第7章高效液相色谱

1、第第1 1节节 概述概述 高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLCHPLC）是在经典液相色）是在经典液相色谱基础上，引入了谱基础上，引入了气相色谱气相色谱的理论，在技术上的理论，在技术上采用了采用了高压泵高压泵、高效固定相高效固定相和高灵敏度和高灵敏度检测器检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱法动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：优越性，现从两方面进行比较： 高效液相比经典液相的最大优点在于高效液相比经典液相的最大优点在于高速、高效、高速、高效、高灵敏度、高自动化高灵敏度、

2、高自动化。高速是指比经典液相色谱法快。高速是指比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是数百倍。由于经典色谱是重力加料重力加料，流出速度极慢；，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 10103 3cmcm3 3minmin-1-1。例如分离苯的羟基化合物，。例如分离苯的羟基化合物，7 7个组分只个组分只需需1min1min就可完成。对就可完成。对氨基酸分离氨基酸分离，用经典色谱法，柱，用经典色谱法，柱长约长约170cm170cm，柱径，柱径0.9cm0.9cm，流动相速度为，流动相速度为30cm30cm3 3h h-1-1，需

3、，需用用2020多小时才能分离出多小时才能分离出2020种氨基酸；而用高效液相色种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需谱法，只需lhlh。又如用。又如用25cm25cm0.46cm0.46cm的柱，采用梯度的柱，采用梯度洗脱，可在不到洗脱，可在不到0.5h0.5h内分离出尿中内分离出尿中104104个组分。个组分。 （l l）气相只限于分析气体和沸点较低的化）气相只限于分析气体和沸点较低的化合物，合物，它们仅占有机物总数的它们仅占有机物总数的2020。对于占有机对于占有机物总数近物总数近8080的那些的那些高沸点、热稳定性差高沸点、热稳定性差、摩尔、摩尔质量大的物质，主要采用高效液相色谱法。质量大

4、的物质，主要采用高效液相色谱法。 (2)(2)气相色谱采用流动相是气相色谱采用流动相是惰性气体惰性气体，它不，它不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中谱法中流动相可选用不同极性的液体流动相可选用不同极性的液体，选择余地，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力。因此，流动相大，它对组分可产生一定亲和力。因此，流动相对分离起很大作用，选择最佳分离条件更方便。对分离起很大作用，选择最佳分离条件更方便。东晋名医葛洪的著作东晋名医葛洪的著作肘后备急方肘后备急方中的中的“青蒿一握，青蒿一握，以水二升渍，绞取汁，尽服之以水二升渍，绞取汁，尽服之”，她意识到

5、常用煎熬和，她意识到常用煎熬和高温提取的方法可能破坏了青蒿有效成分。高温提取的方法可能破坏了青蒿有效成分。不出所料，改用乙醚低温提取后，研究人员如愿获不出所料，改用乙醚低温提取后，研究人员如愿获得了抗疟效果更好的青蒿提取物。得了抗疟效果更好的青蒿提取物。 (3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。液相色谱法则经常可在室温条件下工作。 总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点。目前高效液相色谱法得到广泛应典液相色谱优点。目前高效液相色谱法得到广泛应用，例如蛋白质、

6、核酸、氨基酸、多糖类、植物色用，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等的分离和分析。素、高聚物、染料及药物等的分离和分析。 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。格，这是它的主要缺点。 高效液相色谱仪一般可分为高效液相色谱仪一般可分为4 4个主要部分：个主要部分： 高压输液系统，高压输液系统， 进样系统，进样系统， 分离系统分离系统 检测系统。检测系统。此外还配有辅助装置：此外还配有辅助装置： 梯度淋洗，梯度淋洗， 自动进样自动进样 数据处理数据处理梯度洗脱梯度洗脱通过两个输液泵流速的变化，改变流动相的洗

7、脱能力，其作用与气相色谱的程序升温类似。ABABCC1高压输液系统高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，必须配备有高压输液系统。一般对流动相阻力很大，必须配备有高压输液系统。一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中组成，其中高压输液泵高压输液泵是核心部件。常用的输液泵分是核心部件。常用的输液泵分为为恒流泵恒流泵和和恒压泵恒压泵两种。恒流泵特点是在一定操作条两种。恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无件下，输出流量保持恒定而与

