细胞工程学试验课件

1、2021/3/231细胞工程学实验内容细胞工程学实验内容 实验一实验一 植物细胞培养基的种类及配制植物细胞培养基的种类及配制 实验二实验二 植物愈伤组织的诱导植物愈伤组织的诱导 实验三实验三 植物愈伤组织细胞的培养植物愈伤组织细胞的培养2021/3/232 实验一实验一 植物植物细胞培养基的细胞培养基的种类及配制种类及配制 一、实验目的一、实验目的 1、了解、了解植物植物细胞培养细胞培养基的种类及营养要求。基的种类及营养要求。 2、掌握、掌握MS培养基的配制培养基的配制方法。方法。二、实验材料二、实验材料 1、实验设备、实验设备:高压灭菌锅、电子分析天平、高压灭菌锅、电子分析天平、pH计计、超

2、净、超净 工作台工作台。 2、实验器材、实验器材:电磁炉电磁炉、烧杯、量筒、搅拌棒、烧杯、量筒、搅拌棒、吸量管、吸量管、 移样枪移样枪。2021/3/233三、三、植物细胞培养基的种类植物细胞培养基的种类 在在100多年的植物组织、器官和细胞离体培养研究中多年的植物组织、器官和细胞离体培养研究中,研制研制开发了数十种适宜不同植物、不同组织、不同细胞生长发育的开发了数十种适宜不同植物、不同组织、不同细胞生长发育的培养基配方培养基配方,但多数培养基是在几种普遍应用的培养基上演变但多数培养基是在几种普遍应用的培养基上演变而来的而来的,其中应用最为广泛的仍为其中应用最为广泛的仍为MS培养基。植物组织培

3、养基培养基。植物组织培养基早期的建立早期的建立,如如White提出的根培养基和提出的根培养基和Gautheret提出的愈伤提出的愈伤组织培养基组织培养基,都是由先前的用于整体植物栽培的营养液发展而都是由先前的用于整体植物栽培的营养液发展而来的。以后所有的各种培养基又都是在来的。以后所有的各种培养基又都是在White培养基和培养基和Gautheret培养基的基础上形成的。各种培养基在无机营养组培养基的基础上形成的。各种培养基在无机营养组成上的差异主要是盐和离子数量上的不同。常用培养基中根据成上的差异主要是盐和离子数量上的不同。常用培养基中根据无机盐的含量可以分为无机盐的含量可以分为4类类,分述于

4、下分述于下:2021/3/234 1、高无机盐含量培养基、高无机盐含量培养基:高无机盐含量培养基中高无机盐含量培养基中,钾盐、铵钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高盐及硝酸盐含量较高,微量元素种类齐全微量元素种类齐全,养分数量及比例较合适养分数量及比例较合适,广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。主要有广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。主要有MS培养基和培养基和ER培养基。培养基。 2、较高硝酸钾含量培养基、较高硝酸钾含量培养基:较高硝酸钾含量培养基适合于较高硝酸钾含量培养基适合于木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。主木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药

5、培养。主要有要有B5培养基和培养基和N6培养基。培养基。2021/3/235 3 3、中等无机盐含量培养基、中等无机盐含量培养基: :中等无机盐含量培养基中中等无机盐含量培养基中,大大量元素约为量元素约为MS培养基的一半培养基的一半,微量元素种类减少微量元素种类减少,但含量较但含量较MS的高的高,适合于花药培养。主要有适合于花药培养。主要有Nitsch培养基和培养基和NT培养基。培养基。 4 4、低无机盐含量培养基、低无机盐含量培养基: :低低无机盐量培养基中无机盐量培养基中,大量元素大量元素含量大幅降低而且种类减少含量大幅降低而且种类减少,多数用于生根培养基。主要有多数用于生根培养基。主要有

6、White培养基和培养基和Heller培养基。培养基。各种植物培养基的营养组成及配方如下表各种植物培养基的营养组成及配方如下表:2021/3/236培养基成分培养基成分培养基（培养基（mg/L）MS（1962）ER（1965）B5（1968）N6（1975）Nitsch1963NT（1971）White（1963）Heller（1953）NH4NO3KNO3CaCl22H2OCaCl2MgSO47H2O1 6501 900 440 3701 2001 900 440 3702 527.50 1502502 830 166 185 720 950 166 185 825 950 220 1 23

