁移率=(0 h划痕面积-12 h或24 h划痕面积)/0 h划痕面积×100%。1.4.7 Matrigel成管能力检测 以50 µL/孔在96孔板中铺Matrigel基质胶(低生长因子型)(美国Corning公司)，每组设3个复孔，置于37 孵育30 min使

32、其充分凝固。消化收集人脐静脉内皮细胞，实验组用ECM培养基和ECFCs-CM等体积混合液重悬细胞，对照组用ECM培养基和无血清EBM-2等体积混合液重悬细胞，计数并调整细胞浓度，以1×104个/孔的浓度接种细胞于Matrigel基质胶上，置于 37 孵育8 h后于倒置相差显微镜下观察管腔样结构形成情况并拍照，每孔选取5个随机视野(×200)，计算管腔样结构的数目及节点数目。1.5 主要观察指标 内皮克隆形成细胞的细胞形态、表面标志物表达率、免疫荧光双阳性表达率以及在Matrigel基质胶中形成管腔样结构的能力；ECFCs-CM中细胞因子表达谱及相对表达量；ECFCs-CM对

33、人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及成管能力的影响。1.6 统计学分析 计量资料采用±s表示，用SPSS 20.0软件进行数据分析，采用Graphpad Prism 5.0软件绘制数据图表。采用两样本t 检验分析组间数据差异，P < 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 内皮克隆形成细胞形态 倒置相差显微镜下连续观察显示，刚接种后的单个核细胞呈圆形，细胞体积较小，悬浮分布；原代培养第4天，视野内大量仍为圆形悬浮细胞，仔细观察可见少量呈纺锤形或椭圆形贴壁细胞，呈集落样生长，其增殖速度较快；继续培养至第8天时各细胞集落开始接触融合；至第14天时镜下观察细胞呈“铺路石

34、”样生长，并可见细胞相互连接形成管腔样结构；传代后细胞形态稳定(图1)，增殖能力旺盛，按13比例进行传代，可每2 d传1代。2.2 内皮克隆形成细胞的鉴定结果 通过流式细胞分析细胞表面标志物表达率，结果显示，CD34，KDR，CD133，CD45，CD144的阳性率分别为(54.50±0.57)%，(99.78± 0.04)%，(0.60±0.07)%，(0.11±0.02)%和(99.62±0.16)%，为典型的内皮克隆形成细胞表型，见图2。免疫荧光染色显示培养的细胞同时具有摄取Dil-acLDL和结合FITC-UEA-I的能力，镜下观察双染

35、色阳性细胞率为(98.95±0.49)%，见图3。原代培养的细胞与人脐静脉内皮细胞均可在Matrigel基质胶上形成管腔样结构，见图4。以上结果显示所培养的细胞符合内皮克隆形成细胞的特征。2.3 ECFCs-CM中细胞因子表达情况 人抗体芯片试剂盒AAH-CYT-G2000检测结果显示，ECFCs-CM高表达PDGF-BB，Angiopoietin-2，Angiogenin，Osteoprotegerin，白细胞介素8，uPAR，白细胞介素6，MCP-1，EGF等30种促血管新生因子，见图5。2.4 ECFCs-CM对人脐静脉内皮细胞增殖能力的影响CCK-8法检测结果显示，ECFCs

36、-CM组的人脐静脉内皮细胞在24，48，72 h共3个时间点的增殖活性均高于对照组 (P < 0.01)，见图6。2.5 ECFCs-CM对人脐静脉内皮细胞迁移能力的影响 细胞划痕实验结果显示，与对照组相比，ECFCs-CM组人脐静脉内皮细胞迁移速度较快，其中两组12，24 h迁移率差异有显著性意义(P < 0.01)，见图7。2.6 ECFCs-CM对人脐静脉内皮细胞体外成管能力的影响 与对照组相比，实验组人脐静脉内皮细胞在Matrigel基质胶上形成管腔样结构数目及节点数目均显著增高，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图8。3 讨论 DiscussionAsahar

