一种牡丹内生抑制金黄色葡萄球菌的枯草芽孢杆菌、其分离方法及应用

1、说 明 书 摘 要本发明公开了一种牡丹内生抑制金黄色葡萄球菌的枯草芽孢杆菌、其分离方法及应用，所述牡丹内生细菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Mdgb45，该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号是GDMCC NO ：60009。本发明的牡丹内生细菌菌株对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果，可用于防治金黄色葡萄球菌。而牡丹内生细菌菌株发酵产物中的蛋白粗提物可作为抑制金黄色葡萄球菌的活性物质，该活性物质经过植物体内的筛选，对人畜无毒、无伤害，可直接开发为新型抗菌药物。摘 要 附 图权 利 要 求 书1. 一种牡丹内生细菌，其特征在于：所述牡丹内生细菌为枯草芽孢杆菌（Ba

2、cillus subtilis）Mdgb45，该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号是GDMCC NO ：60009。2. 一种分离纯化牡丹内生细菌的方法，其特征在于包括：步骤1：从生长状态良好的牡丹根上剥取根皮，之后将根皮漂洗、冲洗、消毒、再冲洗后晾干作为样品，备用；步骤2：将最后一次冲洗用的液体涂布于平板中作为对照组，并在温度为28下恒温培养；步骤3：将样品放入无菌研钵中研磨至均匀，静置后取上清液并按1:9的比例稀释为2个梯度，之后把两个梯度的溶液涂布于固体平板上，并在温度为28的条件下培养，把每一个梯度再做3个重复，然后将对照组和样品组的两个梯度分别在平板上培养，用平板划线法对

3、不同的菌落进行分离、纯化，即获得分离纯化后的牡丹内生细菌。3. 根据权利要求2所述分离纯化牡丹内生细菌的方法，其特征在于：步骤1中漂洗根皮所用乙醇的质量百分比浓度为75%。4. 根据权利要求2所述分离纯化牡丹内生细菌的方法，其特征在于：步骤2中消毒根皮的具体方法是将根皮置于质量百分比浓度3%的次氯酸钠中浸泡3min。5. 一种利用牡丹内生细菌提取发酵液的方法，其特征在于包括：将牡丹内生细菌放于温度为37的NA培养基中过夜振荡培养，之后转移到PDA培养基中振荡培养48h，然后收集培养液，并在温度为4、转速为10000g的情况下离心2min，收集上清液并用0.22 m的无菌滤膜过滤除菌即得所述的发

4、酵液。6. 如权利要求1所述的牡丹内生细菌于防治金黄色葡萄球菌病原菌中的应用。7. 一种防治金黄色葡萄球菌病原菌的生防菌，其特征在于包括权利要求1-6中任一项所述的拮抗金黄色葡萄球菌的枯草芽孢杆菌。2说 明 书一种牡丹内生细菌、其分离方法及应用技术领域发明创造明属于生物技术领域，特别涉及一种牡丹内生抑制金黄色葡萄球菌的枯草芽孢杆菌、其分离方法及应用。背景技术植物内生菌是指生活在植物组织内，但不破坏宿主细胞而引起植物病害的一类微生物，它包括细菌、放线菌和真菌。植物内生菌可以从植物组织内部分离出来。目前药用植物内生菌能够产生多种抑菌、抗氧化的生物学活性物质，在生物制药，生物防治等领域具有非常广阔的

5、应用前景，成为许多学者争相研究的热点。0003牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews）是我国特有的传统花卉，具有极高的观赏价值和药用价值，其药用栽培品种以凤丹（Paeonia ostiiFeng Dan）为主，其根入药，名为“丹皮”，丹皮中含有牡丹酚、芍药甙、苯甲酸、挥发油及植物甾醇等多种药用活性物质，在抗菌、消炎、治疗心血管疾病、保肝、降血糖、降血脂、抗肿瘤等方面具有较好疗效。目前国内仅有一些关于牡丹内生真菌及次生代谢产物的研究。0004金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种较为常见的，易引起食物中毒的食源性致病菌，常会导致产品腐败和疾病传

