酶工程复习资料

1、,酶的分类和命名酶的定义生物催化剂：是各种动植物、微生物来源的酶或微生物菌体，其被生物体用于自身新陈代谢，维持各种活动和功能。工业用生物催化剂是游离或固定化的酶或活细胞的总称。生物催化剂有很大优势，其能在常温常压下反应、催化效率更高、催化作用专一，其活力受到调控、与辅因子有关，但容易失活。酶enzyme：酶是由活细胞产生的能加快反应速度并且具有催化转移性的蛋白质或RNA和DNA，代谢中的各种反应都是在酶的参与下进行的，没有酶就没有生命。酶的本质：绝大多数酶的化学本质是蛋白质，也有一些酶的化学本质是RNA和DNA。酶的分类根据酶催化作用类型，把酶分成6大类。类型种类催化作用类型氧化还原酶类

2、60;570种RH + R (O2)=R + RH( H2 O)转移酶类 490种RG + R=R + RG水解酶类 560种RR + H2O=RH + ROH裂合酶类（解合酶类） 240种  RR=R + R异构酶类 85种R=R合成酶类（连接酶类） 80种 R+R+ATP=RR+ADP (AMP) +一、氧化还原酶类特点：1

3、. 催化氧化还原反应，H离子，电子转移 2. 生物体内起氧化产能，解毒和某些物质形成3. 经常有辅酶参与，有光电性质变化a)脱H酶 Dehydrogenase 催化：RH + R= R + R´H 分解代谢脱H酶 NAD+ 还原性合成代谢脱H酶 NAD(P)+ 有些没有严格区分 b)氧化酶 Oxidase1催化：RH + O2 = R + H2O2 需要FMN,FAD作辅基2催化：RH + O2 = R + H2O 金属蛋白，细胞色素氧化酶。c)过氧化物酶 Peroxidase 需要FAD,硒蛋白、血红素等作辅基,催化H2O2过氧化物分解与转化(过氧化物歧化酶，解毒)d)氧合酶 需要

4、Fe2 ,NAD(P)+，黄素蛋白为辅基，催化氧原子参入有机分子，分二大类, 根据H供体数目分 e)中间电子递体，参与生物氧化，氧化磷酸化，这类物质通过自身氧化还原把氧化酶，还原酶连接起来，组成呼吸链 这类递体包括：1.黄素蛋白 催化 H从NADP+或其他底物转入线粒体呼吸链受体这类中间电子传递体已划属脱氢酶。2.铁硫蛋白： 血红素蛋白，如过氧化物酶； 含铁蛋白，如一些氧合酶； 铁硫蛋白，是铁离子与蛋白质含硫的配位体结合而成，分两类。一是简单铁硫蛋白（仅包含一个或几个Fe-S从，下分红氧还蛋白、铁氧还蛋白等）；二是复合铁硫蛋白（带有外加的活性基团，如黄素、血红素等）。3.细胞色素： 氧合酶，氧

5、化酶，中间电子递体Cyt b,c,c1 等。4.脂溶性维生素： 辅酶Q(Co Q)，还原型于290nm、氧化型于275有吸收峰；不与特定蛋白结合就可传递电子。二、转移酶类催化功能基团从一分子化合物转到另一分子化合物 特点： 1）参与核酸，蛋白质，脂肪代谢提供中间体 2）催化辅酶，激素，抗生素的合成转化 3）使一些分子从潜在状态转变为功能状态 4）大多要辅酶，没有光电变化转移酶分八类： 一碳物，酮醛基， 酰基，糖苷基，羟基，含氮基，含磷基，含硫基1.一碳物又分几个亚类(1) 甲基转移酶：参与生理活性物质形成，起代谢调节，为酶活性调节的重要方式(2) 羟甲基，甲酰基转移酶(3) 羧基，氨甲酰基转移

6、酶 (4) 咪基转移酶 2.酮基，醛基转移酶 在光合作用，戊糖支路代谢中的重要酶 3. 酰基转移酶 需要辅酶A 与脂肪代谢，糖代谢，蛋白质代谢有关 乙酰辅酶A转移酶乙酰辅酶A + 乙酰辅酶A 乙酰乙酰辅酶A + 辅酶A 肽酰转移酶(翻译过程中肽链延伸)肽酰-tRNA1 + 氨基酰tRNA2 tRNA1 + 肽酰氨基酰tRNA2 4 糖苷酰转移酶习惯上叫“磷酸化酶”,与糖代谢,核酸代谢有关，催化己糖基或戊糖基转移。5 羟基转移酶催化羟基及其衍生物转移，与异戊二烯，某些维生素形成有关。6含氮基转移酶与氨基酸代谢有关，需要辅酶，磷酸吡哆醛，作用是先形成活泼的Schiff碱键 N=CH-，再根据酶作用

