10色方案抗体组合设计

1、多色流式检测的抗体组合设计多色流式检测的抗体组合设计流式细胞仪的基本结构流式细胞仪的基本结构u流路：流路： 流动室流动室 鞘液鞘液 sheath 样本流样本流 sample u光路：光路： 光源光源 光学收集系统光学收集系统u电路电路： 光电倍增管光电倍增管(pmt)、光电、光电二极管、二极管、 放大器（线性、放大器（线性、对数）对数） a/d 转换（光信号转换为转换（光信号转换为电信号之后的处理分析电信号之后的处理分析 道道数和电信号的脉冲转换数和电信号的脉冲转换 ）u统计：计算机统计：计算机u细胞分选系统细胞分选系统 （分选器：喷嘴，稳定液（分选器：喷嘴，稳定液流，充电电路）流，充电电路）

2、488 nm laser+-charged platessingle cells sortedinto test tubesfcs sensorfluorescence detectorflow celllaser流流 路路流动室流动室侧向及荧光信号侧向及荧光信号前向散射光信号前向散射光信号鞘液鞘液激光激光 样品管、鞘液管和流动室等样品管、鞘液管和流动室等由于鞘液的作用，待测细胞被限制在液流的轴线上流体动力学聚焦流式细胞仪的光源和光路流式细胞仪的光源和光路光光 源源 采用激光光源采用激光光源 是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照光斑直径d可由下式确定：d=4f/d。为激光

3、波长；f为透镜焦距；d为激光束直径。激光源垂直透镜（约束激光的宽度）横向透镜（约束激光的高度）形成小的椭圆形激光束流动室激光光路激光光路检测信号检测信号散射光测量原理散射光测量原理u波长与入射光一致，为细胞固有的物理及生理特性，可依此对未染色的细胞进行分析 散射光的性质散射光的性质 fs(forward scatter)fs(forward scatter)信号信号固有信号：细胞相对大小ssss(side scatter)(side scatter)信号信号固有信号：细胞相对复杂内部结构，粒度scfs外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图 （红细胞溶解后）（红细胞溶解后）散射

4、光的性质散射光的性质 荧光信号检测原理荧光信号检测原理520nmfsc sensorlaserfluorescence sensor pmt(fl)u每种荧光染料均有特定的激发波长每种荧光染料均有特定的激发波长, , 并激发后会有发射波长并激发后会有发射波长, ,流流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长式细胞仪检测的即是它特定的发射波长. . u利用各种不同波长的光学滤片来收集利用各种不同波长的光学滤片来收集( (检测检测) )这些光学信号这些光学信号 excited electronenergyemits energyas lightatom荧光素及荧光发生机理简介荧光素及荧光发生机理简介fi

5、tc荧光素的激发和发射光谱荧光素的激发和发射光谱荧光素的使用：荧光素的使用： 选择正确的激光器；确定正确的滤光片；选择正确的激光器；确定正确的滤光片； 确定所需荧光探测器确定所需荧光探测器（pmtpmt）ex 488nm em 520nm异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（fitc）520nm流式常用荧光染料流式常用荧光染料 violet blue greenyellow orange red infra-fitc520pe575ecd 615pc5665laser 488pi620400-450 l450-500 l500-570 l 570-590 l750 lpc7770epics xlfc

6、500（488nm）荧光信号荧光信号双色直接染色双色直接染色cd3-fitccd19-pe不同的荧光素标记不同的细胞抗原。不同的荧光素标记不同的细胞抗原。不同的荧光素在受到激发光激发后发射出不同波长的荧光。不同的荧光素在受到激发光激发后发射出不同波长的荧光。根据荧光波长可区分出不同细胞抗原。根据荧光波长可区分出不同细胞抗原。根据荧光信号的强弱可反映细胞抗原的表达含量。根据荧光信号的强弱可反映细胞抗原的表达含量。fitcfitcpe-cy5pe-cy5pepe荧光信号荧光信号long (700nm)(550lp)(550sp)short (500nm)dichroic filterstransm

