瘢痕疙瘩家系外周血淋巴细胞永生化方法探讨

1、瘢痕疙瘩家系外周血淋巴细胞永生化方法探讨 作者：严欣；高建华；宋玫；刘小军；陈阳(南方医科大学南方医院整形外科，广东  广州  510515)摘要：目的  探讨建立瘢痕疙瘩家系永生化细胞库的方法，为研究瘢痕疙瘩的发病机制、诊断和治疗提供长期的标本来源。方法 采用eb病毒转化技术，分别采用新鲜血法和冻存血法，将瘢痕疙瘩家系外周血b淋巴细胞转化成永生化淋巴母细胞系。结果  成功建立了一瘢痕疙瘩家系中27个个体的永生细胞株；新鲜血法较冻存血法可明显提高一次建系成功率。结论  eb病毒转化技术可有效保存

2、原来个体完整的基因组，为以后的相关研究提供了长期的dna资源。新鲜血法明显优于冻存血法，更适用于永生化细胞库的建立。关键词：瘢痕疙瘩；家系；eb病毒；b淋巴细胞；永生化淋巴母细胞系中图分类号：r619.6  文献标识码：a  文章编号：1673-4254(2006)01-0022-03establishment of immortalized lymphoblastoid cell bank of a keloid pedigreeyan xin；gao jian-hua；song mei；liu xiao-jun；chen yangdepartment

3、 of plastic surgery, nanfang hospital, southern medical university, guangzhou 510515, chinaabstract: objective to investigate a method for establishing immortalized lymphoblastoid cell bank of keloid pedigree so as to provide a long-term source of specimens for keloid research. methods with epstein-

4、barr virus transformation, fresh and frozen blood samples collected from all members of the keloid pedigree were used respectively to establish the immortalized lymphoblastoid cell lines of b lymphocytes. results twenty-seven immortalized lymphoblastoid cell lines of the keloid pedigree were obtaine

5、d successfully, and all cell lines survived cryopreservation in liquid nitrogen. conclusions the immortalized lymphoblastoid cell bank of the keloid pedigree can preserve the whole gene information and provide long-term dna sources for keloid research. preparation of the cell lines with fresh blood

6、is more efficient than that with frozen blood.key words：keloid; pedigree; epstein-barr virus; b lymphocytes; immortal lymphoblastoid cell lines收稿日期：2005-10-17基金项目：广东省名医工程(2004)supported by foundation for prestigious doctors of guangdong province (2004)作者简介：严  欣(1974-)，男，医学硕士，主治医师，电话：020-61

7、641861，e-mail: yenshin通讯作者：高建华，教授，主任医师，博士生导师，电话e-mail: tanzi     瘢痕疙瘩的诊断和治疗是整形外科领域研究的重点和难点之一。近年研究表明，瘢痕疙瘩的形成具有明显遗传倾向，故我们拟以内蒙古一瘢痕疙瘩家系为对象进行相关遗传学研究，为避免重复采样并长期保存此家系的dna资源供持续性研究，我们采用eb病毒(epstein-barr virus, ebv)转化技术，将样本外周血b淋巴细胞转化成永生化淋巴母细胞系，建立了此家系的外周血淋巴细胞永生细胞库，并对新鲜血法和冻存血法两

8、种转化方法进行了探讨。    1  材料和方法    1.1 试剂    产生ebv的b95-8细胞株(中国医学科学院遗传与发育生物学研究所徐玖瑾教授馈赠)，rpmi 1640培养基(gibco)，特级胎牛血清(hyclone)，淋巴细胞分离液(pharmacia)，环孢霉素 a(cya)，植物凝集素，l-谷氨酰胺，hepes(promega)。    1.2  标本的采集  

9、  此家系来自我国东北，资料完整详细，所有成员均由2名整形外科医师进行了详细的病史询问和体格检查，患者均结合明确病史及典型皮损确诊。我们采集了包括先证者所在核心家庭及发病人数较多的1个家庭共4代28个成员的外周血标本，其中瘢痕疙瘩患者5人。所有血样都在无菌条件下抽取，每人10 ml左右，肝素抗凝，保持温度在20 左右带回实验室。    先证者，男，65岁，17岁时胸骨部皮肤于痤疮愈合后形成3个约黄豆大小的结节样瘢痕，略高出周围正常皮肤，表面充血，伴痛痒不适，并不断向周围扩大增生，融合成片，痛痒症状加重；随后在肩背部、面颈部、上臂外侧、