7、特性形成相应反应，转移氨基R1CHNH2R2 + R3COR4 _R1COR2 + R3CHNH2R47 含磷基转移基是相当重要的一类酶， 1 与糖代谢有关 2 催化核酸合成3 催化某些生理物质（辅酶）形成4 从潜在分子转为有功能分子a) 以ATP为磷酸基的供体的转移，习惯上也叫xx激酶 胸苷激酶 ATP+胸苷 =ADP+胸苷-5-磷酸， 蛋白激酶 ATP+蛋白质= ADP+磷酸化蛋白质要点： 1.蛋白质的磷酸化是生物活性调节机制之一 2.该蛋白激酶是催化磷酸基转移，与酶原激活时用的蛋白水解酶不同（如尿激酶，肠激酶） 3.约有1% 基团编码蛋白激酶，已知有近百种b)焦磷酸转移 与辅酶形成有关

8、硫胺焦磷酸激酶 ATP + 硫胺素AMP+硫胺素焦磷酸c)核苷酸转移 与核酸物质合成有关(1)   RNA核苷酰转移酶 RNA多聚酶 nNTP= nPPi + RNA依赖于DNA的RNA多聚酶，转录Transcription 依赖于RNA的RNA多聚酶，RNA病毒复制作用 (2)   DNA核苷酰转移酶 DNA多聚酶 ndNTP= nPPi + DNA 依赖于DNA的DNA 聚合酶 ，DNA复制 依赖于RNA 的DNA 聚合酶 ，反转录d) 变位酶 催化同一分子内部在不同C原子间转移基团 -D-葡萄糖-1- Pi-D-葡萄糖-6- Pi8) 含硫基团转移

9、酶 三、水解酶类特点：1 体内起降解任务，酶大多集中于溶酶体中 2 应用极广的一类酶 3一般不要辅酶，但要Ca+，Cl- 等，没有则会影响酶活性水解酶分11亚类 （酯酶，糖苷酶，醚键酶，肽 酶，肽键外的-C-N-键酶，酸酐键酶，-C-C-键酶，卤素键酶，-P-N-键酶， -S-N-键酶，-C-P-键酶）a) 酯酶：羧酸酯键，磷酸酯键（酸性，碱性）专一性差 5核苷酸酶，3 核苷酸酶，专一性高 限制性内切酶 乙酰胆碱酯酶 ：乙酰胆碱起神经传导作用b) 糖苷酶： 特点：1糖苷键水解，2应用极广 淀粉酶（多酶混合物）- 淀粉酶：主要切（任意）-1,4糖苷键成短链糊精，不水解1,6糖苷键- 淀粉酶：从非

10、还原端开始依次切-1,4糖苷键，在分支处停止 产物为-极限糊精，-麦芽糖葡萄糖淀粉酶: 从非还原端开始依次切-1,4糖苷键, 1,6糖苷键, 产物为-葡萄糖异淀粉酶：切分支端-1，6糖苷键，成短的直链淀粉纤维素酶(多酶混合物）：C1,Cx, 葡萄糖苷酶,作用-1,4葡萄糖苷键, C1酶 切开纤维素链间H键 Cx切 单链纤维素分子的葡萄糖苷键，产物为纤维二糖 天然纤维素链纤维素分子纤维二糖葡萄糖半纤维素酶（多酶混合物）：木聚糖酶，阿拉伯聚糖酶，果胶酶：分解植物细胞间质果胶质的一类酶C）溶菌酶 水解粘多糖中N-乙酰胞壁酸(NAN)和N-乙酰氨基脱氧-D-葡萄糖(NAG)间的连接d）肽酶 催化肽酶水

11、解 作用方式： 1. N , C 端水解称端肽酶(氨肽酶，羧肽酶）水解对其邻近基团有要求（专一性） 2肽内部水解称蛋白酶 1）分布上有差异，水解酶类在溶酶体中，加工修饰酶 集中于内质网，信号肽酶加工酶, 集中于质膜 2）酶原激活 蛋白酶切去一小部分肽，体内需要时 酶原成为有活性酶，起生理作用 胰蛋白酶原，切去n个氨基酸后，成为有活性的酶形式，这种激活在体内以紧密相关的酶以联级方式实四、裂合酶类特点：非水解性 ( 非氧化性 ) 分解RRR+R系统命名: 底物 + 基团 + 解合酶 ( 丙酮酸 + 羧基 + 解合酶 )习惯命名: 丙酮酸脱羧酶 羧基解酶 或 脱羧酶 分6类-C - C - 羧基解酶

