组织培养基础知识

1、植物组织培养技术植物组织培养技术讲授：白凤麟2013.9.5授课计划授课计划本章概要本章概要一、植物组织培养的概念二、植物组织培养类型三、植物组织培养的理论基础四、植物组织培养技术的发展历史五、植物组织培养技术的应用六、植物组织培养的意义和作用第一章第一章 组织培养基础知识组织培养基础知识第一章第一章 组织培养基础知识组织培养基础知识一、植物组织培养的概念一、植物组织培养的概念（Plant tissue culture） 指通过操作，把植物的外植体接种于人工配置的培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其成为完整植株的方法。外植体是指用于植物组织培养的接种材料，它包括植物体的各个器官、组织、细

2、胞和原生质体等。 2.植物组织培养的主要特征 （1）在培养容器中进行； （2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入； （3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。 （4）通常打破了正常的植物发育过程和格局。 二、植物组织培养类型：二、植物组织培养类型： 根据不同分类的依据可以分为不同类型。根据不同分类的依据可以分为不同类型。 1 1、根据培养材料不同分为：、根据培养材料不同分为： （1 1）完整植株培养（）完整植株培养（Plant CulturePlant Culture）：对幼苗和较大植株等的培养。）：对幼苗和较大植株等

3、的培养。 （2 2）胚胎培养（）胚胎培养（Embryo CultureEmbryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。培养。 （3 3）器官培养（）器官培养（Organ CultureOrgan Culture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。器官的培养。 （4 4）组织培养（）组织培养（Tissue CultureTissue Culture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。养。 （5 5）细胞培养（）细胞培养（Cell CultureCe

4、ll Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。 （6 6）原生质体培养（）原生质体培养（Protoplast CultureProtoplast Culture）：指对去掉细胞壁后所获得的）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。原生质体进行培养。 矮牵牛茎尖离体培养培矮牵牛茎尖离体培养培养养 牡丹成熟胚的离体培养与快速繁殖牡丹成熟胚的离体培养与快速繁殖Mature embryo culture and rapid propagation of tree peony微型月季茎段离体培养微型月季茎段离体培养花烛叶片离体快速繁殖花烛叶片离体快速

5、繁殖大蒜根尖培养及植株再生大蒜根尖培养及植株再生大蒜试管鳞茎诱导大蒜试管鳞茎诱导人参细胞悬浮培养人参细胞悬浮培养非洲紫罗兰原生质体分离、培养及植株再生非洲紫罗兰原生质体分离、培养及植株再生2 2、根据再生途径分为：、根据再生途径分为：（1 1）器官发生途径）器官发生途径（Organogenesis）：）： 直接器官发生途径直接器官发生途径：植物器官可以直接由外植体上诱导。如茎尖培养。直接从外植体的细胞形成器官原基，然后发育成器官。 间接器官发生途径间接器官发生途径：成熟细胞经过脱分化（dedifferentiation）及再分化（redifferentiation）过程而形成新的组织和器官的过

6、程。先形成愈伤组织，再由愈伤组织产生不同的器官原基，后形成不同器官。如叶片培养。（2）体细胞胚胎发生（）体细胞胚胎发生（Somatic embryogenesis）：）： 体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生途径是指二倍体或单倍体的体细胞在特定条件下，未经性细胞融合而通过与合子胚发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程。经体胚发生形成类似合子胚的结构称为（embryoid）或体细胞胚(somatic embryo). 直接器官发生直接器官发生 间接器官发生间接器官发生体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生贯叶金丝桃不定芽直接再生过程贯叶金丝桃不定芽直接再生过程 优化培养基优化培养基 无蔗糖无蔗糖 1%蔗糖蔗糖

7、5%蔗糖蔗糖 无无BAP BAP 0.1mg/l BAP 5.0mg/l 无无NAA非洲紫罗兰叶片培养非洲紫罗兰叶片培养台湾百合离体培养台湾百合离体培养大花蕙兰原球茎增殖与植株再生大花蕙兰原球茎增殖与植株再生 器官发生途径（原球茎的形成）：器官发生途径（原球茎的形成）： 大蒜愈伤组织培养大蒜愈伤组织培养 日本牵牛花的离体培养日本牵牛花的离体培养禾本科牧草的体胚发生过程禾本科牧草的体胚发生过程菊花体细胞胚胎发生及植株再生菊花体细胞胚胎发生及植株再生大蒜体细胞胚胎发生过程大蒜体细胞胚胎发生过程 人工种子人工种子（Artificial seedArtificial seed，Synthetic Se

8、edSynthetic Seed）：）：是指植物离体培养产生的胚状体或不定芽被包是指植物离体培养产生的胚状体或不定芽被包裹在含有营养和保护功能的人工胚乳和人工种裹在含有营养和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。作为繁皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。作为繁殖材料。殖材料。人工种子胚状体人工种皮人工胚乳自然种子胚种皮胚乳3 3、根据培养基的类型分为、根据培养基的类型分为: : （1 1）固体培养（固体培养（Solid cultureSolid culture）: : 琼脂、卡拉胶等固琼脂、卡拉胶等固化。化。 （2 2）半液半固体培养）半液半固体培养(Semisolid C