10、腹部及大腿后外侧也相继因痤疮形成类似瘢痕组织；30岁时在当地医院确诊为瘢痕疙瘩，并行胸骨前瘢痕疙瘩部分切除缝合术，术后瘢痕增生及症状反而加剧，此后未予进一步治疗。40岁后瘢痕增生有所缓解，但其自觉目前仍呈缓慢增生状态。查体：前胸部、肩背部、面颈部、双上臂外侧、腹部及双大腿后外侧均可见大小不一的片状、蝶形、蟹足状瘢痕组织，明显高出周围正常皮肤，中等硬度，皮温稍高，伴轻度充血，对肢体功能影响较小。    1.3  实验方法    1.3.1  ebv悬液的制备 复苏b-958细胞

11、株，加入无血清rpmi 1640，1000 r/min离心10 min，弃上清，加入rpmi 1640完全培养基培养。每23 d半量加液1次，待细胞数达到1×107/ml时，饥饿细胞47 d后，收集上清液，-70 及37 反复冻融3次，1800 r/min离心15 min，0.22 m滤膜抽滤后，-70 冰箱保存备用。    1.3.2  新鲜血法  在无菌条件下取患者外周血5 ml，室温保存24 h，加入2 ml无血清rpmi 1640培养液，混匀，沿管壁小心加在4 ml淋巴细胞分离液上，2500 r/

12、min离心30 min，将白细胞层轻轻吸出后移入另一试管中，加入10 ml无血清rpmi 1640培养基，混匀，1500 r/min离心10 min，弃上清，同法再反复洗涤2次；洗涤后的白细胞用2 ml rpmi 1640完全培养基重悬，加入1.3 ml ebv悬液和0.4 ml cya，充分混匀后等量移入2个10 ml培养瓶内，置于37 ，5%co2培养箱培养；7 d左右镜下观察,可见淋巴细胞明显增大，出现聚集现象,并根据培养液ph值的改变情况，每34 d半量换液；约2周后可见瓶底大量呈聚集生长的细胞团，即可转瓶；至68周后，细胞数达到46×106/ml时，收集大部分细胞进行第1次

13、冻存，剩余细胞继续培养，平均1周后进行第2次冻存；细胞株在冻存前1 d须加新鲜完全培养基，24 h后收集细胞至离心管中，1000 r/min离心10 min，弃上清，用1 ml冻存液(95%胎牛血清+5%二甲基亚砜)重悬细胞，置于-70 的冰箱1 h后移入液氮柜中保存。3个月后对冻存细胞株进行复苏，复苏时迅速将冻存管放入37 水浴，当其中尚存有少量冰块时立即移入超净台中，整个时间约1 min左右。解冻后的细胞直接加入rpmi 1640完全培养基，无须离心洗涤，核对培养瓶上编号等标记后，置入37 ，5%co2培养箱培养，常规半量换液。    1.3.3&#

14、160; 冻存血法  我们对全部标本的剩余血样进行了冻存，参考刘敏1的方法，将新鲜血法转化失败的1例和其它5例随机抽取的冻存血标本进行了再次转化。取抗凝全血1 ml，加入10% 二甲基亚砜，混合后置-70 低温冰箱2 d内移至液氮中，根据剩余血量，一般每个样本冻存23支。1月后，将冻存血标本从液氮中取出，置37 水浴中迅速解冻，用10 ml无血清rmpi 1640培养液1000 r/min离心2 min，弃上清，留沉淀细胞；用2 ml含20% 胎牛血清的rmpi 1640培养基悬浮细胞，加入1 ml ebv悬液，混合后移入10 ml培养瓶内，置于37 、5% co

15、2培养箱培养，根据转化和细胞生长情况加液、换液、转瓶和传代。    1.3.4  细胞株染色体核型分析  取培养中细胞株处于指数增殖期的淋巴细胞悬液5 ml注入另一培养瓶中，加入完全培养基5 ml，37 培养48 h，加入秋水仙碱，终浓度为0.4 g/ml，继续培养2 h后，常规收获、制片，g显带后进行染色体核型分析并显微照相。    2  结果    2.1  瘢痕疙瘩家系永生细胞库资料

16、0;   我们对此家系中先证者所在核心家庭及发病人数较多的一个家庭的标本进行了转化，共4代28个成员，男女比率34，年龄376 岁，病程1030 年不等。除1人外，其余27人的外周血标本均被成功转化和建系，成功率达96.4%。    2.2  ebv转化观察    转化细胞培养1周后，在倒置显微镜下观察，可见淋巴细胞体积增大，聚集成小细胞团块，呈明显母细胞化(图1)；1个月左右细胞增殖旺盛，形成密集的大细胞团块，标志转化成功(图2)。   

17、60; 图1  转化后7 d的淋巴细胞    fig.1  transformed b lymphocytes on day 7 (original magnification: ×20)    图2  转化后30 d的淋巴细胞    fig.2  transformed b lymphocytes on day 30 (original magnification: 