12、 也称 脱羧酶, 需辅酶 aa 脱羧 磷酸吡哆醛 -酮酸脱羧 硫胺素焦磷酸（TPP）-C - O - 往往也为 ××水合酶 水分子加入或脱出反应物 如L-Ser脱水酶 丙酮酸+H2O+NH2， 脱水中拌有脱氧-C - N - 非水解性， 非氧化性脱氧 -C - S - -C - X -五、异构酶类特点:1分子异构化 产生中间产物，区别在于底物分子2不需辅酶 例：1）消旋酶 L-gluD-glu 2）顺反异构酶 全-反-视黄醛 11-顺-视黄醛 3）醛酮异构酶 D-葡萄糖-6-P D-果糖-6-P 4）分子内转移酶 D-甘油酸-3-Pi D-甘油酸-2-Pi 差别：转移酶类要

13、辅助因子 异构酶类不要 六、合成酶类特点：1. 需ATP参与 2. 需Mg2+等金属离子 R+R+ ATPRR+ADP/AMP 分5个亚类 C C 需生物素：如丙酮酸羧化酶 C O C S C H C N 酶的多形性和同工酶许多酶虽然结构和组成，物理化学性质有所不同，但是可以催化相同的反应，这种现象叫酶的多形性 1）    酶的多样性： 催化相同反应, 但结构、化学、物理性质、催化特性有所不同的一类酶 第一类是同工异源酶 不同生物来源，分子量、理化性质不同，功能相同 第二类是同工多形酶 同一生物来源（细胞质、线粒体）得到的苹果酸脱氢酶 2） 同工酶 存在

14、于生物的同一种属或者同一个体的不同组织，甚至同一组织或者同一细胞催化相同反应，但结构、理化性质、催化特性有所不同的一类酶 1不同基因编码的蛋白质 2二条或二条以上多肽以非共价键形成杂聚体 3等位基因突变蛋白质形成1. 进化 1）分化进化-共同祖先，在进化中有某些不影响酶催化活性的变化 2）趋同进化-不同祖先，在进化中有趋于相同或相近的催化活性中心，在酶结构上，理化性质上可能相似或很不同2等位基因突变：酶蛋白一级结构上个别氨基酸残基突变而不同，但其性质相似3介于12二类的杂聚体 酶分子结构与功能 结合底物作用(结合基团) R1,R2,R6,R8,R9,R164,R165酶的结构接触残基催化作用(

15、催化基团) R163活性中心辅助残基R4活性中心外(结构残基) R10,R162,R169必需基团非必需基团R3,R5,R7 参与活性中心频率最高的氨基酸:Ser, Cys, Tyr, Asp, Gly, Lys.活性中心活性中心active center：酶分子上与催化活性直接相关的少数氨基酸残基组成的催化区域，有底物结合位点。活性中心一般是由少数几个氨基酸残基组成，在一级结构上，这些氨基酸残基可能并不相邻，甚至相距很远，位于同一条肽链的不同部分或者不同的肽链上，通过肽链的折叠、盘绕，而在空间上位置相互靠近，构成一定的空间区域。酶活性中心有两个功能部位，即结合部位和催化部位。结合部位与底物结

16、合，决定酶的专一性；催化部位催化底物键的断裂和产物键的形成，是底物发生化学变化的部位，决定酶的催化能力和化学反应的性质。对于需要辅助因子的酶来说，辅酶或辅基的一部分往往也是酶活性中心的组成部分，金属酶中的金属离子往往也是活性中心的组成部分。酶活性中心一般位于酶分子表面的裂缝、空隙、口袋内，底物分子全部或部分结合到该空隙内，发生催化作用。活性中心不是一成不变的、刚性的，而具有一定的可变性和柔性。酶与底物结合的特异性一定程度上取决于酶活性中心与底物在结构上的互补性。活性中心有如下特点：1. 活性中心在种系进化上有严格保守性2. 酶活性中心构象的维持依赖于酶分子空间结构的完整性3. 酶活性中心各基团

