第十三章 生物芯片

1、第十三章第十三章 生物芯片技术生物芯片技术 一、生物芯片的概念一、生物芯片的概念 :(Biochip) 所谓生物芯片就是缩小了的生物化学分析器，所谓生物芯片就是缩小了的生物化学分析器，通过芯片上微加工获得的微米结构和生物化学通过芯片上微加工获得的微米结构和生物化学处理结合，将成千上万个与生命相关的信息集处理结合，将成千上万个与生命相关的信息集成在一块厘米见方的氧化硅，玻璃或塑料等材成在一块厘米见方的氧化硅，玻璃或塑料等材质制成的芯片上。是将生命科学研究中所涉及质制成的芯片上。是将生命科学研究中所涉及的不连续的分析过程（如样品制备、化学反应的不连续的分析过程（如样品制备、化学反应和分析检测），利

2、用微电子、微机械、化学、和分析检测），利用微电子、微机械、化学、物理技术、计算机技术在固体芯片表面上构建物理技术、计算机技术在固体芯片表面上构建的微流体分析单元和系统使之连续化、集成化、的微流体分析单元和系统使之连续化、集成化、微型化。微型化。 包括四个基本要点 芯片方阵的构建、样品的制备、生物分子反应和信芯片方阵的构建、样品的制备、生物分子反应和信号的检测等。号的检测等。 1.芯片制备是先将玻璃片或硅片进行表面处理，然芯片制备是先将玻璃片或硅片进行表面处理，然后使后使DNA片断或蛋白质分子按顺序排列在芯片上片断或蛋白质分子按顺序排列在芯片上 2.生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除生物

3、样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应。可将少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应。可将样品进行处理，获取其中的蛋白质或样品进行处理，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，并且加以标记，以提高检测的灵敏度。并且加以标记，以提高检测的灵敏度。 3.生物分子反应为芯片上的生物分子之间生物分子反应为芯片上的生物分子之间的反应，是芯片检测的关键一步。通过选的反应，是芯片检测的关键一步。通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状态中，减少生物分子之间的错配率。最佳状态中，减少生物分子之间的错配率。 4.芯片信号检测，常用的芯片信

4、号检测方芯片信号检测，常用的芯片信号检测方法是将芯片置入芯片扫描仪中，通过扫描法是将芯片置入芯片扫描仪中，通过扫描以获得有关生物学信息。以获得有关生物学信息。 生物芯片原理及应用芯片模式图 二、生物芯片的主要类型二、生物芯片的主要类型 D N A C h ip s P ro te in C h ip sL a b C h ip sB io c h ip s(一一) 基因芯片（基因芯片（Genechip） 又称又称DNA芯片芯片(DNAchip)。它是在基因探。它是在基因探针的基础上研制出的，它将大量探针分子针的基础上研制出的，它将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记样品进行杂固定于支持物上，

5、然后与标记样品进行杂交，检测杂交信号的强度及分布，以获取交，检测杂交信号的强度及分布，以获取样品分子的数量和序列信息。可同时对数样品分子的数量和序列信息。可同时对数以千亿的以千亿的DNA片断同时进行处理分析。基片断同时进行处理分析。基因芯片技术的主要特点：技术操作简单、因芯片技术的主要特点：技术操作简单、自动化程度高、序列数量大、检测效率高、自动化程度高、序列数量大、检测效率高、应用范围广、成本相对低。应用范围广、成本相对低。 DNA微点阵芯片的微点阵芯片的制作方法和分类：制作方法和分类： 1.原位合成型(In Situ Synthesis) 指根据预先设计的点阵序列在每个位指根据预先设计的点