9、ulture)(Semisolid Culture)：固液双：固液双层。层。 （3 3）液体培养）液体培养(Liquid Culture)(Liquid Culture)：震荡、旋转或静置：震荡、旋转或静置培养。培养。液体培养的优点：液体培养的优点： A 不使用凝固剂，节约生产成本不使用凝固剂，节约生产成本 B 营养吸收充分；营养吸收充分； C 操作过程简化。操作过程简化。固体培养：固体培养：液体培养液体培养体胚液体培养体胚液体培养 不同类型液体培养装置不同类型液体培养装置 液体培养体系液体培养体系菠萝种苗液体培养系统菠萝种苗液体培养系统 丹参毛状根培养丹参毛状根培养4 4、根据培养的过程分：

10、、根据培养的过程分：（1）初代培养（第一代培养）：指将从植物体上分离下来外植体作第一次培养。（2）继代培养：指第一次培养以后将培养物转移到新的培养基上进行培养。三、植物组织培养的理论基础三、植物组织培养的理论基础 1902年由Haberlandt提出，即植物体细胞在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖、发育成完整植株的能力。l植物细胞全能性的证明是通过1958年Steward等胡萝卜根段细胞体胚发生试验及1964年Guha等进行的曼陀罗花药培养。 l也可以理解：指植物的每个细胞都具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。细胞全能性的相对性 茎尖、根尖及形成层细胞表皮细胞及各种薄壁细胞筛管、导

11、管、气孔保卫细胞通常情况下不分裂，但在受到外界刺激后可重新启动分裂 永久失去分裂能力的终端分化细胞始终保持分裂能力l根据细胞类型不同从强到弱: 营养生长中心形成层薄壁细胞厚壁细胞（木质化细胞）特化细胞（筛管、导管细胞）l根据细胞所处的组织不同从强到弱： 顶端分生组织居间分生组织侧生分生组织薄壁组织（基本组织）厚角组织辅导组织厚壁组织细胞全能性的相对性 植物细胞全能性理论是植物组织培养的核心理论。离体细胞具有生命的特征属性，在全能性的基础上，提供合适的营养和环境条件，离体细胞经历脱分化（dedifferentiation）和再分化（redifferentiation）过程，可形成再生植物。 细胞

12、全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现。也称去分化，指离体条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或不分化细胞的过程。l如叶柄基部的薄壁细胞成为离层细胞；伤害导致局部细胞形成愈伤组织。影响脱分化的主要因素：影响脱分化的主要因素：（1）损伤。切割损伤的刺激，促使细胞增殖。 （2）在诱导愈伤组织时常加入生长素类，但同时配合细胞分裂素的效果可能更好。 （3）弱光或黑暗条件有利于脱分化中的细胞分裂。 （4）细胞位置。外植体本身的各类细胞可能

13、对培养条件的刺激有不同的敏感性。（5）外植体的生理状态。不同生理年龄和不同季节都会有不同的培养反应。（6）植物种类的差异。 一般双子叶植物比单子叶植物及裸子植物容易。 在细胞脱分化过程中，大多数情况下形成愈伤组愈伤组织织。愈伤组织的细胞往往是异质性的，无明显极性，其形成过程可分为诱导期、分裂期和分化期。 （1）概念 ：指离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官，甚至形成完整植株。（2）组织培养中的再分化包括下面4个水平： 细胞水平的再分化 组织水平的再分化 器官水平的再分化（器官发生） 植株水平的分化（植株再生）l组织水平的再分化：在高水平生

14、长素条件下，最常见的是微管束（Vascular tissue）的分化。松散的愈伤组织内含大量拟分生组织或瘤状结构；致密的愈伤组织内组织分化很少，大多由高度液泡化的细胞组成。 l器官水平的再分化：由分化出的不同组织形成各种器官，如芽、茎、叶、根等。（3）影响细胞再分化因素： 从理论上讲，在离体培养条件下经过再分化可获得各种类型的细胞、组织、器官以及再生植株。但是目前，还不能让所有植物的活细胞都再生植株。主要原因是： 1）不同植物种类再分化的能力差异很大； 2）对某些植物再生条件还没有完全掌握。脱分化和再分化的比较：植物细胞的再生性 在植物中很多是靠种子生长来产生完整的植株，但也有不少可通过根、茎