17、的相对位置得以维持,就能保全酶的活力酶促反应动力学反应系统v 一、最简单的均相反应系统：v 1、零级反应：反应特点：（1）反应速度与反应物浓度A无关。（2）A与t为线性函数关系。（3） k1的单位为：浓度（mol/L或mmol/L）/时间（s或min）v 2、一级反应反应特点： （1）反应速度与反应物浓度A呈正比。 （2）A与t为半对数函数关系。 （3） k1的单位为：s-1或min-1）v 二、均相可逆反应系统：V三、均相双分子不可逆反应系统：反应特点： （1）反应速度与 A 和B有关。 （2）A与t为半对数函数关系。 （3）k1的单位为：1/(s·mol/L或min·

18、mmol/L ）如B>>A，B B 0，上式可简化为一级反应方程：v 四、均相双分子可逆反应系统： （Keq为无因次常数。）酶促反应稳态与前稳态酶(E)促单底物反应: 反应历程: 在最初极短反应时间(t1)内, P极低, 逆反应(E+PS)可以忽略不计.因此: ES(酶-底物复合物)生成速度ES分解速度=ES净生成速度 =ES生成速度-ES分解速度t=0, ES=0, P=0, S最大,ES生成速度最大,0t1内, S , P , ES , 到t1时,达到恒定.ES生成速度, ES分解速度, ES净生成速度t1 t2内, S , P , ES (稳态或恒态) ES生成速度= ES分

19、解速度, ES净生成速度t2后, ES Km 米氏常数1. 推导过程（1）推导过程中的反应速率均指反应初速率，在此阶段产物P的量很少，因此E+P形成ES的速率极小，该反应步骤可以忽略。（2）底物浓度大大高于酶浓度，因此酶底复合物ES浓度远小于底物浓度，游离底物浓度近似等于底物浓度。（3）假设ES的产生和分解速率相等。（推导中利用了此等式）（若假设E+S生成ES的反应是平衡的，即k2<<k1，ES的分解不足以破坏这个平衡，则有v=vmax*S/(Ks+s) 其中Ks=k-1/k1，为ES的解离常数）2.米氏方程反映了酶反应速率与底物浓度之间的定量关系。v=vmax*S/(Km+s)。

20、当v=0.5Vmax时，0.5Vmax=Vmax【S】/(Km=【S】)0.5=【S】/(Km+【S】)Km=【S】。即Km值是酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L，与底物浓度单位一样。3.Km的物理意义1 特定的反应，特定的反应条件下，Km是个特征常数，与酶浓度无关，可部分描述酶反应性质、反应条件对酶反应速度的影响。故可用来鉴别不同的酶。1/Km表示酶与底物的亲和力，Km越大，亲和力越小，反之越大。当v=V/2时，Ks=S。表明Km相当于反应达到最大速度一半时的底物浓度，或者说，相当于要使反应系统有一半的酶分子参加反应所必须具有的底物浓度。通过Km可判断酶的最适底物

21、，因为最适底物具有最大的V/Km。通过Km可了解酶的底物在体内可能具有的浓度水平。一般酶<<Km,那么v<<V,大部分酶处于浪费状态; 反之,如果S >>Km,那么vV，S将失去其生理意义。通过体外测定某些物质对Km的影响，可以推断出该物质可能有的生理效应，如作为抑制剂或活化剂等。4.活力和比活力活力enzyme activity：酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力的大小可以用一定条件下酶所催化的某化学反应的反应速率来表示。酶活力的大小用酶活力单位U来表示。1961年提出的“国际单位”IU：在特定的条件下（25，pH、底物浓度等其他条件均为最适条件）

22、，1分钟能转化1微摩尔底物所需的酶量。1972年推荐的新的酶活力单位：Katal（简称kat），其规定是：在最适反应条件下，每秒钟催化1mol底物转化为产物所需要的酶量为一个Kat，即1kat=1mol/s。kat单位与IU单位之间的换算关系为：1kat=60*106 IU酶的比活力（specific activity）：每毫克蛋白所含的酶单位数，用U/mg蛋白表示，用来表示酶的纯度，也与酶的稳定性有关。酶活力、比活力实际操作中的意义酶的活力高低可以反应酶的总量（总活力），酶活性的高低是研究酶的特性、进行酶抑制剂生产和应用时的一项不可缺少的指标。对同一种酶来说，比活力越高，酶的纯度越高。酶的比

23、活力与酶的稳定性有关，酶的稳定性越差，比活力下降越快。5.酶的转换数1.分子活性定义：在最适条件下，每摩尔酶每分钟所转变的底物摩尔数（即每摩尔酶的酶单位数）。2.对于寡聚酶：在最适条件下，每摩尔活性亚基或催化中心每分钟所转变的底物摩尔数。3.用min-1表示。4.kcat=Vmax/Et生理条件下S << Km， Vmax = kcat E 代入米氏方程 v = kcat E S / Km + S = kcat E S / Km得出：v = kcat / KmESkcat / Km为E和S反应形成产物的表观二级速度常数，单位：L/mol s。可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催