37、a等15首次在人外周血中发现了内皮祖细胞。Hur等16根据体外原代培养时出现时间的不同，将内皮祖细胞分为早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞。在体外培养时，前者外观呈纺锤形，增殖能力较差，在Matrigel基质胶上无法独立形成管腔样结构17-19，CFU-ECs即属于此类；后者出现时间较晚，增殖能力强，且呈“铺路石”样生长，可在Matrigel基质胶上形成管腔样结构，在功能上更接近成熟内皮细胞20-21。Ingram等从人脐血分离出一种在体外具有高克隆性的内皮祖细胞，与成人外周血内皮祖细胞相比，这种细胞具有更高水平的端粒酶活性，体外培养时扩增速度较快。根据这些特性，他们称其为高增殖潜能内皮克隆形成细

38、胞(HPP-ECFCs)。目前学术界认为内皮克隆形成细胞属于晚期内皮祖细胞，它表达多种内皮细胞系表型，如VEGFR-2(亦称KDR或Flk-1)，CD31，eNOS，CD144(亦称vWF)等，而不表达造血细胞系表型CD45以及单核、巨噬细胞表型CD14，此外高表达造血干细胞表型CD34，而CD133表达较低22。此外，内皮克隆形成细胞与成熟内皮细胞一样，具有摄取ac-LDL和结合FITC-UEA-I的能力23。实验中所培养细胞特征与以上既往文献报道基本相符，但值得一提的是，目前关于内皮祖细胞的定义仍未统一，尤其是对于表面标志物的表达率尚无确切定论24。究其原因，笔者认为从不同组织分离并体外培

39、养出的内皮祖细胞并不是一种“纯化”的细胞，而是一个处于不同分化程度但功能近似且互相协同的细胞群体。因此在进行细胞鉴定时，应同时对细胞表型及功能进行检测，从而尽可能排除其他细胞的干扰。研究表明内皮祖细胞移植对于缺血性疾病具有积极的治疗作用。彭艳等25将人脐血内皮祖细胞移植到糖尿病下肢缺血大鼠体内，与对照组相比，腓肠肌溃烂及缺血明显好转，肌纤维间毛细血管密度显著增高。Park等26在无胸腺裸鼠慢性创面上移植人胚胎干细胞源性内皮祖细胞后发现，创面愈合速度明显提高，再上皮化及新生血管密度均高于对照组。这些研究提示内皮祖细胞在治疗慢性难愈合创面上具有一定的应用价值。然而，临床上慢性创面患者往往患有众多基

40、础疾病，其中以糖尿病最为多见，持续的高血糖及氧化应激等因素的存在，使得内皮祖细胞的黏附、增殖能力下降27，这给体外扩增自体内皮祖细胞带来了困难，同时，功能受损的内皮祖细胞移植后也不能发挥其正常治疗作用；而异体移植则不可避免移植排斥反应。这些给内皮祖细胞移植治疗慢性难愈合创面的临床应用带来了阻碍。大量实验表明，多种干细胞来源的旁分泌因子可改善不同组织或器官损伤造成的病理状态，其对组织的修复作用可独立于细胞本身28-32。在体外培养时，细胞通过旁分泌方式将活性因子分泌到培养基中，此培养基对其他细胞的功能具有促进或抑制作用，这种培养基被称为条件培养基。研究显示，骨髓间充质干细胞33、脂肪干细胞以及胚

41、胎干细胞的条件培养基在体外可直接用于培养其他细 胞32，34，用于研究其对疾病相关细胞的生物学功能的影响。内皮克隆形成细胞作为一种成体干/祖细胞，也具有一定的旁分泌能力13-14，且取材及体外培养扩增较为便捷，因此，从内皮克隆形成细胞的旁分泌入手，既可避免异体移植存在的风险，也为治疗慢性难愈合创面提供了一条新的途径。实验首次报道了人脐血内皮克隆形成细胞的旁分泌谱，包括PDGF-BB、Angiopoietin-2、Angiogenin、Osteoprotegerin、白细胞介素8、uPAR 、白细胞介素6、MCP-1及表皮生长因子等30种已知的促血管新生因 子12，35-36。Lacoste等3