6、染，对食品安全构成巨大的威胁。随着抗生素和防腐剂的大量使用，耐药性菌株大量产生，开发新的抑菌活性物质迫在眉睫。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在自然界广泛存在，对营养的要求不高且具有高度的耐盐性，它是人类化脓感染中最常见的病原菌，由于抗生素的广泛使用，已使90%多的金葡菌产生了耐药性，而且随着食品工业的快速增长，人们对食品防腐剂的安全性以及食品的保质期问题提出了更高的要求。一些食品腐败菌如金黄色葡萄球菌( Staphyloccocus aureus) 、大肠杆菌( Escherichia coli)等严重危害着食品安全，如何防止食品腐败变质及开发安全的食品防腐剂越来

7、越受到重视目前，筛选金葡菌拮抗菌株的来源主要有土壤和海洋两个途径，而牡丹内生菌的研究也仅在内生真菌及次生代谢产物的研究方面。将两者结合起来关于药用牡丹内生细菌拮抗金葡的研究几乎没有，本专利以药用植物牡丹根部内生细菌为材料，从中筛选能够抑制金黄色葡萄球菌生长的内生细菌菌株，并探讨其活性代谢产物的抑菌活性，从而开发出抑制金黄色葡萄球菌的新的活性物质，避免耐药性菌株的产生。发明内容本发明的主要目的在于提供一种牡丹内生抑制金黄色葡萄球菌的枯草芽孢杆菌、其分离方法及应用，以克服现有技术中的不足。为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：一种牡丹内生细菌，所述牡丹内生细菌为枯草芽孢杆菌（Bacillu

8、s subtilis）Mdgb45，该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号是GDMCC NO ：60009。本发明提出了一种分离纯化牡丹内生细菌的方法，包括：步骤1：从生长状态良好的牡丹根上剥取根皮，之后将根皮漂洗、冲洗、消毒、再冲洗后晾干作为样品，备用；步骤2：将最后一次冲洗用的液体涂布于平板中作为对照组，并在温度为28下恒温培养；步骤3：将样品放入无菌研钵中研磨至均匀，静置后取上清液并按1:9的比例稀释为2个梯度，之后把两个梯度的溶液涂布于固体平板上，并在温度为28的条件下培养，把每一个梯度再做3个重复，然后将对照组和样品组的两个梯度分别在平板上培养，用平板划线法对不同的菌落进行

9、分离、纯化，即获得分离纯化后的牡丹内生细菌。在一些较为具体的实施方案之中，步骤1中漂洗根皮所用乙醇的质量百分比浓度为75%。在一些较为具体的实施方案之中，步骤2中消毒根皮的具体方法是将根皮置于质量百分比浓度3%的次氯酸钠中浸泡3min。本发明还提出了一种利用牡丹内生细菌提取发酵液的方法，其特征在于包括：将牡丹内生细菌放于温度为37的NA培养基中过夜振荡培养，之后转移到PDA培养基中振荡培养48h，然后收集培养液，并在温度为4、转速为10000g的情况下离心2min，收集上清液并用0.22 m的无菌滤膜过滤除菌即得所述的发酵液。进一步的，本发明还提出了将所述的牡丹内生细菌于防治金黄色葡萄球菌病原

10、菌中的应用。此外，本发明还提出了一种防治金黄色葡萄球菌病原菌的生防菌，其包括所述的拮抗金黄色葡萄球菌的枯草芽孢杆菌本发明的枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) Mdgb45，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；地址：广州市先烈中路100号59号楼5楼，广东省微生物研究所；保藏日期：2016 年1月25 日；保藏号GDMCC NO ：60009。与现有技术相比，本发明的优点包括：本发明提出了一种牡丹内生抑制金黄色葡萄球菌的枯草芽孢杆菌、其分离方法及应用，本发明的牡丹内生细菌菌株对金黄色葡萄球菌具的良好的抑菌效果，可用于防治金黄色葡萄球菌。而牡丹内生细菌菌株发酵产物中的蛋白粗提物可