24、化效率kcat / Km大小可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。6.米氏方程对酶反应速度和底物浓度间关系的描述 米氏方程的Km值意义（1）酶反应的反应速度和底物浓度直接相关；（2）底物浓度决定着酶系统的反应级别；（3）衡量这种关系的尺度是Km；7.米氏方程与底物和酶浓度的关系、特点反应全过程和逆反应：当产物不产生抑制，逆反应不进行，反应全过程仅由底物浓度的降低决定时，米氏方程的积分式可用来描述反应全过程；当反应进行到一定时间后，随着产物的积累，逆反应不可忽视。高底物浓度引起抑制；高底物浓度引起活化高酶浓度：在推导米氏方程中必须假定，底物浓度大大高于酶浓度，因此，在酶与底物混合后，酶

25、-底物络合物能迅速达到稳态平衡。这种假定在体外很容易得到满足，但体内就不同，许多酶和它们的底物在细胞中浓度往往接近于Km的水平。对于这种高酶浓度的反应系统，米氏方程已经不完全适用。酶浓度对酶促反应速度的影响：当S>> Km 时，v达到V，vE呈线性关系，即酶速度与反应速度成正比关系。这种线性关系的两个保证条件：必须是初速度必须用高底物浓度，S>100Km。8.米氏方程在各因素调控下的变化、特点考虑了逆反应的动力学方程：高底物浓度引起抑制 V只有理论意义，仅能通过1/v1/S图形的线性线段的延伸线与纵轴的交点才能获得；Ks>Ks，如r Ks/Ks，则实际的最大速度 ，此时

26、的底物浓度为 底物浓度很高时，上式变为高底物浓度引起活化 7.米氏方程其他表达形式及作图法（1）此表达式对应的图形为vS作图， Km=V/2。2 很难准确地画出矩形双曲线；很难画出渐近线；3 误差不易察觉；（2）该式对应的图形为1/v1/S作图，称为Lineweaver-Burk作图或双倒数作图。点分布不均匀，集中于1/v轴，不过，此缺点可通过适当选择 S克服。2 误差放大。在低S时，v很小，本身就容易产生误差；而化成1/v与1/S后，误差显著放大。（3）相应的作图为S/vS，称为Hanes作图。优点：点分布均匀；缺点：由于取1/v，使误差放大，但比较一致，一般认为适用于常数测定。（4）对应图

27、形为vv/S，称为Eadie-Hofstee作图。缺点是分布不均，但无误差放大，可信度高，更大的优点是各种因素的影响可在影响上表现出来。故现在很受人们重视。最好使用接近Km的S，否则不能得到准确结果，因为：用Lineweaver-Burk作图时，如果S>> Km,曲线基本水平，斜率近于0；如果S<< Km,则曲线在X和Y轴都靠近原点。用Hanes作图时，不管S>> Km ,还是S<< Km,曲线都接近水平。用Eadie-Hofstee作图时， S>> Km ，曲线接近水平； S<< Km，曲线极陡。8.三个假设浓度：高酶浓

28、度既能引起抑制也能引起活化，在推导米氏方程中必须假定，底物浓度大大高于酶浓度。当S>> Km 时，v达到V，vE呈线性关系，即酶速度与反应速度成正比关系。这种线性关系的两个保证条件：必须是初速度必须用高底物浓度，S>100Km。温度：影响两方面，温度升高可以加快分子运动速率，提高分子碰撞概率，从而加快反应速率；温度升高也可使酶失活，从而降低酶促反应速率，为综合作用的结果。形成钟罩形曲线，有最适温度Optimum Temperature。最适温度是酶的特征常数。pH：pH直接影响了酶活性中心的必需基团的解离状态；pH影响了ES中间复合物的解离状态；pH影响了底物的解离状态；酶分

29、子表面上其他可解离基团的解离状态随pH的改变而变化，可能影响了酶分子呈现活性所需的构象；过高或过低的pH可以引起酶蛋白的变性失活。也为钟罩形曲线。酶的最适pH是酶的特征常数，但不是固定不变的常数。激活剂（Activator）：凡是能提高酶活性的物质激活剂对酶的激活作用的类型：1必须型：使无活性的酶变成有活性的酶；2非必须型：使低活性的酶变成高活性的酶；1.无机离子阳离子：H+和各种金属离子，如：K+ 、Na+ 、Ca2+、Mg2+ 、Zn2+ 阴离子：Cl-、Br-、I-、CN-、NO-等。阴离子对酶的激活随pH的变化而变化。无机离子对酶活性的影响规律：与浓度有关，呈双曲线关系；在一起的两种离

