紫杉醇生物合成的研究

1、植物学通报 1999 , 16 (2) :138149chi nese b ulleti n of b ota ny紫杉醇生物合成的研究王伟钟英长( 中山大学生命科学学院 广州 510275)摘要 抗癌新药紫杉醇是具有萜类环状结构的天然次生代谢产物 。研究紫杉醇的生物合成对于人为定向地提高合成效率以及克隆重组合成中的关键酶基因 ,进而提高紫杉醇的合成量 ,都是十分有意义的基 础工作 。本文以植物和微生物的次生代谢及其主要代谢途径为知识背景 ,介绍了紫杉烷类物质的基本结构及其结构骨架的分类情况 ,综述了近年来围绕紫杉醇二萜骨架和侧链基团的生物合成途径的研究进展 ,对合成中的影响因素进行了初步的讨

2、论 。关键词 次生代谢 ,次生代谢物 ,紫杉醇 ,生物合成a review o n taxol biosy nthesiswang weizhong ying2chang( school of life science , zhongshan university , guangzhou 510275)abstract taxol , a novel antitumor agent , is a terpenoid secondary product with ringed formulastructure . however , the pathways of taxol biosynthe

3、sis were still undefined. in this paper , a simple aspect about its secondary metabolism in plants and microorganisms was given. recent research ad2 vances on biosynthesis of the diterpenoid tricyclo carbon skeleton and side chain group s of taxol was reviewed. lastly , the influential factors on sy

4、nthesis metabolism of taxol were discussed.key words secondary metabolism , secondary products , taxol , biosynthesis1 次生代谢及其主要途径111 次生代谢的概念及主要代谢产物次生代谢 ( secondary metabolism) 指存在于某些生物 ( 如微生物和植物等) 当中有别于 初生代谢的一类特殊而且复杂的代谢类型 ;次生代谢物 ( secondary metabolites) 是一大类无 明显生理功能或者非生长发育所必需的小分子有机化合物 。通常认为 ,生物的次生代谢

5、是通过渐变或突变获得的一种适应生存的方式 ,是生物体在长期的进化当中对生态环境 适应的结果 。另一方面 ,由于某些情况下初生代谢与次生代谢之间有着不太清晰的界限 , 所以次生代谢的概念仍在进一步的发展和完善之中 。次生代谢物的产生 、分布和作用通常有种属 、器官 、组织和生长发育期的特异性 。代谢物的种类异常繁杂 ,化学结构迥异 ,分类方法不一 ,主要包括各种氨基糖衍生物 、酚类 、醌类 、黄酮类 、香豆素 、木质素 、环氧化物 、生物碱 、喹啉 、糖苷 、吲哚 、大环内脂 、萘 、核苷 、吩嗪 、吡咯 、萜类 、甾类 、皂甙 、多肽类 、多烯类 、多炔类 、有机酸 、毒素和色素等等 。从化学

6、结中山大学“211 工程”前沿项目基金资助 。构上简化之 ,可将植物的次生代谢产物归为酚类化合物 (芳香族) 、萜类化合物和含氮有机物 (生物碱) 三大类 。微生物的次生代谢产物则包括了多种结构的抗生素 ( 主要是糖类衍 生物 、多肽类 、多烯类 、大环内脂 、四环类和嘌呤类六种结构类型) 。根据结构特征和生理 作用也可将次生代谢物分为抗生素 (植保素) 、生长刺激素 、维生素 、色素 、生物碱与毒素等 不同类型 。微生物和植物的许多次生代谢物为人类提供了丰富的药物 、香料和工业原料 , 对人类的生产生活具有密不可分的重要影响 ; 一些次生代谢物则与机体的抗性 、信号传导 、适应调节 、生长发

7、育以及植物的花色香味等现象有关 ( 潘瑞炽等 ,1983 ; 卫扬保 ,1989) 。因此 ,对生物次生代谢的研究和利用 ,具有很大的理论和实践意义 。图 1 初生代谢和次生代谢的联系 (根据卫扬保教材补充)尽管次生代谢物的产生过程多种多样 ,许多途径目前仍然很不清楚 ,但各类产物的生 物合成途径都有一个大致的轮廓路线 。通常认为次生代谢物产生于乙酸 、莽草酸 、分支 酸 、丙二酸 、己糖磷酸 、2氨基己二酸及甲羟戊酸等少数几个前体 ,它们均来自初生代谢 ,140植物学通报16 卷一般处于代谢的分支点 (图 1) 。这些前体物质经酶催化形成几大类基本骨架 ,每一类结构大致相同 ,再经各种类型的