8、色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，它们色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，它们各有优缺点。目前各有优缺点。目前恒流泵恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是应用最多的是机械往复泵机械往复泵。 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约530cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展

9、宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。进样技术要求较严。 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限

10、，内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长故金属管用得较多。一般色谱柱长5 530cm30cm，内径为内径为4 45mm5mm，凝胶色谱柱内径，凝胶色谱柱内径3 312mm12mm，制备往内径较大，制备往内径较大，可达可达25mm 25mm 以上。以上。 一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影

11、响中固定相，保证分离柱的性能不受影响。 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。电导检测器等。（l l）紫外检测器紫外检测器 、二极管阵列检测器、二极管阵列检

12、测器（2 2）荧光检测器荧光检测器 （3 3）示差折光率检测器示差折光率检测器 几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折光几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达1010-7-7g gcmcm-3-3。主要。主要缺点是对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。缺点是对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。 （4 4）电导检测器电导检测器 （5 5）附属系统附属系统 它包括它包括脱气脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪及数据处理

13、等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置。中尤为重要的附属装置。 （）固定相（）固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为可分为刚性固体刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受高压，可制成直径、形状、孔隙度不为基质，可承受高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是是键合固定相键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排

14、阻用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。固定色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。固定相按孔隙深度分类，可分为相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型表面多孔型和和全多孔全多孔型固型固定相两类。定相两类。 它的基体是它的基体是实心玻璃珠实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。筛、聚酸胺等。表面活性材料为硅胶的固定相如国外表面活性材料为硅胶的固定相如国外的的ZpaxZpax，Corasil ICorasil I和和IIII，Vyd

15、acVydac，PellosilPellosil以及上海以及上海试剂一厂的薄壳玻璃珠等；表面活性材料为氧化铝的试剂一厂的薄壳玻璃珠等；表面活性材料为氧化铝的固定相，如固定相，如PelluminaPellumina；为聚酰胺的，如；为聚酰胺的，如PellionPellion。这。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制多孔层厚度

16、薄，最大允许量受限制。 它由直径为它由直径为10nm的的硅胶微粒凝聚硅胶微粒凝聚而成。如国而成。如国外的外的Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海试剂系列，上海试剂一厂的堆积硅珠，青岛海洋化工厂的一厂的堆积硅珠，青岛海洋化工厂的YWG系列，天系列，天津试剂二厂的津试剂二厂的DG系列等。也可由氧化铝微粒凝聚成系列等。也可由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相，如国外的全多孔型固定相，如国外的Lichrosorb ALOXT。这。这类固定相由于类固定相由于颗粒很细颗粒很细（510m），孔仍然较浅，），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复

17、杂混特别适合复杂混合物分离及痕量分析。合物分离及痕量分析。 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与并参与固定相对组分的竞争固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1 1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性极性和良好的和良好的选择性选择性。 （2 2）溶剂要与检测器匹配溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的意选用检测器波长比溶

18、剂的紫外截止波长紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。扰组分的吸收测量。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。溶剂作流动相，以达最高灵敏度。(3)(3)高纯度。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生高纯度。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰伪峰”。痕量杂质将使截止

19、波长值增加。痕量杂质将使截止波长值增加50-1OOnm50-1OOnm。(4)(4)化学稳定性好。不能选与样品反应或聚合的溶剂。化学稳定性好。不能选与样品反应或聚合的溶剂。(5)(5)低粘度低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等。利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内它们易在色谱柱或检测器内形成气泡形成气泡，影响分离。，影响分离。 （）液（）液-液分配色谱法（液分配色谱法（LLPC）

20、在液在液-液色谱中，流动相和固定相都是液体，液色谱中，流动相和固定相都是液体，它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。的和非离子型的化合物。1. 分离原理分离原理 液液分配色谱的分离原理与液液分配色谱的分离原理与液液萃取液液萃取相同，都是相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同。根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同。液液色谱的分配是在柱中反复多次进行，提高了液液色谱的分配是在柱中反复多次进行，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组