6、阵序列在每个位点通过有机合成的方式直接聚合得到点通过有机合成的方式直接聚合得到所要求的探针分子。聚合之后芯片片所要求的探针分子。聚合之后芯片片基的制作即告结束。该方法有两类：基的制作即告结束。该方法有两类：光引导原位聚合技术与压电打印原位光引导原位聚合技术与压电打印原位聚合技术。聚合技术。光引导原位聚合技术 简要过程是使支持物羟基化，用光敏集团将简要过程是使支持物羟基化，用光敏集团将其保护起来，选择适当的蔽光膜（其保护起来，选择适当的蔽光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其它部分不透光，使需要聚合的部位透光，其它部分不透光，光通过蔽光膜照射致支持物上，受光部位的光通过蔽光膜照射致支持物上，受

7、光部位的羟基解保护，进而与单体分子共价结合。合羟基解保护，进而与单体分子共价结合。合成所用的单位分子一端按传统固相合成方法成所用的单位分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护。发生偶活化，另一端受光敏保护基的保护。发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护集团。联的部位反应后仍旧带有光敏保护集团。 因此，每次通过控制蔽光膜的图案（透光因此，每次通过控制蔽光膜的图案（透光不透光）决定哪些区域被活化，以及所用不透光）决定哪些区域被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在特定单体的种类和反应次序就可以实现在特定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。本位点合成大量预定序列寡聚体的目的。本方

8、法优点是合成效率高，点阵密度高。缺方法优点是合成效率高，点阵密度高。缺点为设备昂贵，技术复杂，反应产率低。点为设备昂贵，技术复杂，反应产率低。 芯片合成动画芯片合成动画1 芯片检测动画芯片检测动画2压电打印原位聚合技术 其装置与普通的彩色喷墨打印机相似，所用其装置与普通的彩色喷墨打印机相似，所用技术也是常规的固相合成方法。即将墨盒中技术也是常规的固相合成方法。即将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂替代，支持的墨汁分别用四种碱基合成试剂替代，支持物经包被后，通过计算机控制喷墨打印机将物经包被后，通过计算机控制喷墨打印机将特定种类的试剂喷洒到预定的区域上。冲洗、特定种类的试剂喷洒到预定的区域上。冲

9、洗、去保护、偶联等同于一般的固相原位合成技去保护、偶联等同于一般的固相原位合成技术。如此类推，可合成出长度为术。如此类推，可合成出长度为4050bp的的探针。本法优点是设备廉价，技术相对简单，探针。本法优点是设备廉价，技术相对简单，反应产率高。缺点是点阵密度低，易产生交反应产率高。缺点是点阵密度低，易产生交叉污染。叉污染。 2.点膜型 合成工作用传统的合成工作用传统的DNA固相合成仪完成，固相合成仪完成，合成后用特殊的自动化微量点样装置将其合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼纶以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼纶膜或玻片上。支持物应事先进行特定处理，膜或玻片上

10、。支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖氨酸或氨基例如包被以带正电荷的多聚赖氨酸或氨基硅烷，以便能够牢固地结合寡核苷酸分子。硅烷，以便能够牢固地结合寡核苷酸分子。该方法是目前大多数中小型公司所采用的该方法是目前大多数中小型公司所采用的方法。本法优点为设备廉价，技术简便，方法。本法优点为设备廉价，技术简便，研制周期短，灵活性高。缺点是点阵密度研制周期短，灵活性高。缺点是点阵密度低。低。 接触式点样接触式点样：Chipmaker Pin (Telechem专利)非接触式点样：nQUAD Technology 点膜型根据支持物的不同，有如下几种：点膜型根据支持物的不同，有如下几种： 薄

11、膜型：如聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼薄膜型：如聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼纶膜等。这种类型芯片的点阵是通过点膜纶膜等。这种类型芯片的点阵是通过点膜形式制作的，并通过一定的方法使探针能形式制作的，并通过一定的方法使探针能够牢固地结合于其上，整个过程类似于斑够牢固地结合于其上，整个过程类似于斑点杂交技术（如点杂交技术（如clone tech公司）。公司）。 玻片型：这种芯片的点阵是通过原位合成玻片型：这种芯片的点阵是通过原位合成技术制作的，点阵密度很高，须借助于特技术制作的，点阵密度很高，须借助于特殊的仪器对测定结果进行解读和分析。当殊的仪器对测定结果进行解读和分析。当前具有此类产品研制能力的公司很少