15、、叶等器官再生而成为完整的植株，这种特性叫细胞的再生性。细胞的再生性。 为什么在自然条件下，一些植物的营养器官和细胞难以再生呢？ 这主要是由于内源激素调整缓慢或不完全，外界条件不易控制等因素所致。在人工控制的条件下，通过对培养基的调整，特别是对激素成分的调整，就有可能顺利地再生。 四、植物组织培养技术的发展历史四、植物组织培养技术的发展历史 1、 早期探索阶段早期探索阶段 （1930年以前）年以前） 1893年，Schwann和Scheiden提出细胞学说及植物细胞全能性理论。 1902年，德国植物生理学家Haberlandt第一次尝试采用植物组织培养技术对小野芝麻、风眼兰叶肉组织及万年青属植

16、物的表皮细胞进行培养，但未能培养成活。 1904年，Hanning首次对十字花科的萝卜和辣根的胚培养成功。 1922年，Knudson将兰花种子在离体的条件下非共生萌发。同年，Knotte和Robbins对离体根尖进行了培养。Robbins还对豌豆、玉米及棉花的茎尖进行了培养，只形成一些缺绿的叶和根。 1925年，Laibach利用胚培养技术对亚麻的种间杂种胚进行了培养，并于1929年利用亚麻的胚培养来克服杂交不亲和性。2、植物组织培养技术的初步形成（、植物组织培养技术的初步形成（1930-1960年）年） 1933年，我国植物生理学家李继侗培养银杏胚胎，并发现银杏胚乳提取液可促进离体胚的生长

17、。 1937年，White发现B族维生素对离体根培养的重要性。并指出IAA对植物生长发育的控制起重要作用。 1937,1938年，Gantheret在培养基中加入上述生长因子，使得柳树形成层诱导形成的愈伤组织连续生长。Nobecomt对烟草种间杂种茎段的形成层细胞培养也得到了类似的结果。 1948年，Skoog等通过对烟草茎段和髓培养发现，不定芽和不定根的发生由生长素/腺嘌呤的比例决定。 1950年，Ball从红杉愈伤组织培养中再生获得器官。1952年，Morel和Martin通过分生组织培养获得大丽花的脱毒植株，同年，首次应用微型嫁接技术。1953年，Tuleche首次从花粉培养中获得银杏的

18、单倍体愈伤组织。1955年，Miller等发现了一种促进细胞分裂的植物激素激动素，后来发现激动素可用来代替腺嘌呤促进芽的形成，而且其效力比后者高3万倍。1957年，Skoog和Miller发现改变细胞分裂素/生长素比例，可以控制根和芽的发生。1958年，Maheshwari和Rangaswamy从柑橘胚珠的珠心组织培养中再生获得体细胞胚；同年，Reinert 和Steward分别从胡萝卜的愈伤组织和细胞培养中再生得到原胚，为以后的组织培养中器官发生和体细胞胚胎发生奠定了基础，也为植物细胞全能性理论提供了证据。3、植物组织培养技术的发展（、植物组织培养技术的发展（1960年以后）年以后）1960

19、年，Morel利用兰花茎尖培养对兰花进行营养繁殖； 1962年，Murashige和Skoog开发出最著名的Murashige和Skoog培养基（MS基本培养基），并被后来广泛采用的基本培养基。1964年，印度人Guha和Maheshwari利用曼陀罗花粉培养获得第一例单倍体植株。从而开辟了单倍体育种技术。1971年，Takebe等获得第一例原生质体培养的再生植株。1972年，Carlson等利用原生质体融合在两个烟草属中进行种间杂交。1974年，Murashige等利用细胞分裂素诱导茎尖侧芽分枝。Zaenen和Larebeke分别发现土壤农杆菌（Agribacterium）中的根瘤诱导的主要

20、成分是Ti质粒。1978年，Melchers等进行了番茄和马铃薯的体细胞杂交。1979年，Marton提出了利用植物原生质体和土壤农杆菌共培养的方法进行转化。1981年，Larkin和Scowcroft引入“体细胞无性系变异（Somaclonal variation）”这一术语。1982年，Krens等的工作证明，原生质体可以摄入裸露的DNA，表明可以用外源DNA对原生质体进行遗传转化。1982年，Zimmermann利用电刺激进行原生质体融合。1985年，Horsch等用土壤农杆菌对叶盘进行感染和转化，并得到再生的转化植株。五、植物组织培养技术的应用五、植物组织培养技术的应用1、优质种苗的快速无性繁殖： （1）无性繁殖作物及不易繁殖作物的快速繁殖园艺植物种苗工厂化生产园艺植物种苗工厂化生产兰科植物生产兰科植物生产花烛属植物花烛属植物厥类植物厥类植物盆栽及切花植物的繁殖盆栽及切花植物的繁殖珍贵树种珍贵树种无菌苗快速繁殖无菌苗快速繁殖无菌苗驯化无菌苗驯化组培苗驯化移栽组培苗驯化移栽茎、芽和小植株的规模培养茎、芽和小植株的规模培养 经济植物快速繁殖经济植物快速繁殖 （2）通过茎尖培养生产脱毒健康种苗：如草莓、香蕉、通过茎尖培养生产脱毒健康种苗：如草莓、香蕉、