21、分。分离效率，从而能分离各种复杂组分。 2. 固定相固定相 由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固定液即可定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。例如，最常用的强极性固定液解决分离问题。例如，最常用的强极性固定液,-氧二氧二丙腈丙腈，中等极性的，中等极性的聚乙二醇聚乙二醇，非极性的，非极性的角鲨烷角鲨烷等。等。 为了解决固定液为了解决固定液流失流失问题。产生了问题。产生了化学键合固定化学键合固定相相。它是将有机基团通过它是将有机基团通过化学反应化学反应键合到键合到载体表面载体表面。它

22、。它不是机械涂渍。它是目前应用最广泛的一种固定相。约不是机械涂渍。它是目前应用最广泛的一种固定相。约有有3/4以上是在以上是在化学键合固定相化学键合固定相上进行的。上进行的。3流动相流动相 在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的要求是尽可能不与固定相互溶，而且相的要求是尽可能不与固定相互溶，而且极性差别越极性差别越显著越好显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为将其分为正正相分配色谱相分配色谱和和反相分配色谱反相分配色谱。 如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称为如果采用流动相的极性小于固定

23、相的极性，称为正相分配色谱正相分配色谱，它适用于，它适用于极性化合物的分离极性化合物的分离。其流出。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。 如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱反相分配色谱。它适用于非极性化合物的分离，其流。它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。出顺序与正相色谱恰好相反。 采用化学键合相的液相色谱称为化学键合液相色谱采用化学键合相的液相色谱称为化学键合液相色谱法，简称键合液相色谱。由于键合固定相法，简称键合液相色谱。由于键合固定相非常稳定非常稳定，在使用中

24、在使用中不易流失不易流失，适用于，适用于梯度淋洗梯度淋洗，特别适用于分，特别适用于分离容量因子离容量因子k k值范围宽的样品。值范围宽的样品。1键合固定相类型键合固定相类型 用来制备键合固定相的载体，几乎都用用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶硅胶。利用硅胶表面的硅醇基。利用硅胶表面的硅醇基(Si(Si一一OH)OH)与有机分子可与有机分子可成键成键, ,即可得到各种性能的固定相。一般可分三类即可得到各种性能的固定相。一般可分三类（1 1）疏水基团）疏水基团 如不同链长的烷烃（如不同链长的烷烃（C C8 8和和C C1818）和苯基等。）和苯基等。（2 2）极性基团）极性基团 如氨丙基，氰乙

25、基、醚和醇等。如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3 3）离子交换基团）离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺基，季镀盐；如作为阴离子交换基团的胺基，季镀盐； 作为阳离子交换基团的磺酸等。作为阳离子交换基团的磺酸等。2键合固定相的制备键合固定相的制备（l l）硅酸酯（）硅酸酯（SiSi一一OROR）键合固定相）键合固定相, ,它是最先用于它是最先用于液相色谱的健合固定相。用醇与硅醇基发生液相色谱的健合固定相。用醇与硅醇基发生酯化反酯化反应应： SiSi0H0HROHSiROHSiORORH H2 20 0由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良好的

26、传质特性好的传质特性, ,但这些酯化过的硅胶填料但这些酯化过的硅胶填料易水解易水解且且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的流动相。受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的流动相。（2 2）SiSiC C或或SiSi一一N N共价键合固定相共价键合固定相 制备反应如下制备反应如下 共价键健合固定相不易水解，并且热稳定较硅共价键健合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏反应不方便；当使用水溶液时，酸酯好。缺点是格氏反应不方便；当使用水溶液时，必须限制必须限制PH在在48范围内。范围内。OHSiSOCl2ClSi+HgBrSiSiNHCH2CHNH2H2NCH2CH2NH2（3）硅烷化（）硅烷

27、化（SiOSiC）键合固定相）键合固定相制备反应如下：制备反应如下： OHSiClSiR3+SiO(ROSiR3)SiR3+ HCl 这类键会固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有这类键会固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在机溶剂的优点。能在70以下，以下，PH=28范围内正常范围内正常工作，应用较广泛。工作，应用较广泛。 此法的固定相是采用极性此法的固定相是采用极性较小的键合固定相较小的键合固定相，如，如硅硅胶胶C18H37、硅胶、硅胶苯基等；流动相是采用极性较强的溶剂，苯基等；流动相是采用极性较强的溶剂，如如甲醇（乙腈）甲醇（乙腈）水水（水和无机盐的缓冲溶液）等。它多用（水和无