7、itted 550 nmdiflected 90 550 nm550 nmlong (700nm)(500lp)(500sp)short (500nm)pass through filters(500/50)transmitted 500 nm475 - 525 nm wavelengths blocked500 nm500 nm525 nmshort passlong passband pass光学系统：滤光片（光学系统：滤光片（filter）荧光激发波长根据所选的荧光素而异，可通过一组不同的光学滤片传递荧光激发波长根据所选的荧光素而异，可通过一组不同的光学滤片传递到各个到各个pmt(pmt

8、(光电倍增管中光电倍增管中) )xl流式细胞仪光路图air-cooled argon ion laserbeam shaping lenseshigh sensitivityquartz flow cellforward scatterdetectorside scatterdetector525bp fl1 (fitc)575bp fl2 (pe)620bp fl3 (ecd)675bp fl4 (pc5)488dl488bk550dl600dl645dlfc500流式细胞仪光路图流式细胞仪光路图488 dl488 bk550 dl525 bp600 dl575 bp640 dl620 bp

9、675 bp流式细胞仪的电路流式细胞仪的电路u进行信号检测和分析进行信号检测和分析u荧光信号由光电接收器（荧光信号由光电接收器（pmt）接收，转变为电信）接收，转变为电信号，可分析电压脉冲的高度、面积和宽度号，可分析电压脉冲的高度、面积和宽度u电脉冲信号经电脉冲信号经a/d转换成数字信号转换成数字信号u数字信号传送到计算机，进行储存、数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、作图、 统计分统计分析析电脉冲信号的产生及光电管和检测系统电脉冲信号的产生及光电管和检测系统光电管和检测系统：放大器光电管和检测系统：放大器u基本原则 - 信号强弱差10倍or需分析弱荧光:使用对数放大器(如荧光)检测的一般

10、步骤检测的一般步骤1.1.设置检测方案（设置检测方案（protocol)protocol)2.2.染色标本（同型对照，补偿管，待测样本）染色标本（同型对照，补偿管，待测样本）3.3.同型对照管调电压同型对照管调电压4.4.电压不变电压不变，补偿管调补偿，补偿管调补偿5.5.电压不变，补偿不变，电压不变，补偿不变，上检测管检测后直接阅读上检测管检测后直接阅读结果结果电压调节利用同型对照：设置背景电压调节利用同型对照：设置背景u 电压 voltsu 增益 gain设定阴性和阳性信号强度的设定阴性和阳性信号强度的临界点临界点荧光补偿荧光补偿fitcpe受激光照射后受激光照射后fitc和和pe分子发射

11、光谱相互干扰分子发射光谱相互干扰荧光补偿的调节荧光补偿的调节fl2 - %fl1fl-1(fitc)fl-2(pe)fl1 - %fl2补偿调节利用单标样本，来消除荧光交叉原则：单管单色标记交叉调节确认电压单标记管自动计算crossover验证管补偿调节补偿调节- -最精确的全矩阵软件最精确的全矩阵软件 利用软件进行全矩阵颜色补偿（任何两个荧光检利用软件进行全矩阵颜色补偿（任何两个荧光检测通道之间都可以进行补偿）测通道之间都可以进行补偿）数据分析数据分析dot plot（双参数点图）histogram（单参数直方图） region（门） statistics（统计结果）参数影响一个成功的多色实

12、验的因素：影响一个成功的多色实验的因素：高灵敏，高分辨率的仪器高灵敏，高分辨率的仪器数据分析数据分析准确可信准确可信（kaluza）多色抗体组合方案设计多色抗体组合方案设计高质量的荧光抗体高质量的荧光抗体405nm405nm638nm638nm488nm488nmgallios/ navios gallios/ navios 流式细胞仪流式细胞仪gallios滤光片组合滤光片组合 多种抗原间的关系多种抗原间的关系影响检测灵敏度的因素影响检测灵敏度的因素检测限制检测限制抗原在细胞上的抗原在细胞上的分布情况分布情况krome orangekrome orangepacific orangepaci

13、fic orange染料荧光强度染料荧光强度荧光光谱荧光光谱空间位阻空间位阻非特异结合非特异结合制备滴定制备滴定 fitcfitcpepeecdecdpc5.5pc5.5pc7pc7apcapcapc-a700apc-a700apc-a750apc-a750pacbluepacbluekro多种荧光素为多色分析提供了可能多种荧光素为多色分析提供了可能 不同公司的荧光染料强度比较不同公司的荧光染料强度比较bcbdebiosciencebiolegenddakolife technologiespacific bluepacific blue, v450, bv421efluor450bv421p