7、3 80 750 75 250KH2PO4（NH4）2SO4Ca（NO3）24H2ONaNO3Na2SO4 170340 134 400 463 68 680 300 200600NaH2PO4H2OKClKIH3BO3MnSO44H2O 0.83 6.20 22.30 0.63 2.23 150 0.75 3.00 0.80 1.60 4.40 10.00 25.00 0.83 6.20 22.30 19.00 65.00 0.75 1.50 5.00 125 750 0.01 1.00 0.10MnSO4H2OZnSO47H2OZnSO44H2OZnNa2EDTANa2MoO42H2O 8

8、.60 0.25 15.00 0.025 10.00 2.00 0.25 3.80 10.00 0.25 8.60 0.25 3.00 1.00MoO3CuSO45H2OCoCl26H2OCoSO47H2OAlCl3 0.025 0.0250.0025 0.00250.025 0.025 0.025 0.025 0.03 0.001 0 .01 0.030.03NiCl26H2OFeCl36H2OFe2（SO4）3FeSO47H2ONa2EDTA2H2O 27.80 37.3027.80 37.3027.80 37.3027.80 37.3027.80 37.3027.80 37.30 2.5

9、0 0.03 1.00肌醇肌醇烟酸烟酸盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇盐酸硫胺素盐酸硫胺素甘氨酸甘氨酸100 0.50 0.50 0.10 2.000.50 0.50 0.50 2.00 100 1.00 1.00 10.00 0.50 0.50 1.00 2.00 1005.00 0.50 0.50 2.00 100 1.00 0.05 0.01 0.01 3.00叶酸叶酸生物素生物素蔗糖蔗糖D-D-甘露醇甘露醇30 00040 00020 00050 0000.50 0.0520 000 10 000127 00020 0002021/3/237四、四、MS培养培养基基的配制的配制 植物细胞培养基种类

10、很多植物细胞培养基种类很多,如如MS、ER、B5、N6、NT和和White等。本实验以等。本实验以MS完全培养基为例完全培养基为例,介绍植物细胞培养基介绍植物细胞培养基的配制方法。的配制方法。 （一）（一）MS培养基母液的配制培养基母液的配制 母液的配制是按药品的种类和性质分别配制母液的配制是按药品的种类和性质分别配制,单独保存或单独保存或几种混合保存。配制好的母液种类一般有大量元素、微量元几种混合保存。配制好的母液种类一般有大量元素、微量元素、钙盐、铁盐、有机营养和单独保存的各种生长调节类物素、钙盐、铁盐、有机营养和单独保存的各种生长调节类物质。大量元素一般配制成质。大量元素一般配制成10倍

11、浓度的母液倍浓度的母液,微量元素和有机物微量元素和有机物常配制成常配制成100倍浓度的母液。见下表。倍浓度的母液。见下表。2021/3/238母 液成 分规定量（mg/L）扩大倍数称取量（mg）母液体积（mL）配1L培养基吸取量（mL）编号种类1大量元素KNO31 9001019 0001000100NH4NO31 65016 500MgSO47H2O3703 700KH2PO41701 7002钙盐CaCl22H2O440104 40010001003微量元素MnSO44H2O22.31002 230100010ZnSO47H2O8.60860H3BO36.20620KI0.8383Na2M

12、o42H2O0.2525CuSO45H2O0.0252.5CoCl26H2O0.0252.54铁盐Na2EDTA37.301003 730100010FeSO44H2O27.802 7805有机物质甘氨酸2.005010050010盐酸硫胺素0.105盐酸吡哆醇0.5025烟酸0.5025肌醇1005 0002021/3/239 上上表提供了表提供了MS培养基母液的配方。将各种化合物按指定扩大培养基母液的配方。将各种化合物按指定扩大倍数准确称量、分别溶解后倍数准确称量、分别溶解后,按先后次序加入蒸馏水中按先后次序加入蒸馏水中,最后用蒸馏水最后用蒸馏水定容。定容。 注意注意:在混合定容时在混合定