12、（如前具有此类产品研制能力的公司很少（如Affymetrix公司）。公司）。 微板型；这种芯片是一种具有高密度小容量测试孔的小型酶联免疫检测板（如PE公司等）。 集成电路型：将杂交技术与微电子技术结合于一体有目的地通过电子装置检测或控制DNA等生物大分子的作用过程（如Nanogen公司）。 点膜型动画 DNA microarray spots - the red fluorescence originates from genes expressed in normal tissue, green from genes expressed in abnormal tissue, and yel

13、low (red + green) for commonly expressed genes. The intensities represent relative populations. The Amersham DNA quantitation kit reader. A fluorescent dye, Hoeshst 33258, is used to label DNA, and the resulting fluorescence intensity represents the concentration of DNA present in a sample. 3基因芯片的应用

14、基因芯片的应用 基因表达检测：人类基因组编码大约基因表达检测：人类基因组编码大约10万个万个不同的基因，仅掌握基因序列信息资料，要不同的基因，仅掌握基因序列信息资料，要理解其信息功能是远远不够的，因此，具有理解其信息功能是远远不够的，因此，具有检测大量检测大量mRNA的实验工具很重要。基因芯的实验工具很重要。基因芯片技术易于检测非常大量的片技术易于检测非常大量的mRNA并能敏感并能敏感地反映基因表达中心的微小变化。利用基因地反映基因表达中心的微小变化。利用基因芯片技术人们已比较成功地对多种生物包括芯片技术人们已比较成功地对多种生物包括拟南芥、酵母及人的基因组表达情况进行了拟南芥、酵母及人的基因

15、组表达情况进行了研究，并且用该技术（共研究，并且用该技术（共157112个探针分子）个探针分子）一次性检测了酵母几种不同株间数千个基因一次性检测了酵母几种不同株间数千个基因表达谱的差异。表达谱的差异。 应用之一 基因表达谱（gene expression pattern) Research Use. Clinical Diagnostic Use. 寻找新基因：有关实验表明，在缺乏任何序寻找新基因：有关实验表明，在缺乏任何序列信息的条件下，基因芯片也可以用于基因列信息的条件下，基因芯片也可以用于基因发现，如发现，如HME基因和黑色素瘤生长刺激因基因和黑色素瘤生长刺激因子就是通过基因芯片技术发现

16、的。子就是通过基因芯片技术发现的。 DNA测序：人类基因组计划的实施促进了更测序：人类基因组计划的实施促进了更高效率的能够自动化操作的测序方法的发展，高效率的能够自动化操作的测序方法的发展，芯片技术中杂交测序技术及邻堆杂交技术即芯片技术中杂交测序技术及邻堆杂交技术即是一种新的高效快速测序方法。如使用美国是一种新的高效快速测序方法。如使用美国Affymetrix公司公司1998年生产出的带有年生产出的带有13.5万万个基因探针的芯片就可以使人类个基因探针的芯片就可以使人类DNA解码速解码速度提高了度提高了25倍。倍。Prototype AmpliOnc I Biochip cDNA microa

17、rray expression patterns of small (S) and large (L) neurons 核酸突变的检测及基因组多态性分析：有核酸突变的检测及基因组多态性分析：有关实验结果表明关实验结果表明DNA芯片技术可快速、准芯片技术可快速、准确地研究大量患者样品中特定基因所有可确地研究大量患者样品中特定基因所有可能的杂合变异。对人类基因组单核苷酸多能的杂合变异。对人类基因组单核苷酸多态性的鉴定，已开始了围绕人体蛋白质进态性的鉴定，已开始了围绕人体蛋白质进行的研究，以全面破解主导人体内所有化行的研究，以全面破解主导人体内所有化学反应的蛋白质，了解人体所有蛋白质之学反应的蛋白质