28、机盐的缓冲溶液）等。它多用于分离于分离多环芳烃等低极性化合物多环芳烃等低极性化合物；若采用含一定比例的甲醇；若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液为流动相，也可用于分离极性化合物；若采或乙腈的水溶液为流动相，也可用于分离极性化合物；若采用水和用水和无机盐无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等。反相键合相色谱法具有柱品，如有机酸、有机碱、酚类等。反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无效高，能获得无拖尾拖尾色谱峰的优点。色谱峰的优点。 此法是以极性的有机基团，此法是以极性的有机基团，CN、NH2、双羟基双羟基等键合在等键合在硅

29、胶硅胶表面，作为固定相；而以非极性或极表面，作为固定相；而以非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇等）为流动相，氯仿、醇等）为流动相，分离极性化合物分离极性化合物。此时，。此时，组分的分配比组分的分配比k值随其极性的增加而增大，但随流动值随其极性的增加而增大，但随流动相极性的增加而降低。相极性的增加而降低。 这种色谱方法主要用于分离异构体、极性不同这种色谱方法主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。 当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子当以

30、薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如交换基团，如一一SOSO3 3H H 一一CHCH2 2NHNH2 2、C00HC00H、一一CHCH2 2N N（CHCH3 3）2 2等时，就等时，就形成了形成了离子性键合离子性键合相色谱的固定相；流动相一般采用缓冲溶液。相色谱的固定相；流动相一般采用缓冲溶液。其分离原理与离子交换色谱类同。其分离原理与离子交换色谱类同。 键合相色谱的最大优点是：通过改变流动相的组成和种类，键合相色谱的最大优点是：通过改变流动相的组成和种类，可有效地分离各种类型化合物（非极性、极性和离子型）。此外，可有效地分离各种类型化合物（非极性、极性和离子型）

31、。此外，由于键合到载体上的基团不易流失，特别适用于由于键合到载体上的基团不易流失，特别适用于梯度淋洗梯度淋洗。据统。据统计，在高效液相色谱法中，约有计，在高效液相色谱法中，约有8O8O的分离问题是用键合相色谱的分离问题是用键合相色谱法解决。此法的最大缺点是不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂法解决。此法的最大缺点是不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系。的缓冲溶液作流动相的体系。 液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些吸附剂通常是些多孔多孔的固体颗粒物质，在它们的的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物

32、质在表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的固定相上的吸附作用吸附作用不同来进行分离的。不同来进行分离的。1分离原理分离原理 当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分用）于是，在要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分用）于是，在固定相表面发生竞争吸附固定相表面发生竞争吸附: X + nSad = X

33、ad + nS达平衡时达平衡时,有有 nadnadadSXSXK其中其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。强，难于洗脱。Kad值小值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。各组分据此得以分离。Kad值可通过吸附等温线数据求出。值可通过吸附等温线数据求出。 吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的弱不等的吸附剂吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机

34、械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以应等，因此，以硅胶用得最多硅胶用得最多。 在高效液相色谱法中，表面多孔型和全多孔在高效液相色谱法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色谱中的固定相，它们具有填料型都可作吸附色谱中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小。孔穴浅的优点，能极大地提高均匀、粒度小。孔穴浅的优点，能极大地提高柱效。但表面多孔型由于试样容量较小，目前柱效。但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是最广泛使用的还是全多孔全多孔型微粒填料。型微粒填料。 一般把吸附色谱中流动相称作一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂洗脱剂。在吸附色谱

35、中对在吸附色谱中对极性大的试样极性大的试样往往采用往往采用极性极性强的洗脱剂强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参洗脱剂。洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（数（0）来衡量。）来衡量。0越大，表示洗脱剂的极越大，表示洗脱剂的极性越强。在硅胶吸附剂中性越强。在硅胶吸附剂中0值的顺序相同，值的顺序相同，数值可换算（数值可换算（0硅胶硅胶=0770氧化铝）。氧化铝）。 利用利用离子交换原理和液相色谱技术离子交换原理和液相色谱技术的的结合来测定溶液中结合来测定溶液中阳离子和阴离子阳离子和阴离子的方法的方法。凡在溶液中凡在溶液中能够电离能够