13、容时,一定要掌握药剂的先后次序或稀释度一定要掌握药剂的先后次序或稀释度,以免以免发生沉淀。钙盐和铁盐由于与其它母液混合容易发生沉淀反应发生沉淀。钙盐和铁盐由于与其它母液混合容易发生沉淀反应,因此因此需单独配制。铁盐为螯合状态时需单独配制。铁盐为螯合状态时,有利于植物在适宜的有利于植物在适宜的pH下吸收和下吸收和利用利用,因此需与螯合剂因此需与螯合剂Na2EDTA混合配制。生长调节类物质一般分混合配制。生长调节类物质一般分别配制成别配制成0.21.0mg/L的母液的母液,用时按量吸取。某些生长调节剂不溶用时按量吸取。某些生长调节剂不溶于水于水,需用不同溶剂进行溶解需用不同溶剂进行溶解,如如NAA

14、、2,4-D、IAA、IBA、GA3是是醇溶性的醇溶性的,配制时先用少量配制时先用少量95%酒精溶解酒精溶解,然后再用蒸馏水定溶然后再用蒸馏水定溶;KT、6-BA、2ip、ZT先溶于少量先溶于少量1mol/L盐酸中盐酸中,然后再用蒸馏水定容然后再用蒸馏水定容;叶酸叶酸先用少量稀氨水溶解后再定容。先用少量稀氨水溶解后再定容。 配制好的各种母液倒入棕色瓶中配制好的各种母液倒入棕色瓶中,贴好标签贴好标签,保存于保存于4冰箱中备冰箱中备用。注意用。注意:母液保存于冰箱中的时间不宜过长母液保存于冰箱中的时间不宜过长,一般为一般为12个月个月,当母液当母液出现沉淀或霉菌团时出现沉淀或霉菌团时,则不能再使用

15、。则不能再使用。2021/3/2310 （二）（二）MS完全培养基的配制完全培养基的配制 以配制以配制1 000mL MS1 000mL MS完全培养基为例完全培养基为例, ,配制全过程如下配制全过程如下: : 1、在洁净的不锈钢（或搪瓷）容器中加入、在洁净的不锈钢（或搪瓷）容器中加入1/2终体积终体积 （500mL）的蒸馏水）的蒸馏水; 2、按上表内容规定的量、按上表内容规定的量,精确吸取各种母液精确吸取各种母液,依次加入到依次加入到 盛有盛有1/2终体积蒸馏水的不锈钢（或搪瓷）容器中终体积蒸馏水的不锈钢（或搪瓷）容器中,记录记录 此时的总体积。注意此时的总体积。注意:母液不能混合后加入母液

16、不能混合后加入,也不能同也不能同 时加入时加入,必须依次缓慢加入必须依次缓慢加入,且要一边加入一边搅拌且要一边加入一边搅拌, 以免造成电解质局部浓度过高而发生沉淀反应以免造成电解质局部浓度过高而发生沉淀反应; 3、根据培养目的及要求、根据培养目的及要求,加入所需量的各种生长调节物加入所需量的各种生长调节物 质质,记录此时的总体积（如用于长春花叶愈伤组织的诱记录此时的总体积（如用于长春花叶愈伤组织的诱 导导:加入加入2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、 NAA 1.0mg/L、 KT 0.2mg/L）;2021/3/23114、加入、加入30g蔗糖蔗糖,5g聚乙烯吡咯烷酮（聚乙

17、烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone, PVP,抗氧化剂抗氧化剂,防止或减轻植物组织褐化防止或减轻植物组织褐化,也可用一定也可用一定 量的维生素量的维生素C、活性碳代替、活性碳代替,或不加或不加,视情况而定）视情况而定）,充充 分混匀后分混匀后,补充蒸馏水至终体积补充蒸馏水至终体积1 000mL,然后用然后用1mol/L 盐酸或盐酸或1mol/L氢氧化钠调节培养基至氢氧化钠调节培养基至pH5.8;5、精确称取、精确称取15g琼脂加入其中琼脂加入其中,在电磁炉上煮沸溶解琼脂。此在电磁炉上煮沸溶解琼脂。此 过程需加以搅拌过程需加以搅拌,防止琼脂在锅底烧焦或沸腾溢出防止琼脂在锅底烧焦

18、或沸腾溢出;6、琼脂溶解后、琼脂溶解后,及时将培养基分装于及时将培养基分装于150mL三角瓶中三角瓶中,约约 50mL/瓶瓶,包膜密封包膜密封,并于并于100KPa、121下灭菌下灭菌1520分分 钟。冷却备用。钟。冷却备用。2021/3/2312 注意注意:培养基的培养基的pH直接影响培养物对离子的吸收直接影响培养物对离子的吸收,过酸或过碱过酸或过碱不仅影响到培养材料的生长不仅影响到培养材料的生长,而且还影响到琼脂的凝固而且还影响到琼脂的凝固,pH低于低于5.5时时,琼脂凝固程度不好琼脂凝固程度不好,pH高于高于6.0时时,琼脂过度凝固琼脂过度凝固,培养基变培养基变硬硬,不利于培养材料对营养