14、acific bluepacific bluekrome orangeamcyan, v500-bv570cascade yellowpacific orangefitc, alexa488fitc, alexa488fitc, alexa488fitc, alexa488fitcfitc, alexa488pe, rd1pepeper-pepeecdpecf594-pe-tr, pe-a610pc5.5percp, percpcy5.5percp, (percpcy5.5), percp-efluor710percp, percpcy5.5percp, pecy5percp, tricolo

15、r, pecy5.5, pea700pc7pecy7pecy7pecy7-pecy7apc / alexa647apc, alexa647apc, alexa647,efluor660apc, alexa647apc apc, alexa647apca700a700a700a700-apccy5.5apca750apccy7, apch7apcefluor780apccy7-apca750(brightest on channel)kromekrome orangeorange荧光素的荧光强度荧光素的荧光强度cd8 conjugatesfitcfitcpepeecdecdpc5pc5pecy5

16、.5pecy5.5pc7pc7apcapc(various) (various) alexaalexa 700 700pacific pacific blueblue488nm (blue)638nm (red)405nm (violet)(lt) pacific (lt) pacific orangeorange(bd)apc-h7(bd)apc-h7apcalexaapcalexa 750750apcalexaapcalexa 700700sn 值（值（signal/noise）bc 荧光染料荧光染料 染色指数染色指数source: dartlab; http:/www.dartmouth

17、.edsn信噪比信噪比:mfi(pos) / mfi(neg),420.15/0.37 = 1136si染色指数染色指数:(mfi(pos)-mfi(neg)/2*sd(neg),(420.15-0.37)/2*0.23 = 913最大程度反映了对于同一荧光染最大程度反映了对于同一荧光染料的不同仪器的性能料的不同仪器的性能bc 荧光染料荧光染料 染色指数染色指数荧光素的特性荧光素的特性 crosstalk（串色）（串色）crosstalk index（串色指数）:sn(mfi(secondary channel) / sn(mfi(primary channel) * 100ci: 2.71

18、/ 1278.24 = 0.21ci: 69.46 / 1278.24 = 5.43ci: 578.48 / 1278.24 = 45.26ci: 108.29 / 1278.24 = 8.47(0.84/0.31)/(421.82/0.33)串色指数由荧光染料本身的特性决定串色指数由荧光染料本身的特性决定crosstalk index:sn(mfi(secondary channel) / sn(mfi(primary channel) * 100荧光素的特性荧光素的特性 crosstalk(串色指数串色指数)ci: 2.71 / 1278.24 = 0.21cf: 0.1ci: 69.46

19、 / 1278.24 = 5.43cf: 5.97ci: 578.48 / 1278.24 = 45.26cf: 31.28ci: 108.29 / 1278.24 = 8.47cf: 5.97cf: compensation factorcfci 荧光素特性荧光素特性 - crosstalkcrosstalk index:sn(mfi(secondary channel) / sn(mfi(primary channel) * 100弥散程度大弥散程度大ci: 2.71 / 1278.24 = 0.21cf: 0.1ci: 69.46 / 1278.24 = 5.43cf: 5.97ci:

20、578.48 / 1278.24 = 45.26cf: 31.28ci: 108.29 / 1278.24 = 8.47cf: 5.97数字化荧光补偿数字化荧光补偿通过通过logicle logicle 进行线性补救进行线性补救 ( (在低对数通道进行线性压缩在低对数通道进行线性压缩) )未补偿未补偿: :sdsdcvcv= =mfimfisd(pos) sd(neg)sd(pos) sd(neg)mfi(pos) mfi (neg) mfi(pos) mfi (neg) fl3fl3fl3fl3部分补偿部分补偿: :sdsdcvcv= =mfimfisd(pos) sd(neg)sd(pos