42、7先前曾报道含有PDGF-BB、转化生长因子1、血管内皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子等细胞因子的血小板浓缩液可促进人脐静脉内皮细胞的体外增殖活性。类似地，富含血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1及SDF-1等细胞因子的脂肪干细胞培养上清液可促进人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移，并拮抗细胞凋亡作 用38。表皮生长因子是明确的可促进内皮细胞增殖的生长因子39-40。此外，血管内皮生长因子、白细胞介素641、肝细胞生长因子42、白细胞介素8可促进内皮细胞的成管作用43。结合以上研究，本实验中所采用的ECFCs-CM含有数种已知的促进内皮细胞增殖、迁移及成管能力

43、的细胞因子，将ECFCs-CM作用于体外培养的人脐静脉内皮细胞，与对照组相比，在含有ECFCs-CM的培养基中培养的人脐静脉内皮细胞，其增殖、迁移及成管能力均显著提高。这些结果证实了ECFCs-CM可通过旁分泌途径促进内皮细胞的生物学功能，从而为其在慢性难愈合创面治疗的研究提供了潜在的理论支持。作为实验的前期细胞学部分成果，该研究尚有不足，如条件培养基中具体哪些因子真正发挥了促血管新生作用，每种细胞因子的浓度是多少(抗体芯片为半定量测定)，以及尚缺少相关的体内实验研究。因此，为进一步明确ECFCs-CM对于慢性难愈合创面的治疗作用，仍需大量相关研究验证。但作者相信，内皮克隆形成细胞的旁分泌效应

44、机制研究进一步丰富了干细胞研究内容，为慢性难愈合创面治疗领域提供了新的理论依据，对疾病诊疗具有重要指导意义。致谢：感谢广州军区广州总医院医学实验科对本实验的帮助和支持。作者贡献：实验设计为第一作者。实验实施及资料收集为第一、二作者。实验评估为通讯作者。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：实验获得广州军区广州总医院伦理委员会批准，参与实验的志愿者均自愿参加，对实验过程完全知情同意并签署“知情同意书”。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和文章出现的不端行

45、为承担责任。文章中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。根据知识共享许可协议“署名-非商业性使用-相同方式共享3.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其他任何合法用途。4 参考文献 References1 Falanga V. Wound he

46、aling and its impairment in the diabetic foot. Lancet. 2005;366(9498):1736-1743.2 King A, Balaji S, Keswani SG, et al. The role of stem cells in wound angiogenesis. Adv Wound Care. 2014;3(10):614-625.3 Sen CK, Gordillo GM, Roy S, et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public hea

47、lth and the economy. Wound Repair Regen. 2009;17(6):763-771.4 Demidova-Rice TN, Durham JT, Herman IM. Wound healing angiogenesis: innovations and challenges in acute and chronic wound healing. Adv Wound Care. 2012;1(1):17-22.5 Chong MS, Ng WK, Chan JK. Concise review: endothelial progenitor cells in

48、 regenerative medicine: applications and challenges. Stem Cells Transl Med. 2016;5(4):530-538.1229ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH时间(h)吸光度值(A450 nm)图6 人脐血来源内皮克隆形成细胞条件培养基(ECFCs-CM)对人脐静脉内皮细胞增殖能力的影响Figure 6 Effect of human cord blood derived-endothelial colony-forming cells conditioned medium

49、on the proliferation of human umbilical vein endothelial cells图注：与对照组(EBM-2组)相比，aP < 0.01。图5 人脐血来源内皮克隆形成细胞条件培养基中细胞因子表达谱Figure 5 The cytokine secretion profiles of human cord blood derived-endothelial colony-forming cells conditioned medium图注：图中横坐标为细胞因子名称，纵坐标为抗体芯片平均信号强度值。500 000400 000300 000200 0