19、物质的吸收及对代谢废物的排放不利于培养材料对营养物质的吸收及对代谢废物的排放,从从而影响培养材料的生长。培养基的而影响培养材料的生长。培养基的pH可用酸度计测试可用酸度计测试,并用并用1mol/L盐酸或盐酸或1mol/L氢氧化钠调整至适宜范围（氢氧化钠调整至适宜范围（1mol/L盐酸盐酸配制方法配制方法:取取12mol/L HCl 84mL,加入蒸馏水定容至加入蒸馏水定容至1 000mL;1mol/L氢氧化钠配制方法氢氧化钠配制方法:称称40g NaOH,溶解后加入蒸溶解后加入蒸馏水馏水,定容至定容至1 000 mL）。培养的植物材料其生长最适）。培养的植物材料其生长最适pH范围范围为为5.6

20、6.0,培养基经高压高温灭菌后培养基经高压高温灭菌后,由于某些成分的降解或氧由于某些成分的降解或氧化化,酸度会增加酸度会增加,pH一般可降低一般可降低0.2,因此配制植物培养基时因此配制植物培养基时,通常通常调整调整pH至至5.8。2021/3/2313 对于某些不能高压高温灭菌的试剂或药品对于某些不能高压高温灭菌的试剂或药品,必须过滤除菌必须过滤除菌,待待培养基灭菌后未凝固之前（培养基灭菌后未凝固之前（4560）加入）加入,并轻摇使混匀。这并轻摇使混匀。这时时,每个培养容器的装入量和过滤除菌后的物质都要事先计算每个培养容器的装入量和过滤除菌后的物质都要事先计算好好,定量加入其中。植物培养基的

21、配制程序可用流程图表示如定量加入其中。植物培养基的配制程序可用流程图表示如下下:水水 药品药品 混匀混匀 pH调整调整 琼脂琼脂 加热溶解加热溶解 糖糖 玻璃器皿玻璃器皿 水洗水洗 干燥干燥 分装分装 密封密封 接种接种 冷却冷却 高温蒸汽灭菌高温蒸汽灭菌 2021/3/2314实验实验二二 长春花叶片愈伤组织的诱导长春花叶片愈伤组织的诱导一、一、实验目的实验目的 通过通过对长春花对长春花叶片愈伤组织叶片愈伤组织的的诱导诱导,分析生长素和细胞分分析生长素和细胞分裂素对裂素对长春花长春花叶片离体培养的叶片离体培养的作作用用,熟练掌握植物组织离体培熟练掌握植物组织离体培养培的养培的基本操作技术基本

22、操作技术,了解植物组织在离体培养条件下脱分化了解植物组织在离体培养条件下脱分化的的条件及条件及特点。特点。二、二、实验原理实验原理 根据根据植物细胞全能性理论植物细胞全能性理论,利用利用MS培养基培养基,加入一定浓度加入一定浓度的的生长素和细胞分裂素对生长素和细胞分裂素对长春花叶片组织进行培养长春花叶片组织进行培养,在光照或黑在光照或黑暗条件下均可诱导长春花叶片组织发生脱分化而产生愈伤组织暗条件下均可诱导长春花叶片组织发生脱分化而产生愈伤组织,这这已经在许多植物的组织培养中得到证实已经在许多植物的组织培养中得到证实,甚至在一些低等植甚至在一些低等植物物（如葫芦藓如葫芦藓）中也得到了证实。中也得

23、到了证实。2021/3/2315三、三、实验材料实验材料 1、实验设备、实验设备:超净工作台、高压灭菌锅、超净工作台、高压灭菌锅、pH计、计、光照培养光照培养 箱箱、暗培养箱。、暗培养箱。 2、实验器材、实验器材:三角瓶三角瓶（150 mL）、棕色瓶、棕色瓶（100 mL, 500 mL,1000 mL）、长柄长柄镊子、镊子、塑料塑料烧杯烧杯（500 mL,l000 mL）、玻璃烧杯、玻璃烧杯（100 mL、500 mL,l000 mL）、量筒（量筒（100 mL,500mL, 1000 mL）、）、培养皿培养皿（=12 cm）、手术手术刀刀。 3、实验试剂实验试剂:萘乙酸萘乙酸（Napthy