21、) sd(neg)mfi(pos) mfi (neg) mfi(pos) mfi (neg) fl3fl3fl3 median(pepos) = fl3 median fl3 median(pepos) = fl3 median (peneg)(peneg)正确补偿后正确补偿后: :sdsdcvcv= =mfimfisd(pos) sd(neg)sd(pos) sd(neg)mfi(pos) = mfi (neg) mfi(pos) = mfi (neg) 34%46%62%对于既定的荧光素，它有固定的发射波长，荧光补偿数值只反映相对的对于既定的荧光素，它有固定的发射波长，荧光补偿数值只反映相

22、对的pmtpmt的电压的电压. .荧光补偿荧光补偿405nm638nm“激光内”荧光补偿488nm荧光补偿荧光补偿405nm638nm488nm荧光补偿荧光补偿“激光间”荧光补偿 its just numbers !荧光补偿荧光补偿10 10 色色 distortion distortion 图谱图谱(gallios, navios) (gallios, navios) distortion 矩阵矩阵s i l e n tu n t o u c h a b l euntouchable =untouchable =其他染料没有干扰其他染料没有干扰(clean row)(clean row)si

23、lent =silent =不会漏进其他通道不会漏进其他通道(clean column)(clean column)distortion 矩阵矩阵u n t o u c h a b l eu n t o u c h a b l es i l e n tu n t o u c h a b l edistortion 矩阵矩阵untouchable =其他染料没有干扰(clean row)silent =不会漏进其他通道(clean column)u n t o u c h a b l eu n t o u c h a b l eu n t o u c h a b l es i l e n ts

24、i l e n ts i l e n tdistortion 矩阵矩阵untouchableuntouchable =其他染料没有干扰(clean row)silentsilent =不会漏进其他通道(clean column)抗原间的关系抗原间的关系 互相排斥互相排斥 互相排斥的标志可以为对方提供dump 通道unaffected limitsfor cd4-/cd8- cells抗原间的关系抗原间的关系 共表达共表达ecd+/pc5.5+的的细细胞群在胞群在 pc7 通道内通道内阴阳性界限向右移阴阳性界限向右移共表达能够影响overspill 通道阴性群的分布 cd27-pc7（logic

25、le view）(logarithmic view)抗原间的关系抗原间的关系 亲代和子代亲代和子代 是共表达和相互排斥的结合体是共表达和相互排斥的结合体这里的排斥是单向的，也可解释为没有共表达这里的排斥是单向的，也可解释为没有共表达 compensated uncompensated 正确地确定子代和亲代的位置能够确保更好的结果。正确地确定子代和亲代的位置能够确保更好的结果。抗原间的关系抗原间的关系 亲代和子代亲代和子代抗原分布抗原分布 分群明显分群明显 vs 连续表达连续表达b cellsactivated t8 cells达到最佳抗体组合的达到最佳抗体组合的6 6大法则大法则弱表达抗原选择

26、强荧光染料，强表达抗原选择弱荧光染料(“老法则”)细胞内抗原（有空间位阻）检测优先选择小分子荧光素多色检测时弱表达抗原放在被干扰较小（untouchable）的检测通道，强表达抗原放在对其他通道干扰较小（silence）的检测通道 表达互相排斥的抗原可以放在相互干扰较大的检测通道共表达的抗原避免放在相互干扰的通道上级抗原检测通道避免对下级抗原检测通道造成干扰使分析的复杂程度降到最低使分析的复杂程度降到最低淋巴瘤淋巴瘤- 1-2 - 1-2 系别抗原系别抗原- - 已知表型，但有不典型表现已知表型，但有不典型表现 - - 有些是互相排斥的表型有些是互相排斥的表型表达强度表达强度表达方式表达方式染

27、料染料/ / 通道通道分类分类表达方式表达方式染料染料/ /通道通道分类分类表达强度表达强度表达方式表达方式染料染料/ /通道通道分类分类免疫监测免疫监测- - 多系抗原多系抗原- - 大部分是已知抗原大部分是已知抗原白血病白血病- - 异常系别抗原异常系别抗原-抗原表达强度差别大抗原表达强度差别大- - 表型变化大表型变化大不同应用对抗体组合设计的影响不同应用对抗体组合设计的影响表达强度表达强度不洗涤过程不洗涤过程制备过程对制备过程对distortion 矩阵的影响矩阵的影响不洗涤过程加快数据分析不洗涤过程加快数据分析错误的抗体组合即使是进行洗涤也无法得到好的结果！错误的抗体组合即使是进行洗