50、00100 0000平均信号强度图4 人脐血来源内皮克隆形成细胞在Matrigel基质胶上成管功能鉴定(×100)Figure 4 Functional identification of the tube formation of human cord blood derived-endothelial colony-forming cells on Matrigel (×100)图注：图A为人脐血来源内皮克隆形成细胞；图B为人脐静脉内皮细胞(阳性对照)。两组细胞均在Matrigel基质胶上形成管腔样结构，表现出典型的内皮细胞特征。图2 人脐血来源内皮克隆形成细胞表面标志

51、物表达Figure 2 Surface marker expressions of human cord blood derived-endothelial colony-forming cells图注：细胞高表达内皮系细胞表面标志物KDR及CD144，部分表达造血干细胞标志物CD34，几乎不表达CD45及CD133。图1 倒置相差显微镜下观察人脐血来源内皮克隆形成细胞的形态变化(×100)Figure 1 Morphological changes of human cord blood derived-endothelial colony-forming cells under

52、inverted contrast microscope (×100)图注：图A为原代培养第4天，见少量呈纺锤形贴壁细胞，呈集落样生长；B为原代培养第8天，细胞集落开始接触融合；C为原代培养第14天，细胞呈典型的“铺路石”样生长；D-F分别为传代后第1，5，10代，细胞形态稳定。图3 人脐血来源内皮克隆形成细胞Dil-acLDL和FITC-UEA-I双荧光染色(×200)Figure 3 DiI-ac-LDL and FITC-UEA-I double staining of human cord blood derived-endothelial colony-formi

53、ng cells (×200)图注：图A为细胞摄取Dil-acLDL后，荧光显微镜下显示为红色；B为细胞结合FITC-UEA-I后，荧光显微镜下显示为绿色；C为图A和B叠加融合，其中双荧光阳性细胞为内皮克隆形成细胞。 A0 h 12 h 24 hECFCs-CMEBM-2B图7 人脐血来源内皮克隆形成细胞条件培养基(ECFCs-CM)对人脐静脉内皮细胞迁移能力的影响Figure 7 Effect of human cord blood derived-endothelial colony-forming cells conditioned medium on the migratio

54、n ability of human umbilical vein endothelial cells图注：图A为实验组和对照组在0，12，24 h共3个时间点的细胞划痕照片；B为实验组和对照组在12，24 h两个时间点的迁移率。与对照组(EBM-2组)相比，aP < 0.01。12 h 24 h100806040200ECFCs-CMEBM-2aa细胞迁移率(%)3020100a图8 人脐血来源内皮克隆形成细胞条件培养基(ECFCs-CM)对人脐静脉内皮细胞成管能力的影响Figure 8 Effect of human cord blood derived-endothelial co

55、lony-forming cells conditioned medium on the tube formation ability of human umbilical vein endothelial cells图注：图A为实验组人脐静脉内皮细胞在Matirgel基质胶上形成管腔样结构；B为对照组人脐静脉内皮细胞在Matirgel基质胶上形成管腔样结构；C为两组人脐静脉内皮细胞形成管腔样结构的数目；D为两组人脐静脉内皮细胞管腔样结构的节点数目。与对照组 (EBM-2组)相比，aP < 0.01。D C节点数目(个)50403020100ECFCs-CM EBM-2aECFCs-CM

56、 EBM-2管样结构数目(个)6 Asai J, Takenaka H, Ii M, et al. Topical application of ex vivo expanded endothelial progenitor cells promotes vascularisation and wound healing in diabetic mice. Int Wound J. 2013;10(5):527-533.7 Bai YY, Wang L, Chang D, et al. Synergistic Effects of Transplanted Endothelial Progen

57、itor Cells and RWJ 67657 in Diabetic Ischemic Stroke Models. Stroke. 2015;46(7): 1938-1946.8 Yin Y, Liu H, Wang F, et al. Transplantation of cryopreserved human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells induces recovery of carotid artery injury in nude rats. Stem Cell Res Ther. 2015;6:37.9 Urbich C, Heeschen C, Aicher A, et al. Relevance of monocytic features for neovascularization capacity of circulating