24、lacetic acid,NAA）、）、6-苄基苄基 氨基嘌呤氨基嘌呤（6-Benzylamino purine,6-BA）、）、 2,4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸（2,4- Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D）、）、KT （kinetin,KT）、升）、升汞汞（HgCl）、）、次次 氯酸钠氯酸钠 溶液溶液、95%酒精、酒精、蔗糖蔗糖（Sucrose）、）、琼脂琼脂 （Agar）、）、MS基本培养基母液。基本培养基母液。 2021/3/2316 4、试剂配制、试剂配制: （1）MS基本培养基基本培养基母母液液:见实验一见实验一MS培养基配方表。培养基配方表。 （2

25、）1 mol/L NaOH:将将40g NaOH溶解在溶解在1升升蒸馏水蒸馏水中中, 搅拌均匀。搅拌均匀。 （3）1 mol/L HCl:用蒸馏水将用蒸馏水将12mol/L的浓的浓盐盐酸稀释酸稀释12 倍。倍。 （4）生长调节剂）生长调节剂母母液液: 0.2 mg/mL萘乙酸萘乙酸（NAA）溶液溶液:精确精确称取称取20mg 萘乙酸萘乙酸,用少量用少量1 mol/L NaOH溶解后溶解后,用用蒸馏蒸馏水水 稀释并定容稀释并定容到到100 ml。 0.2 mg/mL 2,4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸（2,4-D）溶液）溶液:精精 确确称取称取20 mg 2,4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸,用少量用

26、少量1 mol/L 的的NaOH溶解后溶解后,用用蒸馏水蒸馏水稀释并定容到稀释并定容到100ml。2021/3/2317 0.2 mg/mL 6-苄氨基嘌呤苄氨基嘌呤（6-BA）溶液溶液:精确精确称取称取20 mg 6-苄基氨基嘌呤苄基氨基嘌呤,用少量用少量1 mol/L的的HCl溶解后溶解后, 用水稀释并定容到用水稀释并定容到100ml。 0.1 mg/mL KT（kinetin,KT）溶液溶液:精确精确称取称取10 mg KT,用少量用少量1 mol/L的的HCl溶解后溶解后,用水稀释并定容用水稀释并定容 到到100ml。 （5）75的消毒酒精的消毒酒精:精确量取精确量取75ml无水乙醇溶

27、于无水乙醇溶于100ml 蒸馏水蒸馏水中中。 （6）0.1%升升汞汞（HgCl）溶液）溶液:精确精确称取称取1 g HgCl,用用蒸馏蒸馏 水水溶解并定容到溶解并定容到1 000ml,盛装于棕色试剂瓶中避光保盛装于棕色试剂瓶中避光保 存。存。 （7）10%次氯酸钠溶液次氯酸钠溶液:精确量取精确量取100ml次氯酸钠溶液次氯酸钠溶液 溶溶,用蒸馏水溶解并定容到用蒸馏水溶解并定容到1 000ml,盛装于棕色试剂盛装于棕色试剂 瓶中避光保存。瓶中避光保存。 5、实验用植株、实验用植株:长春花长春花幼苗幼苗。2021/3/2318四、四、实验步骤实验步骤 1、MS完全完全培养基的配制培养基的配制: （

28、1）将各种贮液按比例混合将各种贮液按比例混合,配制成配制成MS培养基培养基（具体操（具体操 作见实验一）作见实验一）; （2）分别加入分别加入2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、 NAA 1.0mg/L、KT 0.2mg/L（此激素配方只适用于长春（此激素配方只适用于长春 花叶片愈伤组织的诱导。对于不同植物的外植体来花叶片愈伤组织的诱导。对于不同植物的外植体来 说说,影响其脱分化的激素种类和用量是不一样的影响其脱分化的激素种类和用量是不一样的, 必需通过正交试验来筛选才能获得最佳配方）必需通过正交试验来筛选才能获得最佳配方）;2021/3/2319 （3）培养基中加入培养基中