11、作为抑制金黄色葡萄球菌的活性物质，该活性物质经过植物体内的筛选，对人畜无毒、无伤害，可直接开发为新型抗菌药物。附图说明图1是枯草芽胞杆菌Mdgb45菌株对金黄色葡萄球菌的拮抗作用结果图。其中，A图是枯草芽胞杆菌Mdgb45菌株，B、C、D图是其他没有拮抗作用的菌株；图2是枯草芽胞杆菌Mdgb45菌株的菌落特征和菌体特征。其中，A图是枯草芽胞杆菌Mdgb45菌株的菌落特征，B 图是菌体革兰氏染色结果，C图是鞭毛染色结果；图3 是枯草芽胞杆菌Mdgb45菌株发酵液对金黄色葡萄球菌的拮抗作用结果图；图4 是枯草芽胞杆菌Mdgb45菌株发酵液中粗蛋白提取液对金黄色葡萄球菌的拮抗作用结果图。具体实施方式

12、鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。本实施方式中大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）由胰蛋白胨15g、大豆胨5g、NaCl 5g、琼脂17g和1000ml蒸馏水组成，pH7.3；牛肉膏蛋白胨培养基（NA）由牛肉膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖2.5g、琼脂17g和1000ml蒸馏水组成，pH7.2； PDA培养基由土豆200g、葡萄糖20g、琼脂17g和1000ml蒸馏水组成，自然pH值。实施例1：牡丹内生细菌Mdgb45分离和对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的平板抑菌作用。

13、运用5点取样法随机取洛阳理工学院西校区3、4月份牡丹根部组织，立即带回实验室作为内生细菌的分离材料。具体的分离纯化操作步骤如下：在自来水下将牡丹根表面刷洗干净晾干，将其根皮剥下混匀，随机取切好的根皮3g放于培养皿中，在超净工作台中用75%的乙醇漂洗30s后，立即用灭菌水冲洗3次，再用3%的次氯酸钠表面消毒3min，最后用灭菌水冲洗5次，无菌条件下晾干。吸取最后一次冲洗后的灭菌水0.2ml涂布于(TSA)平板中作为对照组，于28恒温培养48h。将经过表面消毒后的样品放入无菌研钵中，加入10ml的灭菌水，研磨至均匀。静置10min后，取上清液按1：9的比例稀释2个梯度，分别取0.2ml溶液涂布于(

14、TSA)固体平板，于28恒温培养48h，每一梯度设置3个重复，共3个梯度。待分离平板上长出菌落，定期观察分离平板，记录每个平板上的菌落数量，对各菌落形态进行观察记录并挑选出不同菌落。如果对照组平板上生长有菌落，则在实验组中剔除相应的菌落。进一步用(TSA)平板划线将不同的菌落进行分离、纯化，获得牡丹内生细菌菌株。 从指示菌株的菌种斜面上挑取一环接入3 mL (NA)培养基，37，转速160 r/min，过夜培养，制备出指示菌液。采用平板对峙法测定内生细菌对指示菌的抑菌作用。向培养皿（90mm）中倒入20 mL 已灭菌的NA培养基，待其凝固后，加入100L指示菌液（浓度调整为1.0 ×

15、107 cfu/mL），均匀涂布，静置5min。从纯化出的内生菌平板上挑取一环以对角的位置接入已经涂布指示菌的平板上，静置5min，培养皿于37 培养24h后测量抑菌圈大小。每处理重复三次。0016试验结果如图1所示，内生细菌菌株Mdgb45菌株对金黄色葡萄球菌具有强烈的抑菌作用，抑菌圈平均直径值为7mm。实施例2：牡丹内生细菌Mdgb45的鉴定实施主要采用菌体形态观察，生理生化特征测定和分子生物学手段相结合的方法对内生细菌Mdgb45进行鉴定。结果如图2所示，菌株Mdgb45在NA培养基上生长良好，菌落前期突起，干燥，乳白色，边缘锯齿状，后期菌落成褶皱。革兰氏染色均为阳性，菌体均为杆状，有鞭

16、毛，产生芽孢。16S rRNA的PCR扩增结果表明，菌株Mdgb45扩增产物为1511 bp，具体如如序列表SEQ ID NO.1所示，委托上海生工生物工程公司测序，获得菌株Mdgb45 16S rRNA基因全序列，序列登录号分别为KU570452。利用GenBank中的BLAST软件对菌株的16S rRNA基因序列进行分析，菌株Mdgb45的16S rRNA序列与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有较高的同源性，其相似性都高达99%。结合形态特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析，将菌株Mdgb45鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。实施例3