8、酶促反应进行修饰 ,产生千差万别的次生代谢产物 ,而且每 一类型的产物往往是一群化学结构非常相似的不同成分的混合物 ,这些混合物的组成情 况与机体状态和环境条件有密切的联系 。由此可见 ,次生代谢的途径是规律性与多样性 的统一 ,这在理论和实践上都有重要的指导意义 。112 次生代谢的主要途径根据几大类次生代谢产物的基本骨架和结构类型 , 它们分别具有下述的生源途径(mann ,1978 ; luckner ,1990) :11211 萜类化合物是经由三羧酸循环和脂肪酸代谢的重要产物乙酰 coa 出发 ,经过甲羟戊酸 、异戊烯基焦磷酸途径 ,然后分支生成各类群产物 。包括麦角甾醇 、赤霉素 、

9、脱落酸 、类固醇 、胡萝卜素 、类胡萝卜素 、甾醇 、鲨烯 、类异戊二烯 、柠檬烯 、薄荷醇 、甾体皂甙 、杜松烯 、棉酚 、青蒿素等 。11212 芳香族化合物是由磷酸戊糖循环途径生成的 42磷酸赤藓糖与糖酵解途径生成的 磷酸烯醇式丙酮酸缩合形成 72磷酸庚酮糖 ,经过一系列转化进入莽草酸和分支酸途径 ,然 后通过分支酸合成各种具有分支的芳香族氨基酸 ,最后生成芳香族代谢物 。如麦角酸 、原 儿茶酸 、儿茶酚 、黄酮及异黄酮类 、花青素 、香豆酸 、肉桂酸 、松柏醇 、木脂素 、木质素 、芥子 醇 、放线菌素 、支霉粘素 、吲哚霉素 、新生霉素等 。一些微生物合成的四环素 、氯霉素和绿 脓菌

10、素等也是通过分支酸的合成途径 。11213 含氮的生物碱化合物是由三羧酸循环途径合成氨基酸后再转化成各种生物碱 ;一 些含氮的2内酰胺类抗生素 、杆菌肽和毒素等也是通过氨基酸为前体合成 。吲哚类的生 物碱则可由莽草酸途径合成色氨酸后再转化而来 。11214由糖和糖的衍生物衍生而来的代谢物 。通过磷酸己糖衍生的有链霉素 、卡那霉素 、新 霉素 、艮它霉素 、巴龙霉素 、核糖霉素和壮观霉素 ;通过磷酸戊糖和磷酸丁糖缩合转变而来 的蕈毒碱和曲酸等 。11215 由脂肪酸代谢中的乙酸 (乙酰 coa) 至丙二酸 (丙二酰 coa) 聚合途径而合成的代谢 物 ,包括四环素 、红霉素 、力福霉素 、放线菌

11、酮等 。通过对次生代谢的途径及其影响因子的研究 ,可以进行对代谢过程的人工调控 ,甚至 实现对相关基因的定位 、克隆和人工重组 ,从而获得目的次生代谢产物的稳产高产 。2紫杉醇的生物合成211紫杉醇及紫杉烷二萜的结构类型紫杉醇 (taxol) 是从红豆杉植物得到的一种重要的次生代谢产物 ,是迄今发现具有显 著抗癌活性的少数天然化合物之一 ,目前已进入临床使用 。由于紫杉醇必须取自于植物 的树皮 ,含量甚微 (最高仅达 0 . 069 %) ,而且提取的同时造成相应植物资源的破坏 ,所以 自然资源十分有限 ,存在巨大的供求矛盾 。近二十多年 ,寻求新资源途径和替代物 ,一直 是各国科学家孜孜以求

12、的研究热点 。紫杉醇的化学结构分为两个部分 ,基本骨架部分是一个紫杉烷 (taxane) 类的三环二萜(图 2) ,侧链包括三个芳香环 ( 一个苯环 ,两个苯甲酰环) 和一个环氧丙烷环 (d 环) ,合起来有七个环 ,其核心为四环二萜 (wani 等 ,1971) (图 3) 。图 2 紫杉烷类结构的基本骨架图 3 紫杉醇的结构分子结构中具有三环二萜的基本骨架是紫杉烷类化合物的共同特征 。目前 ,从红豆杉属植物已分离出近 200 种紫杉醇类似物 (许多具有抗癌活性) ,大都具有紫杉烷骨架 ,不 同之处是这些化合物通常在这个骨架的 c1 、c2 、c5 、c7 、c10 和 c13 位上有不同的