29、加入3蔗糖蔗糖,完全溶解后完全溶解后加加蒸馏水至终蒸馏水至终体体 积积; （4）用用l N的的NaOH调调整培养基整培养基至至pH 5.8; （5）加入）加入15g/L琼脂琼脂,将培养基将培养基置电磁炉上置电磁炉上煮沸煮沸至琼脂完全至琼脂完全 溶解溶解,然后然后分装到分装到150ml三角瓶中三角瓶中,每瓶每瓶约约70 ml,用用 封口膜包扎瓶口封口膜包扎瓶口; （6）将三角瓶放入高压灭菌锅将三角瓶放入高压灭菌锅,于于121、100KPa下灭菌下灭菌 1520 min。待。待压力下降为零压力下降为零,温度降低到温度降低到105以以 下下,打开放气阀排气后打开放气阀排气后,取出三角瓶取出三角瓶,平

30、放冷却备用平放冷却备用; （7）按上述方法高压灭菌按上述方法高压灭菌蒸馏蒸馏水水、空三角瓶、空三角瓶、培养皿培养皿（带（带 滤纸）及其它滤纸）及其它相关用具。相关用具。2021/3/2320 2、外植体的表面消毒与接种培养、外植体的表面消毒与接种培养: （1）取取长春花长春花完全展开的幼叶完全展开的幼叶,用自来水用自来水流水冲流水冲洗洗12 h; （2）在超净工作台上在超净工作台上用无菌水用无菌水将叶片将叶片洗涤洗涤23次次,每次每次1 min,然后然后浸于浸于含含75酒酒精精的的无菌无菌三角瓶三角瓶中中轻摇轻摇30s, 再再移入移入0.1升汞升汞溶液中溶液中轻摇轻摇58 min或或10的次氯

31、酸钠的次氯酸钠 溶液中溶液中轻摇轻摇810 min（消除外植体表面的微生物消除外植体表面的微生物）, 无菌水洗涤无菌水洗涤35次次（消毒液对外植体有很大伤害消毒液对外植体有很大伤害,必须必须 清洗干净清洗干净）,每次每次3 min;2021/3/2321 （3）将将消毒消毒后的后的长春花长春花叶片置于无菌培养皿内叶片置于无菌培养皿内（有无菌滤（有无菌滤 纸）纸）,用用手术手术刀将无菌叶片切成刀将无菌叶片切成5mm5 mm大小大小; （4）将适宜大小的外植体接种到培养基上将适宜大小的外植体接种到培养基上,每个三角瓶中接每个三角瓶中接 入入34块叶外植体块叶外植体; （5）将将接种好的接种好的三角

32、瓶置于三角瓶置于光培养光培养箱箱（光周期为光周期为:光照光照16 h 和黑暗和黑暗8 h,光照强度约光照强度约l500 lx左右左右）或或暗暗培养培养箱箱内的培内的培 养架上养架上,培养温度为培养温度为261; （6）每天观察培养情况）每天观察培养情况,记录结果。如记录结果。如:接种培养后接种培养后,外植外植 体（培养材料）在形态学上的变化情况体（培养材料）在形态学上的变化情况,愈伤组织开始愈伤组织开始 出现时间、愈伤组织诱导率、形态、生长速率、颜色变出现时间、愈伤组织诱导率、形态、生长速率、颜色变 化及质地等指标。预期结果见图化及质地等指标。预期结果见图2-1。2021/3/2322 【思考

33、题】【思考题】 1、影响长春花、影响长春花叶外植体叶外植体脱脱分化分化的条件及特点是的条件及特点是什什 么么? 2、对于同一物种的不同组织来说、对于同一物种的不同组织来说,其愈伤组织诱其愈伤组织诱 导条件是否一样导条件是否一样?为什么为什么?2021/3/2323实验实验八八 植物愈伤组织细胞的传代培养植物愈伤组织细胞的传代培养一、一、实验目的实验目的 1、 掌握掌握植物愈伤组织植物愈伤组织细胞传代培养的原理及操作方法。细胞传代培养的原理及操作方法。 2、 了解植物细胞培养的意义了解植物细胞培养的意义。二、二、实验原理实验原理 和动物细胞传代培养一样和动物细胞传代培养一样,植物细胞植物细胞传代