30、子对酶活性有拮抗作用。Mg提高ATP酶活性，Ca则降低。有时金属离子之间可以相互替代；一种无机离子，对一种酶是激活，对另一种酶可能是抑制；2.小分子有机化合物还原剂能使巯基酶分子内的二硫键还原成SH基，从而提高酶活性。如还原型谷胱甘肽等。金属熬合剂能去除酶分子中的重金属离子，从而解除重金属离子对酶活性的抑制。如EDTA。3.蛋白质大分子某些蛋白酶能使无活性的酶原变成有活性的酶。如，胰蛋白酶可水解无活性的胰凝乳蛋白酶原成有活性的胰凝乳蛋白酶。抑制作用的分类一不可逆抑制作用抑制剂与酶分子中的必需基团以共价键结合，引起酶活性丧失，用透析等物理方法不能除去抑制剂，因而不能使酶复活。不可逆抑制的动力学特

31、征：抑制程度比例于共价键形成的速度，并随抑制剂与酶的接触时间而逐渐增大。最终抑制水平仅由抑制剂与酶的相对量决定，与抑制剂浓度无关。（一）专一性不可逆抑制作用1.Ks型不可逆抑制剂：具有和底物类似的结构，还带有一个活泼的化学基团，能修饰酶分子中的必需基团。2.Kcat型不可逆抑制剂：本身也是底物，还具有一种潜伏性的反应基团，这种基团可因酶的催化而暴露或活化，作用于酶的活性中心或辅基。（二）非专一性不可逆抑制作用与酶分子中一类或几类基团反应。二可逆抑制作用抑制剂与酶分子必需基团以非共价键结合，引起酶活力降低或丧失，用透析等物理方法能除去抑制剂而使酶活力恢复。根据抑制剂与酶的结合方式，可逆抑制分为：

32、同位抑制作用：抑制剂与酶活性中心相结合，阻断酶分子的结合基团或催化基团，或者与ES复合物结合，阻止底物形成产物。此类抑制剂在酶分子的结合部位基本上与底物相同或相近，故称为同位抑制剂。别位抑制作用：抑制剂和酶活性中心以外的部位结合，通过酶分子构象的改变，影响底物与酶的结合，进而影响催化效率。由于抑制剂和底物结合在酶的不同部位上，故称为别位抑制剂。根据抑制剂与底物的竞争关系，可逆抑制分为：一竞争性抑制作用抑制剂（I）和底物（S）对酶分子（E）的结合有竞争作用，互相排斥。1.竞争性抑制动力学特征在I存在时，Km增大（Km >Km）,但Vm不变，直线斜率增大，各条直线相交于纵轴上。表观米氏常数(

33、Km )随I增大而增大，随抑制常数(Ki)增大而减小。抑制程度随I 增大而增大，随S增大而减小。高S可以减轻，甚至消除I对E的抑制。2.竞争性抑制的机理：竞争性抑制剂，由于在结构上与底物非常相似，能结合到酶分子的活性中心上，从而阻止底物与酶活性中心的结合，故两者有相互排斥作用。3.应用：竞争性抑制作用的应用-药物设计4.过渡态类似物对酶的竞争性抑制作用，过渡态类似物与S*过渡体结构类似，但很稳定，对酶的亲和力大大超过底物对酶的亲和力，是酶很强的竞争性抑制剂。二、反竞争性抑制作用抑制剂只能与ES复合物结合成ESI三元复合物，E和S结合会促进I与E的结合，但ESI不能释放出产物。1.反竞争抑制动力

34、学特征有I时，Km和Vm随I的增加而减少，但直线斜率(Km/Vm)保持不变，各条直线平行。抑制程度随S和I增大而增大。增加S，不能减轻或消除抑制，反而增加抑制程度。这与竞争性抑制恰好相反。三、非竞争性抑制I和S都可结合到E和ES上，但产生的ESI复合物是无催化活性的。1.非竞争性抑制动力学特征有I时，Vm随I增大而减少，但Km不变。直线的斜率和纵轴截距随I增大而增大。抑制程度随I增大而增大，与S无关。增加S不能消除I对E的抑制。2.非竞争性抑制的机制非竞争抑制剂I不是结合在酶活性中心的底物结合位点上，而是结合到其他的必需基团（如催化基团）上。因此抑制剂并不降低E对S的亲和力，但却能阻止酶的催化