18、5;10)    2.3  建系成功率    2.3.1  新鲜血法  全部28例样本中，27人的外周血标本转化成功并建系，仅1人因分离后的淋巴细胞量过小而转化失败，一次建系成功率达96.4%。转化后冻存的细胞株复苏成功率为100%，复苏后第3天即可传代，镜下观察细胞形态正常。    2.3.2  冻存血法  在抽取的6例样本中，仅1例转化成功并建系，其余均未成功，一次建系成功

19、率较低，仅16.7%。其中，建系成功者的细胞学观察结果与新鲜血法相似，未见异常。    2.4  染色体核型分析结果    对细胞株建系前、后及冻存复苏传代后细胞分别进行染色体g显带核型分析，结果显示均无明显差异，说明转化后细胞核型稳定，保留了原有遗传标志。    3  讨论    瘢痕疙瘩患者多呈散发，家族性发病率仅3%左右。marneros2通过对14个瘢痕疙瘩家系的分析研究，认为其呈常染色体

20、显性遗传伴不完全外显，并非简单的孟德尔式单基因遗传。目前，瘢痕疙瘩的发病机理尚不明确，相关的病因学研究多集中在散发病例，缺乏代表性，且盲目性较大；近年来，越来越多的结果显示，瘢痕疙瘩的形成可能是易感基因与外源性因素共同作用的结果。因此，通过发病家系的分子遗传学研究，将为寻找其相关易感基因提供直接、高效的途径，对于揭示瘢痕疙瘩发病机制具有重大意义。完整的疾病家系标本的采集是家系研究的关键，但因家系成员居住分散、不配合和费用昂贵等因素，重复采样往往十分困难，难以满足长期研究的需要。ebv转化b淋巴细胞建立永生化淋巴母细胞系的技术有效解决了这一问题。ebv是一种广泛存在的亲人类b淋巴细胞的疱疹病毒，

21、它能选择性转化人类b淋巴细胞，使其成为连续分裂、永久生存的类淋巴母细胞样细胞。在大多数细胞系中，ebv基因组似质粒一样以500800拷贝存在于每个细胞中，对宿主细胞dna多无影响3。用ebv转化人外周血b淋巴细胞，使其成为一种能持续生存、分裂的类淋巴母细胞，由此建立的永久性类淋巴母细胞株能够保存原血样个体的完整基因信息4。neitzel5认为细胞转化成功的标志，是在ebv感染后约24 h能观察到淋巴细胞增大明显母细胞化，进而增殖的淋巴母细胞凝聚成团；成功的传代、冻存和复苏培养则是建系成功的标志。我们收集到完整的瘢痕疙瘩家系外周血标本，并运用ebv转化技术，综合新鲜血法和冻存血法，成功建立了此家

22、系的永生细胞库，保存了宝贵的dna资源，同时还为后续发现家系遗传资源的保存奠定了实验基础。    实验过程中我们发现，ebv对淋巴细胞的转化作用存在一定的个体差异。大部分样本转化时间多在37 d，少数在1015 d，个别长达20 d，儿童、青壮年比中老年人转化快，观察分析后我们认为这主要还是与样本外周血中存活的淋巴细胞数量有关外，而与供血者的性别、年龄无明显关系。另外，转化初期因细胞生长缓慢且量较少，加液或换液不宜过多过勤，应根据细胞生长具体情况而定，以保证细胞有一定密度，利于转化成功；另外，rpmi 1640完全培养基的ph值应严格控制，否则将直接影响

23、细胞的转化和生长，一般以6.56.7为宜。    本实验结果显示，新鲜血法是建立淋巴母细胞系的理想方法，而冻存血法的成功率较低，可作为新鲜血法的有限补充。我们分析认为，冻存血法成功率低可能与较少的细胞量、未加入cya、冻存后细胞活力可能降低及未分离红细胞的干扰等多方面因素有关。正常人群(包括幼儿及成人)中血清ebv抗体90%以上是阳性，eb病毒转染过程中，由于记忆性t淋巴细胞被激活，对感染的b淋巴细胞起杀伤作用而使之不能转化或转化细胞集落迅速退化6。cya是一种高效免疫抑制剂，可在g0到g1期之间选择性抑制t淋巴细胞rna聚合酶，使t淋巴细胞失去了对eb

24、v感染的免疫反应，有效地防止了已转化的b淋巴细胞的退化，临床上部分用cya治疗的病人发生b细胞淋巴瘤，也表明cya在体内可促进b淋巴细胞的生成。冻存血法中，因血量较小，考虑到相应t细胞浓度很低，故未加入cya，较低的转化成功率可能与此有直接关系。而关于冻存血的最低量、细胞活力的测定、分离红细胞的必要性等也有待进一步实验的证实，这对提高冻存血法的成功率和适用范围具有重要意义。    参考文献：    1刘敏, 吴雄文, 吴锋, 等. 简单可行的eb病毒转化b淋巴细胞方法的探讨j. 同济医科大学学报, 1997, 26(4): 274-75.    2marneros ag, norris je, ols