34、培养传代培养也也是组织培养的是组织培养的常规保种方法之一常规保种方法之一,是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中培养时培养瓶中培养时,细胞不断生长增殖细胞不断生长增殖,培养基中的营养成分逐渐耗培养基中的营养成分逐渐耗尽尽,同时也积累大量的代谢废物同时也积累大量的代谢废物,从而反馈抑制细胞的生长从而反馈抑制细胞的生长,甚至导甚至导致细胞褐化而死。致细胞褐化而死。这时需要进行分离培养这时需要进行分离培养,否则细胞会因生存空间否则细胞会因生存空间不足不足,营养障碍营养障碍,生长条件恶化生长条件恶化而死亡。细胞由原培养瓶内分离后而死亡。细胞由原培养瓶内

35、分离后转转到新的培养瓶中到新的培养瓶中继续培养继续培养的过程称为传代的过程称为传代培养培养。传代。传代培养培养可获可获得大量细胞供实验得大量细胞供实验或生产或生产所需。所需。2021/3/2324三、三、实验材料实验材料 1 1、实验设备、实验设备: :超净工作台、超净工作台、pH计、计、高压灭菌锅、高压灭菌锅、生化培生化培 养养箱。养养箱。 2、实验器材、实验器材:三角瓶三角瓶（150 mL）、棕色瓶、棕色瓶（100 mL, 500 mL,1000 mL）、长柄长柄镊子、镊子、塑料塑料烧烧 杯杯（500 mL,l000 mL）、玻璃烧杯、玻璃烧杯（100 mL、500 mL,l000 mL）

36、、量筒（量筒（100 mL,500 mL,1000 mL）、）、培养皿培养皿 （=12 cm）、手术手术刀刀。 3 3、实验试剂实验试剂: :萘乙酸萘乙酸（Napthylacetic acid,NAA）、）、6- 苄基氨基嘌呤苄基氨基嘌呤（6-Benzylamino purine,6- BA）、）、2,4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸（2,4- Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D）、）、 KT（kinetin,KT）、）、95%酒精、酒精、蔗糖蔗糖 （Sucrose）、）、琼脂琼脂（Agar）、）、MS基本培基本培 养基母液。养基母液。 2021/3/2325 4、生

37、长调节剂生长调节剂母母液液: 0.2 mg/mL萘乙酸萘乙酸（NAA）溶液溶液:精确精确称取称取20mg萘乙萘乙 酸酸,用少量用少量1 mol/L NaOH溶解后溶解后,用用蒸馏蒸馏水稀释并定水稀释并定 容容到到100 ml。 0.2 mg/mL 2,4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸（2,4-D）溶液）溶液:精确精确称取称取 20 mg 2,4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸,用少量用少量1 mol/L的的NaOH溶解溶解 后后,用用蒸馏水蒸馏水稀释并定容到稀释并定容到100ml。 0.2 mg/mL 6-苄氨基嘌呤苄氨基嘌呤（6-BA）溶液溶液:精确精确称取称取20 mg 6-苄基氨基嘌呤苄基氨基嘌呤

38、,用少量用少量1 mol/L的的HCl溶解后溶解后,用用 水稀释并定容到水稀释并定容到100ml。 0.1 mg/mL KT（kinetin,KT）溶液溶液:精确精确称取称取10 mg KT,用少量用少量1 mol/L的的HCl溶解后溶解后,用水稀释并定容到用水稀释并定容到 100ml。2021/3/2326 5、75的消毒酒精的消毒酒精:精确量取精确量取75ml无水乙醇溶于无水乙醇溶于100ml蒸蒸 馏水馏水中中。 6、实验、实验材料材料:长春花叶片愈伤组织细胞。长春花叶片愈伤组织细胞。2021/3/2327 四、四、实验步骤实验步骤 1、MS完全完全培养基的配制培养基的配制: （1）将各种

39、贮液按比例混合将各种贮液按比例混合,配制成配制成MS培养基培养基（具体操（具体操 作见实验一）作见实验一）; （2）分别加入分别加入2,4-D 0.5mg/L、6-BA 0.5mg/L、 NAA 0.5mg/L、KT 0.3mg/L（此激素配方只适用于长春花（此激素配方只适用于长春花 叶片愈伤组织细胞的生长。对于不同的愈伤组织细胞叶片愈伤组织细胞的生长。对于不同的愈伤组织细胞 来说来说,影响其生长的激素种类和用量是不一样的影响其生长的激素种类和用量是不一样的,必必 需通过正交试验来筛选才能获得最佳配方）需通过正交试验来筛选才能获得最佳配方）;2021/3/2328 （3）培养基中加入培养基中加入3蔗糖蔗糖,完全溶解后完全溶解后加加蒸馏水至终蒸馏