35、作用，降低Vm。四、混合型抑制作用KsKs，此不同于非竞争性抑制。Ki<Ki时，属于非竞争性抑制与竞争性抑制之间的类型。Ki>Ki时，属于非竞争性抑制与反竞争性抑制之间的类型。Ki>Ki时，则(1+I/Ki)< (1+I/Ki)，Km<Km，故直线交于横轴以下。Ki<Ki时，则(1+I/Ki)> (1+I/Ki)，Km>Km，故直线交于横轴以上。1.动力学特点当I存在时，Vm随I增大而减少；当Ki>Ki时，Km随I增大而减少；当Ki<Ki时，Km随I增大而增大；在Vm和Km均减少时，Vm减少大于Km减少。故直线斜率增大。抑制程度随I增

36、大而增大。当Ki>Ki时，抑制程度随S增大而增大；当Ki<Ki时，抑制程度随S增大而减少。2.与上述三种抑制的关系当Ki时，只有EI复合物，而无ESI复合物，属于竞争性抑制。当Ki时，只有ESI复合物，而无EI复合物，属于反竞争性抑制。当Ki=Ki时，E和ES与I以及E和EI与S结合的亲和力都相等，属于非竞争性抑制剂。当KiKi时，E和ES与I结合的亲和力以及E和EI与S结合的亲和力都相等，为混合型抑制。其中， Ki>Ki为非竞争与反竞争性混合抑制； Ki<Ki为非竞争与竞争性混合抑制。酶的作用机理酶的作用专一性机制作用专一性：酶对底物和所催化的反应的选择性。1.结合专

37、一性（底物专一性）：取决于酶的活性中心（主要取决于结合位点）的空间结构。2.催化专一性（反应专一性）：取决于酶催化位点的结构。一、“锁与钥匙”学说酶的刚性E. Fisher提出很好地解释了酶的立体异构专一性，但不能解释酶的活性中心既适合于可逆反应的底物，又适合于产物。二、“诱导契合”学说酶的柔顺性游离酶和酶底物络合物在结构上往往不同，即伴随底物与酶的结合，酶的构象可能发生了变化。Koshand提出：酶和底物在接触以前，两者并不是完全契合的，只是由于底物和酶的结合部位结合以后，产生了相互诱导，酶的构象发生了微妙的变化，结合基团和催化基团转入了有效的作用位置，酶与底物才完全契合，酶才能高速地催化反

38、应进行。酶分子具有一定的柔顺性；酶作用的专一性不仅取决于酶和底物的结合，也取决于酶对底物的催化，取决于催化基团的正确取位。三、扭曲学说1930年，Haldan高效性（降低活化能）：邻近效应和定向效应邻近效应：底物分子从稀溶液中密集到酶分子活性中心后，酶分子活性中心能使底物分子彼此靠近，大大提高了底物在活性中心部位的有效浓度，因而提高了反应速度。定向效应：酶分子活性中心的催化基团与底物分子的反应基团之间能正确的定向排布，从而大大降低活化自由能，提高反应速度。两种效应可以变分子间反应成分子内反应。应变效应酶与底物相结合时，底物使酶分子发生有利于催化的变化，同时酶也使底物分子发生了扭曲变形，使其几何

39、和静电结构更接近过渡态。酸碱催化狭义酸碱催化： H+和OH-对反应物的催化作用。狭义酸碱催化剂是酸(H+)和碱(OH-)。广义酸碱催化：广义酸碱催化剂是质子供体和质子受体。质子供体向反应物提供质子，质子受体从反应物接受质子，从而加速催化反应的作用。共价催化酶与底物以共价键结合成共价中间物，并迅速转变成活化能大大降低的过渡态，从而大大提高反应速度。a.亲核催化由亲核催化剂提供电子对，与反应物通过共价键结合成中间物的作用。亲核催化剂：化合物中的未成键电子对或基团。b.亲电子催化由亲电子催化剂从底物分子中接受一对电子，并与该底物以共价键结合成不稳定的共价中间物的作用。酶的生产酶的抽提：在一定的条件下

40、，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程，也称为酶的提取。提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.020.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH812的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶分离的原理及其方法（分子量、大小、pI、专一性、稳定性）：l 1、根据溶解度的不同：盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法。l 2、根据分子大小的差别：胶过滤（层析）法、