13、取代基 。为归类计 , 根 据 c4 和 c20 位 的 结 构 差 异 , miller 等 将 已 发 现 的 紫 杉 烷 类 化 合 物 分 为 四 组(miller ,1980) (图 4) :图 4 紫杉烷类基本骨架的分组(1) a 类化合物 ; (2) b 类化合物 ; (3) c 类化合物 ; (4) d 类化合物 (taxine a) 。a 类化合物 :在 c4 、c20位有环外双健 (如 c4 位上的环外亚甲基) ;b 类化合物 :在 c4 、c20位有环氧乙烷环 ;c 类化合物 :在 c5 、c4 、c20位有环氧丙烷环 ; d 类化合物 :taxine a.142植物学通

14、报16 卷这些紫杉烷骨架的分类情形是针对典型的 6/ 8/ 6 三环式二萜骨架而制订的 。随着紫杉醇类似物发现数量的增多 ,也出现了少量其它环式的二萜骨架 ,依据这些骨架环式 ,进 一步将它们分成五大类 ,其中典型的 6/ 8/ 6 环系定为 i 型骨架 ,依此类推 ( 岳琴 ,1996) ( 图5) 。各型骨架上的基团分类情况参照 i 型骨架的 a 、b 、c 、d 方式进行 。这些分类编号对 于大量紫杉烷化合物的归类排序和新化合物的发掘具有重要的指导意义 。图 5 紫杉烷化合物的五种骨架类型212 紫杉醇骨架的生物合成为了从根本上解决紫杉醇新药的来源问题 ,对它的生物合成进行了多方面的探索

15、 ,但 比较紫杉醇的其它领域 ,生物合成的研究仍属薄弱 ,对具体的合成方式和途径 ,目前仍不够十分明朗 。现有生源途径的推断和假设 ,主要是建立在对所有已发现的紫杉烷类化合物的结构分析和其中某些化合物的化学性质基础之上 。紫杉醇是萜类化合物 ,根据生物次生代谢中萜类化合物的生源途径 ,紫杉醇的三环二 萜骨架应由乙酰 coa 开始 ,通过甲羟戊酸和异戊烯基焦磷酸途径 ,经过 牛儿基焦磷酸( geranyl pyrophosphate , gpp) ,然后两个 gpp 分子缩合 ,再由 牛儿 牛儿基焦磷酸 (geranylgeranyl pyrophosphate , ggpp) 环化而成 (ma

16、nn ,1978 ; luckner ,1990) ( 图 6) 。zamir 等 ( 1992) 用放射性同位素标记的前体进行喂饲实验 , 证明紫杉醇的三环二萜骨架来自甲羟戊酸 (mva) ,乙酰基来自乙酸 (乙酰 coa) (图 10) 。根据上述的甲羟戊酸次生代谢途径 , erdtman 等 ( 1964) 、dauben 等 ( 1962) 、harrison 等(1966) 和 gueritte2voegelein 等 (1987) 进一步认为在 牛儿 牛儿基焦磷酸以下 ,三环二萜 骨架在环化形成过程中很可能是通过 cembrene 和 verticillene 两种中间产物过程来实

17、现的(图 7) 。在生物合成途径的化学模拟方面 ,dauben 等 (1979) 试图通过使 cembrene 和 isocembrol 的酸催化反应 ,将 cembrene 环化形成紫杉烷骨架 ;begley 等 ( 1990) 试图环化 verticillene 和 verticillene 的环氧化物 (verticillene 7 ,82epoxide 、verticillol 7 ,82epoxide) ,但结果他们都没有得到所希望的骨架产物 。虽然不能因此而否定上述假设的紫杉醇骨架的生物合成途径 ,但正如 kingston 所指出的 ,生物合成的途径比我们的认识要复杂得多 ( ki