28、涤也无法得到好的结果！ no washwash样本制备过程对检测的影响样本制备过程对检测的影响抗体组合设计很大程度上会影响你的结果！抗体组合设计很大程度上会影响你的结果！分析目标细胞群分析目标细胞群: cd3+cd4+cd25+ / cd3+cd4+cd38+: cd3+cd4+cd25+ / cd3+cd4+cd38+cd3+cd8+cd25+ / cd3+cd8+cd38+cd3+cd8+cd25+ / cd3+cd8+cd38+ 抗体组合设计很大程度上会影响你的结果！抗体组合设计很大程度上会影响你的结果！fitcpeecdpc5.5pc7apcapcaf700apca750pacblue

29、krorangecd4cd184cd69cd25cd279cd8cd127cd3cd57cd45抗体组合设计很大程度上会影响你的结果！抗体组合设计很大程度上会影响你的结果！fitcpeecdpc5.5pc7apcapcaf700apca750pacbluekrorangecd57cd184cd8cd25cd279cd69cd127cd45cd4cd3抗体组合设计很大程度上会影响你的结果！抗体组合设计很大程度上会影响你的结果！lets do some sensitivity workout !实验部分（“ 表型分析”）u人的人的edtaedta抗凝全血抗凝全血u单标荧光补偿抗体：单标荧光补偿抗体

30、： cd8-fitc, cd3-pe, cd5-ecd, cd19-cd8-fitc, cd3-pe, cd5-ecd, cd19-pc5.5pc5.5， cd5-pc7cd5-pc7，cd4-apc, cd8-apca700cd4-apc, cd8-apca700，cd3-apca750, cd3-apca750, cd3-pb, cd4-kocd3-pb, cd4-kou10c10c抗体组合（验证管）：抗体组合（验证管）：cd16-fitc,cd127-pe,cd19-cd16-fitc,cd127-pe,cd19-ecd,cd25-pc5.5ecd,cd25-pc5.5， cd56-pc

31、7cd56-pc7，cd4-apc,cd8-apca700cd4-apc,cd8-apca700，cd3-cd3-apca750apca750，hla-dr-pb,cd45-kohla-dr-pb,cd45-kou溶血素溶血素10c 方案方案-样本制备样本制备u标记标记1212支试管，分别为阴性对照，单色补偿和支试管，分别为阴性对照，单色补偿和1010色。色。u分别不同试管里加入对应的单色补偿试剂和分别不同试管里加入对应的单色补偿试剂和1010色混合试剂，色混合试剂，阴性对照管不加抗体，室温暗处孵育阴性对照管不加抗体，室温暗处孵育1515分钟分钟uoptilyse c optilyse c 溶

32、血素溶血溶血素溶血1010分钟分钟u加入加入pbs 300gpbs 300g离心离心5 5分钟，弃上清，加入分钟，弃上清，加入500ul pbs500ul pbs上机检测。上机检测。样本制备样本制备u阴性对照管调节电压，用阴性对照管调节电压，用flow-set 标准微球标准化标准微球标准化pmt.上机检测上机检测根据标准化信号（根据标准化信号（ flow-set beads flow-set beads ）对特异的应用和染料进行）对特异的应用和染料进行pmtpmt电压的调整。电压的调整。 标准化仪器设置可以确保可重复结果。标准化仪器设置可以确保可重复结果。( (质控血质控血) )仪器校准和标准

33、化仪器校准和标准化( (质控血质控血) )仪器校准和标准化仪器校准和标准化标准化仪器设置可以确保可重复结果。标准化仪器设置可以确保可重复结果。an26093as19123at13106仪器校准和标准化仪器校准和标准化u单标样本自动做荧光补偿。单标样本自动做荧光补偿。u10c结果分析。结果分析。上机检测上机检测筛选组合筛选组合成熟/ 淋巴细胞筛选:不成熟 / 急性白血病筛选:small samples :目的目的: : 识别如下细胞群:t cells: t cells: cd8+t cells; t regs; nave and central memory cd4+t cells; effector cd4+t cells; nk cellsnk cells; nkt cells and b cell