41、超过滤法、超离心法。l 3、根据电学、解离性质：吸附（层析）法、离子交换层析法、电泳法、聚焦层析法。l 4、基于酶和底物、辅酶因子以及抑制剂间具有专一的亲和作用特点：亲和层析。l 5、利用稳定性差异：选择性热变性法，酸碱变性法，表面变性法。分离纯化的实质：在抽提（浓缩）溶液中，其成分多而杂的情况下，要去除需要分离的酶以外的组分，从而获得高纯度的酶液。分离纯化存在复杂性：1）有大分子（蛋白质，目的酶和其他酶等），加对应试剂除去2）有小分子，纯化中自然去除一、沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。沉淀分离方法分离原理盐析沉

42、淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离二、离心分

43、离（分子大小的差异） 蛋白质分子在离心時，其 分子量、分子密度、组成、形状 等，均会影响其沉降速率，沉降係系数 即用來描述此沉降性质； 其单位为 S (Svedberg unit)。每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。 不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法，在密度梯度中作分離。三、过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。过滤的分类及其特性 (根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 ) 类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤> 2m酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.22m细菌、灰尘等微滤膜、微孔

44、陶瓷超滤20Å0.2m病毒、生物大分子等超滤膜反渗透< 20Å生物小分子、盐、离子反渗透膜借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。四、层析分离层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其

45、中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。层析方法分离依据吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的。按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。最常用的填料是DEAE-纤维素（二乙氨基乙基纤维素）。蔗糖酶的纯化：由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交

46、换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化。酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，酶RNA与互补的RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。例子：胰蛋白酶Trypsin的分离纯化，使用鸡蛋粘多糖蛋白CHOM这种胰蛋白酶抑制剂来

47、吸附胰蛋白酶，载体为壳多糖Chitin，进行装柱洗脱，再用SDS-PAGE进行电泳检测。聚焦层析将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离五、电泳分离 带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。 颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。电泳方法按其使用的支持体的不同，可以分为：纸电泳；薄层电泳；薄膜电泳；凝胶电泳；自由电泳；等电聚焦电泳 六、萃取分离 萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一

48、般为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它流体。按照两相的组成不同，萃取可以分为：有机溶剂萃取；双水相萃取；超临界萃取；反胶束萃取酶的纯化步骤酶的纯化过程，约可分为三个阶段：(1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 均质打破细胞 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。(2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用各钟 柱层析法。(3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。酶的制备方案酶的生产法 发酵生产法 微生物、植物、动物 化学合成法 天然材料 抽提纯化法1、 提取法

49、 (Extraction) 酶作为生物催化剂普遍存在于动物、植物、微生物中，可以直接从生物体中分离提纯而获得，早期酶的生产多是以动植物为主要原料提取而得。2、 发酵生产法 (Biosynthesis)利用动物、植物细胞和组织培养方法来生产酶，由于周期较长、成本较高，也存在一定难度。主要方式是固态发酵和液体发酵法。酶生物的调控模式酶生物合成的模式（依据酶的合成与细胞生长之间的关系分类）： 生长偶联型同步合成型和中期合成型 部分生长偶联型延续合成型 非生长偶联型 滞后合成型1、生长偶联型（又称同步合成型）酶的生物合成与细胞生长同步特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。当去除诱

50、导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。2. 生长偶联型中的特殊形式中期合成型 酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏，所对应的mRNA是不稳定的。3.部分生长偶联型部分生长偶联型（又称延续合成型） 酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。所对应的mRNA相当稳定。4.非生长偶联型非生长偶联型（又称滞后合成型） 只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的

51、生物合成都属于这一类型。特点：受分解代谢物的阻遏作用。所对应的mRNA稳定性高。二、影响酶生物合成模式的主要因素 高：可在细胞停止生长后继续合成酶 1）mRNA的稳定性 差：随着细胞停止生长而终止酶的合成2）培养基中阻遏物的存在 不受阻遏：随着细胞的生长而开始酶的合成。 受阻遏：细胞生长一段时间或平衡期后，酶才开始合成。酶生产中最理想的合成模式为延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。三、产酶动力学一般产酶动力学方程可表达为式中 X细胞浓度(g /L)；m细胞比生长速率(h-1) ；a生长偶联的比产酶系数

52、(IU/g) ；b非生长偶联的比产酶速率(IU/(g×h) ；E酶浓度(IU/L)；t时间(h)营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率之间的动力学关系：Monod模型µ:比生长速率（1/h） （specific growth rate）µmax：最大比生长速率（1/h）S：营养物浓度（生长限制基质浓度） 克/LKs：莫诺德常数或饱和常数或营养物利用常数 克/L，或 mol/L酶合成的基因调节控制理论酶生物合成的调节：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。意义是通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。操纵子学说（操纵子基因表达的协同单位）调节基因(regulator gene)：可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) （一种变