18、，了解人体所有蛋白质之间的功能及相互间的关系，以及它们引发间的功能及相互间的关系，以及它们引发疾病的原理。疾病的原理。 芯片结果分析三维图 基因芯片聚类分析图 二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片 蛋白质芯片与基因芯片的基本原理相同，但它利蛋白质芯片与基因芯片的基本原理相同，但它利用的不是碱基配对，而是抗体与抗原结合的特异用的不是碱基配对，而是抗体与抗原结合的特异性即免疫反应来检测。性即免疫反应来检测。 蛋白质芯片构建的简化模型为：选择一种固相载蛋白质芯片构建的简化模型为：选择一种固相载体能够牢固地结合蛋白质分子（抗原或抗体），体能够牢固地结合蛋白质分子（抗原或抗体），这样形成蛋白质的微阵列，即蛋白质

19、芯片。如果这样形成蛋白质的微阵列，即蛋白质芯片。如果加入与之特异性反应的带有特殊标记蛋白质分子加入与之特异性反应的带有特殊标记蛋白质分子（抗体或抗原），两者结合后，通过对标记物的（抗体或抗原），两者结合后，通过对标记物的检测来实现抗原抗体的互检，即蛋白质的检测。检测来实现抗原抗体的互检，即蛋白质的检测。此种方法构建的模型所需蛋白质的量极少，反应此种方法构建的模型所需蛋白质的量极少，反应相对较快，蛋白质芯片稳定性较好，灵敏度较高，相对较快，蛋白质芯片稳定性较好，灵敏度较高，在临床检测方面大有发展。在临床检测方面大有发展。蛋白芯片(Protein Chips)a microarray-based

20、high-throughput protein assay methodChemiluminescence or Fluorescence based detection methods can be used to visualize bound antibodies.96-well microtitre plates represent the industry standard for high-throughput screening of drug-leads. The relative efficacy of a drug lead against a target (cell,

21、protein or antibody) is often determined from the measurement of fluorescence. 蛋白质芯片的应用 美国加利福尼亚的美国加利福尼亚的ciphergen生物技术公司生物技术公司生产的生产的SELDI蛋白质芯片系统，能够从人蛋白质芯片系统，能够从人体体液或组织中获取大量的微量蛋白质，体体液或组织中获取大量的微量蛋白质，以绘制捕获的蛋白质图谱。这种芯片系统以绘制捕获的蛋白质图谱。这种芯片系统已被用来确定和部分验证前列腺癌和卵巢已被用来确定和部分验证前列腺癌和卵巢癌的一些标记。癌的一些标记。 印度普度大学的科学家们宣布，他们已

22、经印度普度大学的科学家们宣布，他们已经率先研制成功一种蛋白质生物芯片，通过率先研制成功一种蛋白质生物芯片，通过这种生物芯片，医生可以利用含有生物芯这种生物芯片，医生可以利用含有生物芯片的医疗设备迅速而准确地对一般疾病进片的医疗设备迅速而准确地对一般疾病进行诊断并对某些化学治疗方法进行评估；行诊断并对某些化学治疗方法进行评估；它还可以帮助士兵在战场上探测到来自敌它还可以帮助士兵在战场上探测到来自敌方的生化攻击；对农作物的病虫害进行探方的生化攻击；对农作物的病虫害进行探测并发生警告；还能帮助科学家们对人们测并发生警告；还能帮助科学家们对人们常用来治病的植物进行分析，看其是否含常用来治病的植物进行分

