浸矿微生物群落基因组芯片的构建与评估及其在酸性环境中的应用

1、浸矿微生物群落基因组芯片的构建与评估及其在酸性环境中的应用采矿活动使金属硫化矿大量暴露于地表 , 经过自然与生物的氧化作用导致酸 性矿坑水AMD的产生,并造成严重的环境污染。酸性矿坑水通常含有高浓度的金 属离子与硫酸盐，在AMD这样的极端环境中仍然生存着多种微生物。这些微生物主要是细菌与古菌，它们的活动促进AMD勺形成，同时这些微生 物对金属的生物浸出以及环境的生物治理也具有重要的意义。 理解微生物群落的 结构,组成和环境适应性有助于阐述微生物与矿石以及 AMD环境的生物与非生物 因素之间的内在联系。AMD境相比许多生态环境更加简单，这使得我们可以更加深入地研究微生 物群落结构和功能与地理化学

2、变量之间的关系。生物浸出过程中 , 微生物群落组 成以及种群比例受矿石种类与浸出条件影响较大。因此, 研究酸性矿坑水中的微生物群落结构及其功能活动具有重要的意义。本文利用基因芯片技术对微生物群落的多样性进行了研究。构建并评估了适用于微生物群落结构解析的群落基因组芯片 , 优化了芯片杂 交检测的技术方法，探索了它们在AME环境微生物群落分析上的应用。传统的微 生物群落结构研究方法是以培养性状为依据 , 此类方法可以提供微生物群落多样 性以及物种发育史等信息 ,但是其工作量巨大 ,对于群落多样性的描述与量化仍 有其局限性。迅速开展的以核酸 基因为根底的分子生物学技术使微生物群落研究有了 显著的进展

3、。分子生物学技术的应用过程对目标基因的选择是非常重要 的,16SrRNA或rDNA是微生物多样性分析常用的基因，但它有识别能力的限制以 及不能直接反响微生物的代谢与生理特征的缺陷目前常用的各种分子生物学分析方法都有这样那样的缺点 , 没有一种适宜的 方法可以用来同时快速、适时、准确、灵敏地检测环境微生物群落的多样性。基 因芯片是最近开展起来的基因组研究技术之一 , 现已说明它是在基因组规模上研 究基因表达和调控的一种强有力的研究工具 , 同时它也是研究原核和真核生物基 因多态性的极好方法。基因芯片技术可以同时但它在环境微生物研究中的应用尚处于起步阶段, 目前已有功能基因组芯片FGA、系统发育寡

4、核苷酸芯片POA和群落基因组芯片 CGA等三种基因芯片被用于环境微生物基因表达分析、比较基因组分析和混合 微生物群落的分析。 本文构建并评估适用于菌种鉴定与群落分析的群落基因组芯 片。CGA1用51株纯培养微生物的整个DNAS因组构建的,根据可培养的微生物 来研究环境微生物群落。此方法类似于反向样品根本组探针法RSGP,RSGP法是 一种利用基因组DNA杂交来鉴定微生物的方法。为了确定此种类型芯片在研究环境微生物多样性的潜在作用 , 我们就其杂交 特异性、检测灵敏度和定量性能进行了研究。在特定实验条件下 ,CGA的特异性 实验说明目的DNA与同种细菌存在特异性杂交，同属之间不存在非特异性杂交，

5、 即CGA可区分属内菌种的染色体基因组。对于标记的纯培养基因组DNA,CGA勺检测灵敏度大约为0.2 ng,对于混合培 养物,检测灵敏度大约为5 ng。对于纯培养微生物,CGA具有定量特性，实验说明 在0.2 ng至2000 ng的一定浓度范围内，DNA量与杂交信号强度之间存在明显的线性关系 (r2=0.985)当将来自与五种微生物的基因组 DNA以不同浓度混合并选取五个浓度梯度 进行杂交实验，DNA量与杂交信号强度之间显著相关r2=0.95。使用CGA分别 杂交AMD环境样品与生物浸出系统样品,杂交结果显示CGA可以有效分辨两者之 间微生物群落结构的差异性。CGA说明基因组芯片技术可以根据微生物基因型的变异应用于确定微生物 群落的特性。评估微生物的群落组成和结构要求对单个目的种群进行定量分析 通过