18、ngston ,1991) 。图 6 合成萜类化合物的甲羟戊酸途径示意图经过环化反应后 ,形成三环二萜的基本骨架 ,此后骨架在 c1 、c2 、c5 、c7 、c9 、c10和 c13位 上经进一 步 的 修 饰 , 分 别 形 成 a 、b 、c 类 化 合 物 。senilh 等 ( 1984) 、gueritte2voegelein 等 (1987) 对紫杉烷基本骨架上的 a 、b 、c 类化合物在骨架结构上的不同点及其相互演变过 程进行了探索 。根据一些化学实验的结果和结构化学推测 ,他们认为 c 类化合物 ( 包括 紫杉醇) 是由具有环化亚甲基的 a 类化合物通过分子内酯化而来的 (

19、 图 8) 。图 8 中 i 的 c5 位的酯基与 c13位的羟基形成原碳酸酯 ,变为中间态 ii ;在 ii 中 c5 位的酯基转移 到 c13的位形成化合物 iii 即 a 类化合物 ; iii 环氧化和乙酰化后衍变为 iv 即 b 类化合144植物学通报16 卷物 。之后 iv 的环氧环打开 ,成为中间态 v ,至此 ,中间态 v 中 c20 位的羟基在位进攻c5 并且乙酰基从 c5 位转移到 c4 位的正碳原子上 ,形成化合物 vi 即 c 类化合物 ( gueritte2voegelein 等 ,1987) 。这个过程的假设可以解释在紫杉醇的分离和提取中之所以常常得到 紫杉烷的混合物

20、 ,而不是单一的化合物 。图 7 紫杉烷三环二萜骨架的生物合成可能途径213紫杉醇侧链的生物合成紫杉醇的侧链和维持某些必需的构型是保证紫杉醇抗癌活性的关键因素 。对侧链生 物合成途径的了解 ,对于促进紫杉醇的生物合成和在人工培养中提高紫杉醇的产量都有 实际意义 。图 8 紫杉烷类化合物基本骨架的生物合成途径侧链合成的研究是从紫杉碱 ( taxine) 及与其侧链相关的前体物质 winterstein 酸开始的 。早先 ,winterstein 等 (1921 ,1923) 将所获得的非晶形紫杉碱进行酸水解 ,可以得到几乎 等分子的乙酸和一种含氮的酸 (winterstein 酸) ,后者进一步

21、加热分解后变成二甲基胺和苯146植物学通报16 卷丙烯酸 (cinnamic acid ,肉桂酸) ,由此并经后来人工合成证明 winterstein 酸为2二甲基氨基22苯基丙酸 ,这应该是紫杉碱生物合成过程中合成侧链的一个前体 ,也可能是一个中间产 物 。baxter 等 (1962) 亦通过水解去掉紫杉碱的二甲基胺部分 ,其余部分乙酰化后得到一种 乙酰化的 o2苯丙酰紫杉碱 (o2cinnamoyltaxicins) ,这种由紫杉碱衍生而来的物质被结晶出 来并进行了功能基团的研究 。leete 等 (1966) 和 platt 等 (1984) 通过同位素示踪对 winter2 stei

22、n 酸的生物合成进行了研究 ,结果认为苯丙氨酸 ( phe) 是 winterstein 酸最好的合成前体(图 9) 。图 9 由 phe 生物合成 winterstein 酸strobel 等 (1992) 用14 c2苯丙氨酸 、14 c2亮氨酸及 1214 c2乙酸钠为前体 ,喂饲短叶红豆杉 无菌树皮小块 ,证明苯丙氨酸 、亮氨酸和乙酸钠都是紫杉醇的前体 。其中乙酸钠不仅掺入 到乙酰基 ,而且能掺入到苯环及紫杉烷骨架中 。zamir 等 (1992) 也用放射性同位素标记的 前体进行喂饲实验 ,结果表明 ,侧链乙酰基来自乙酸 ( 乙酰 coa) ,而 c13 位酯基侧链中的 phchch

23、 (oh) coo2则来自苯丙氨酸 (图 10) 。图 10 紫杉醇生物合成的示踪研究 (引自 zamir 等 ,1992)这些同位素示踪试验都证明了有关紫杉醇的骨架和侧链生源途径假设的正确性 ,苯丙氨酸作为前体合成紫杉醇的侧链 。在假设的具体途径 ( 图 11) 中 , fleming 等 (1993) 发现 放射性同位素标记的肉桂酸 (7 、9) 及其环氧化物 (8) 都未掺入到紫杉醇及其类似物三尖杉 宁碱 (cephalomannine ,又称 taxol b) (6) 中 ,而2苯丙氨酸 (4) 和苯基异丝氨酸 ( 5) 则掺入到 紫杉醇和三尖杉宁碱的侧链中 。因此认为紫杉醇的侧链是由