23、析，看其是否含有具治疗效果的化学成份，从而研制并生有具治疗效果的化学成份，从而研制并生产出新药品。产出新药品。 三、芯片实验室（芯片实验室（laboratory on chip，LOC） 也称微型全分析系统（也称微型全分析系统（micro total analytical system，MTAS），为高度集成），为高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记及化的集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体的便携式生物分析系统。其最检测为一体的便携式生物分析系统。其最终的目的是实现生化分析全过程全部集成终的目的是实现生化分析全过程全部集成在一片芯片上完成，从而使现有的许多烦在一片芯片上完成，从而使

24、现有的许多烦琐、费时、不连续、不精确和难以重复的琐、费时、不连续、不精确和难以重复的生物分析过程自动化、连续化、微缩化生物分析过程自动化、连续化、微缩化 。 微缩芯片实验室的组成微缩芯片实验室的组成 生物芯片的微加工制造是利用微电子工业生物芯片的微加工制造是利用微电子工业和半导体制造业中一些比较精细的加工工和半导体制造业中一些比较精细的加工工艺，如光学掩模刻技术、反应离子刻蚀、艺，如光学掩模刻技术、反应离子刻蚀、微注入模塑和聚合膜浇注法等，在玻璃、微注入模塑和聚合膜浇注法等，在玻璃、塑料、硅片等材料上加工出用于生物样品塑料、硅片等材料上加工出用于生物样品分离、反应的微米尺寸的微细结构，如样分离

25、、反应的微米尺寸的微细结构，如样品过滤器、微量反应室、微泵、微阀门等。品过滤器、微量反应室、微泵、微阀门等。在上述结构表面进行必要的化学处理后，在上述结构表面进行必要的化学处理后，可在其上进行生物化学反应和分析。可在其上进行生物化学反应和分析。 将其中一个步骤或几个步骤微型化集成到同将其中一个步骤或几个步骤微型化集成到同一芯片上，就能够获得具有特殊功能的生物一芯片上，就能够获得具有特殊功能的生物芯片，如用于样品制备的过滤分离芯片，介芯片，如用于样品制备的过滤分离芯片，介电电泳芯片和细柱式电电泳芯片和细柱式DNA萃取芯片，用于生萃取芯片，用于生物化学反应的生物芯片，主要是应用大量扩物化学反应的生

26、物芯片，主要是应用大量扩增、复制样品的增、复制样品的PCR技术，包括帕尔贴电热技术，包括帕尔贴电热PCR芯片、薄膜多晶硅加热套内置式芯片、薄膜多晶硅加热套内置式PCR芯芯片、恒温区间连续流片、恒温区间连续流PCR芯片；将样品制备芯片；将样品制备和扩增反应集成的坝式微过滤芯片；用于基和扩增反应集成的坝式微过滤芯片；用于基因突变检测和基因表达的毛细管电泳芯片、因突变检测和基因表达的毛细管电泳芯片、寡核苷酸探针芯片、杂交测序芯片、寡核苷酸探针芯片、杂交测序芯片、DNA微微阵列芯片和用于药物筛选的高通量微米反应阵列芯片和用于药物筛选的高通量微米反应池芯片等。池芯片等。芯片实验室的应用芯片实验室的应用

27、许多感染性疾病的及时确诊，准确治疗和正确预后，许多感染性疾病的及时确诊，准确治疗和正确预后，往往需要从全血中分离出特异的微生物作为必要的往往需要从全血中分离出特异的微生物作为必要的证据，这一过程既费时又难以确保精确性和重复性。证据，这一过程既费时又难以确保精确性和重复性。我国旅美学者程京博士领导的一个课题组首先成功我国旅美学者程京博士领导的一个课题组首先成功地将电导体生物芯片用于分离和提纯全血样品中的地将电导体生物芯片用于分离和提纯全血样品中的DNA/RNA，接着再在另一个电子增强的生物芯片，接着再在另一个电子增强的生物芯片上进行诊断性分析。整个过程是在所构建的生物芯上进行诊断性分析。整个过程