17、：牡丹内生细菌Mdgb45发酵液对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的平板抑菌作用。对筛选得到的拮抗菌株进行发酵培养，检测其发酵液的抑菌活性。挑取拮抗菌株单菌落于NA培养基中37过夜振荡培养，取600L加入20 mL新鲜液体PDA培养基中振荡培养48 h，发酵液10 000×g 4离心2 min 后，取上清用0.22 m的无菌滤膜过滤除菌。平板扩散法测定发酵上清液的抑菌活性，无菌操作取100L（1.0 ×107 cfu/mL）金黄色葡萄球菌均匀涂布于倒有固体NA培养基的培养皿中，小心放上3个无菌牛津杯，然后在每个牛津杯中分别加入100L的拮抗菌株的

18、发酵上清液，37恒温培养24h 后，测定抑菌圈直径，每处理重复三次。试验结果如图3所示，内生细菌菌株Mdgb45菌株的发酵液对金黄色葡萄球菌具有强烈的抑菌作用，抑菌圈平均直径值为10.5mm。实施例4：牡丹内生细菌Mdgb45的蛋白粗提液对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的平板抑菌作用。将筛选得到的菌株于NA液体培养基中活化过夜培养，取培养液3ml接种于80 mL PDA培养基中振荡培养48 h，发酵液10000r/min 离心20 min去菌体，取上清液，按分级沉淀法加入不同饱和度的硫酸铵，混匀，4静置过夜。盐析液10000r /min、4下离心15 min，收集

19、沉淀。磷酸缓冲液（0.2mol/L, pH 7）溶解沉淀，装入透析袋(透析袋截流分子量为8 kDa)中透析48 h。透析袋内溶液即为拮抗菌株的胞外蛋白粗提液。用0.22 m的无菌滤膜过滤蛋白粗提液，平板扩散法测定其抑菌活性，无菌操作取100L（1.0 ×107 cfu/mL）金黄色葡萄球菌均匀涂布于倒有固体NA培养基的培养皿中，小心放上3个无菌牛津杯，然后在每个牛津杯中分别加入100L的拮抗菌株的蛋白粗提液，37恒温培养24h 后，测定抑菌圈直径，每处理重复三次。试验结果如图4所示，内生细菌菌株Mdgb45菌株的蛋白粗提液对金黄色葡萄球菌具有强烈的抑菌作用，抑菌圈平均直径值为30.5

20、mm。以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。说 明 书 附 图图1图2图3波长图4序 列 表 说 明 书 SEQUENCE LISTING<110> 洛阳理工学院<120>一种牡丹内生抑制金黄色葡萄球菌的枯草芽孢杆菌、其分离方法及应用<130> 20160212<160> 1<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 1511<212> DN

21、A<213>枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Mdgb45<400> 1cggctacctt gttacgatt caccccaatc atctgtccca ccttcggcgg ctggctccta 60aaaggttacc tcaccgactt cgggtgttac aaactctcgt ggtgtgacgg gcggtgtgta 120caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc gattccagct 180tcacgcagtc gagttgcaga ctgcgatccg aactga

22、gaac agatttgtgg gattggctta 240acctcgcggt ttcgctgccc tttgttctgt ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat 300aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtcacc 360ttagagtgcc caactgaatg ctggcaacta agatcaaggg ttgcgctcgt tgcgggactt 420aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca ccacctgtca ctctgccc

23、cc 480gaaggggacg tcctatctct aggattgtca gaggatgtca agacctggta aggttcttcg 540cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg 600agtttcagtc ttgcgaccgt actccccagg cggagtgctt aatgcgttag ctgcagcact 660aaggggcgga aaccccctaa cacttagcac tcatcgttta cggcgtggac taccagggta 720tctaatcctg ttcgctcccc acgctttcgc tcctcagcgt cagttacaga ccagagagtc 780gccttcgcca ctggtgttcc tccacatctc tacgcatttc accgctacac gtggaattcc 840actct