24、苯丙氨酸 (3) 在氨基变位酶 的作用下形成2苯丙氨酸 ,再经过 c2 位羟基化 ,最后经过 nh2 基的酰基化而形成的 。其 中的苯甲酰基是由2苯丙氨酸变成苯基异丝氨酸后产生的 ,而不是由于苯丙氨酸形成肉桂酸后产生的 ,这就是说 ,途径 a 、d 是可能的 ,而 b 、c 则是不可能的 。图 11 由苯丙氨酸合成紫杉醇侧链的可能途径 (引自 fleming 等 ,1993)综上 ,紫杉醇的侧链合成途径已经有了越来越明晰的结论 ,尽管这些结果仍有待于继续的验证 ,但加入前体物质可以提高培养细胞中紫杉醇的含量却已是不争的事实 。这些 体外试验的结果不仅可以继续确证现有的生物合成假设途径 ,而且在

25、生物转化的实践中 具有很好的应用价值 。随着对合成途径的进一步研究和分子生物学技术的运用 ,用基因 工程方法对细胞进行改造 ,还将大大提高这种生物转化的效率 。214 紫杉醇生物合成中的一些影响因素生物的次生代谢往往受遗传 、环境和生理等多种因素的影响 ,不像初生代谢那样相对 稳定 ,紫杉醇及其类似物的合成作为次生代谢的类型之一也不例外 。首先 ,遗传结构是紫杉醇合成能力的主要决定因素 ,不同基因型以及同一基因型不同 个体间 、同一个体的不同部位 ,紫杉醇的合成能力不尽相同 。排除一些外来因素的影响 ,这些不同可能与机体内部的自身调控和基因表达有直接的联系 。strobel 等 (1992)

26、的研究148植物学通报16 卷表明 ,对于整株植物而言 ,树冠上部枝条 、根 、根茎处以及侧枝的树皮合成紫杉醇的能力都不如主茎树皮的合成能力强 ,而树皮中合成能力又以内层韧皮部和白色的形成层组织最 强 。类似这种反映不同树种 、不同个体以及不同部位的紫杉醇合成量差异的报告还有许 多 。wickremesinhe 等在筛选高产细胞系的工作中 ,利用愈伤组织的变异及异质性 ,已经得 到一些紫杉醇含量比较高的克隆细胞系 (wickremesinhe 和 arteca ,1991) 。其次 ,紫杉醇的合成还明显地受生理和环境条件的影响 ,外加甾类化合物生物合成的 抑制剂矮壮素 ( 1 . 58 mmo

27、l/ l) 可以促进紫杉醇的合成 。collins 等 (1993) 发现喷洒赤霉酸( ga3) 、细胞分裂素和嘧啶醇可以促进针叶红豆杉 ( taxus media) 紫杉醇的生物合成 。估计 这与一些代谢途径被底物反馈抑制有关 ,比如赤霉酸的反馈抑制使赤霉酸合成支路被抑制 ,有利于代谢朝着与其竞争的紫杉醇合成途径方向进行 ,从而促进紫杉醇的生物合成 。甘烦远等 (1996) 亦证实另一类甾体合成代谢抑制剂氯化胆碱 ( ccc) 能提高紫杉醇的含量60 %以上 (高浓度则反而抑制紫杉醇的合成) 。在体外试验系统中加入一些寡糖混合物也 可以明显提高紫杉醇的含量 ,寡糖类的真菌诱导子 void g

28、lucan 和 pool232elicitor 以及短叶红豆杉内生真 菌 ( mucor sp . 和 phoma sp . ) 的 水 溶 性 提 取 物 都 可 以 促 进 合 成 ( strobel 等 ,1992) 。在云南红豆杉的悬浮培养细胞中 ,5 . 0 mg/ l 的人参寡糖素 ( go) 既能够提高培养 细胞的生长率 (比对照增加 3617 %) ,又能大大提高紫杉醇的含量 (比对照增加 3 倍) ,并且可使紫杉醇分泌到培养基的比例增加 ( 由对照 30 %提高到 50 %左右) ( 甘烦远等 ,1996) 。fett2neto 等 (1993) 也发现用 0 . 2 、1