28、是在所构建的生物芯片片1cm2的区域内含有的区域内含有25个可寻址的微电阵列，将大个可寻址的微电阵列，将大肠杆菌肠杆菌Ecoli污染的血液标本点样于第一个芯片上，污染的血液标本点样于第一个芯片上，向其施以适当能量的高频交流电（向其施以适当能量的高频交流电（AC）信号，当红）信号，当红细胞和白细胞被清洗掉后，细菌就范残留在细胞和白细胞被清洗掉后，细菌就范残留在25个电个电极之上。极之上。 用电子学的方法溶解被芯片用电子学的方法溶解被芯片“浮获浮获”的细的细菌，使其释放菌，使其释放DNA和和RNA，并通过蛋白酶，并通过蛋白酶K消化将其纯化，然后将消化将其纯化，然后将DNA和和RNA传达传达到第到第

29、2个具电子活性的芯片上，通过特异性个具电子活性的芯片上，通过特异性的的DNA/RNA杂交反应，确定微芯片上含杂交反应，确定微芯片上含有的细菌种类和数量。临床医生可利用有的细菌种类和数量。临床医生可利用2-3min完成检验工作，方便、快捷、准确。完成检验工作，方便、快捷、准确。将这种装置改进后，就可以准确快速地大将这种装置改进后，就可以准确快速地大量筛查遗传病、家族性、地方性、流行性量筛查遗传病、家族性、地方性、流行性疾病和癌症。疾病和癌症。 四、生物芯片的研究和生产现状四、生物芯片的研究和生产现状 国际方面国际方面:美国政府和产业界在过去美国政府和产业界在过去10年投年投入入20亿美元用于以基

30、因芯片为主的生物芯亿美元用于以基因芯片为主的生物芯片研究开发与产业化，欧洲与日本的投入片研究开发与产业化，欧洲与日本的投入也越来越大，几乎所有的跨国制药公司投也越来越大，几乎所有的跨国制药公司投入巨资利用基因芯片开展新药的超高通量入巨资利用基因芯片开展新药的超高通量筛选和对药理遗传学、药理基因组学等方筛选和对药理遗传学、药理基因组学等方面进行研究。面进行研究。 美国美国Affymetrix公司是世界上最有影响的公司是世界上最有影响的基因芯片开发制造商，其第一种产品用于基因芯片开发制造商，其第一种产品用于研究艾滋病毒的抗药性，第二种产品是检研究艾滋病毒的抗药性，第二种产品是检查多种疾病中发生突变

31、的一种基因，查多种疾病中发生突变的一种基因，1998年生产出带有年生产出带有13.5万个基因探针的芯片，万个基因探针的芯片，使人类使人类DNA的解码速度提高了的解码速度提高了25倍。目前倍。目前该公司正在努力提高其芯片探针阵列的该公司正在努力提高其芯片探针阵列的“密集度密集度”，它的原型芯片能容纳，它的原型芯片能容纳6.5万个万个探针，最近又推出了探针，最近又推出了40万个探针的芯片。万个探针的芯片。正在开发有正在开发有100多万个探针的多万个探针的DNA芯片和芯片和设计能够同时监测设计能够同时监测5万个人体基因的芯片。万个人体基因的芯片。 目前美国的目前美国的Nanogen公司、公司、Affymetrix公司、公司、宾西法尼亚大学医学院和密歇根大学和科宾西法尼亚大学医学院和密歇根大学和科学家通过利用在芯片上制作出的加热器、学家通过利用在芯片上制作出的加热器、阀门、泵、微量分析器、电化学检测器或阀门、泵、微量分析器、电化学检测器或光电子学检测器等将样品制备、化学反应光电子学检测器等将样品制备、化学反应和检测三部分作了部分集成。和检测三部分作了部分集成。 国内方面国内方面:我国科学家正式涉及基因芯片我国科学家正式涉及基因芯片领域是从领域是从1998年开始。目前我国已研制年开始。目前我国已研制的生物芯片已到临床应用和商业开发阶的生物芯片已到临床应