29、. 0 和 1010 mmol/ l 苯丙氨酸 、丝氨酸 、甘氨酸 、丙氨酸 、苯甲酸 、马尿酸 、32氨基232苯基丙酸喂饲东北红豆杉的愈伤组织时 ,其中几种对紫杉醇及其类似物的产量有很大影响 。christen 等 ( 1991) 用添加了酪蛋白氨基酸 ( ca) 和 2 ,42二氯 苯氧基乙酸 (2 ,42d) (或用萘乙酸 (naa) 代替 2 ,42d) 的 gamborgs b5 液体培养基 ,通过加入真菌壳囊孢属 ( cytospora abietis) 、青霉属 ( penicillium minioluteum ) 等生物性诱导物和硫酸 氧钒 、3 , 4 2二氯苯氧三乙基化

30、合物 ( 胺) 等非生物性诱导物 , 不仅提高了悬浮培养细胞中的 紫杉醇含量 , 而且可以诱导紫杉醇向培养基中分泌 。李家儒等 ( 1998) 用桔青霉 ( penicilli2 um citrinum ) 诱导子 ,证实诱导子对紫杉醇合成的浓度效应属于最适浓度型而不是反应饱 和型 ,其作用是促进细胞内可溶性蛋白含量的增加 ,进而推测可能促进了调节紫杉醇代谢 的相关酶的合成 。除此而外 ,植物形态 、光照条件 、季节等条件因素对紫杉醇合成的影响情况 ,也进行了初步的比较分析 ( kelsey 和 vance ,1992 ;vanek 等 ,1993) 。3 展望自从紫杉醇的抗癌功效被确定 ,尤

31、其是其极为有限的资源已成为临床应用的制约因素 ,人们就希望通过研究紫杉醇的生物合成途径来找到扩大药源的有效办法 (生物的或化 学的) 。紫杉醇及其类似物的结构包括骨架和侧链两大部分 ,原始产出物为高等植物 ,量微 ,不稳定 ,产物复杂以及检测困难 ,这些因素成为研究合成途径的障碍 。根据现有的知识和研究成果 ,已经有一些合成途径的假说 ,其中的某些步骤以及影响的因素也只是有了 初步的结果 。另外紫杉醇在细胞中的合成场所也没有定论 ,普遍认为细胞的质体部分是 合成的主要场所 ,尚待进一步证实 。但这些工作已经可以对提高组织和器官培养中紫杉醇的产量提供指导 。全面弄清紫杉醇及其类似物的生物合成途径

32、是一项困难的工作 ,然而当植物次生代谢的分子生物学和某些关键酶的分子克隆及基因工程正日益成为生命科学新的研究热点的时候 ,人们有可能通过某一两个关键酶的发现 、纯化和基因克隆而使紫 杉醇合成途径的研究首先得到突破并取得应用效果 。目前 ,植物的异戊二烯途径中已有 多个萜类合成酶的基因被 克 隆 , 包 括 4 种 植 物 的 单 萜 、倍 半 萜 和 二 萜 合 成 酶 ( chappel ,1995) ,相信利用这些成熟的技术也可以克隆红豆杉植物的相关基因 ,一旦有所突破 ,将对 于红豆杉的细胞培养 、细胞改造和基因工程产生十分积极的推动作用 。另一方面 ,积极地 寻找能合成紫杉醇或其类似物

33、的微生物 ,从微生物的合成途径中定位关键酶和克隆相关基因 ,将比对植物的研究有更大的方便之处 ,这是研究紫杉醇生物合成的又一条希望之 路 。参考文献卫扬保编 ,1989 . 微生物生理学 ,北京 :高等教育出版社 ,第 299 324 页甘烦远 ,彭丽萍 ,郑光植 ,1996 . 云南植物研究 ,18 (4) :451453李家儒 ,刘曼西 ,曹孟德等 ,1998 . 植物研究 ,18 (1) :7882岳琴 ,1996 . 国外医学药学分册 ,23 (6) :327329潘瑞炽 ,董愚得编 ,1983 . 植物生理学上册 ,第二版 ,北京 :高等教育出版社 ,第 164180 页baxter

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