36、电离的物质，通常都可用离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。适用无机和有机离子交换色谱法进行分离。适用无机和有机离子混合物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白子混合物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。质等生物大分子。因此，应用范围较广。 1离子交换原理离子交换原理 利用不同待测利用不同待测离子对固定相亲和力离子对固定相亲和力的差别来实现分离的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与

37、树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换：的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换：阳离子交换：阳离子交换： 阴离子交换：阴离子交换： RNR3+Cl-+X-RNR3+X-+ Cl-SO3H + M+ SO3M + H+ 对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的K KB/AB/A值按以下值按以下顺序：顺序：CsCs+ +RbRb+ +K K+ +NHNH4 4+ +NaNa+ +H H+ +LiLi+ +二价离子的顺序为：二价离子的顺序为： Ba2+Ba2+Pb2+Pb2+Sr2+Sr2+Ca2+Ca2+Cd2+Cd2+Cu2+Cu2+，Zn2+Zn2

38、+Mg2+Mg2+对于季铝型强碱阴离子交换树指，各阴离子的选择性顺序为：对于季铝型强碱阴离子交换树指，各阴离子的选择性顺序为： ClOClO4 4- -I I- -HS0HS04 4- -SCNSCN- -NONO2 2- -BrBr- -CNCN- -ClCl- -BrOBrO3 3- -OHOH- - HCOHCO3 3- -H H2 2P0P04 4- -IOIO3 3- -CHCH3 3COOCOOF F2 2固定相固定相 作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳树脂（聚苯乙烯）、

39、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分。之分。 常用的离子交换剂固定相大致可分以下几种：常用的离子交换剂固定相大致可分以下几种： （l l）多孔型离子交换树脂）多孔型离子交换树脂它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联聚合物，直径约为它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联聚合物，直径约为5 520m20m，有微孔型和大孔型之分。，有微孔型和大孔型之分。（2 2）薄膜型离子交换树脂）薄膜型离子交换树脂 是在约对是在约对30m30m的固体的固体惰惰性核上，凝聚性核上，凝聚1 12m2m厚的树脂层。厚的树脂层。（

40、3 3）表面多孔型离子交换树脂）表面多孔型离子交换树脂 它是在固体情性核上，覆盖一层微球硅胶，再在上面涂它是在固体情性核上，覆盖一层微球硅胶，再在上面涂一层很薄的离子交换树脂。一层很薄的离子交换树脂。（4）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相 它是用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。它是用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。它也分为两种类型。一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻它也分为两种类型。一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。另一种是键合微粒载体型，它的载体是多孔微粒硅胶。珠。另一种是键合微粒载体型，它的载体是多孔微粒硅胶。 离子交换色谱法所用流动相大都是一定离子交换色谱法所用

41、流动相大都是一定pH和盐浓度（或离子强和盐浓度（或离子强度）的缓冲溶液。通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和度）的缓冲溶液。通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控制值可控制k值，改变选择性。如果增加盐离子的浓度，则可降低值，改变选择性。如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。 一般，对于阴离子交换树脂来说，各种阴离子的滞留次序为：一般，对于阴离子交换树脂来说，各种阴离子的滞留次序为：柠檬酸离子柠檬酸离子SO42C2O42-I-NO3-CrO42-Br-SCN- Cl-HCOO-CH3C00

42、-OH-F-所以用柠檬酸离子洗脱要比用氟离子快。阳离子的滞留次序大为：所以用柠檬酸离子洗脱要比用氟离子快。阳离子的滞留次序大为： Ba2+Pb2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2+Mg Ag+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li十十 但差别不如阴离子明显。关于但差别不如阴离子明显。关于pH值的影响，要视不同情况而定。值的影响，要视不同情况而定。例如，分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改例如，分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的变流动相的pH值来控制。增大值来控制。增大pH值会使酸的电离度增加，使值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；降低碱的电

43、离度减少；降低PH值，其结果相反。但无论属于哪种情值，其结果相反。但无论属于哪种情况，只要电离度增大，就会使样品的保留增大。况，只要电离度增大，就会使样品的保留增大。 尺寸排阻色谱法又称尺寸排阻色谱法又称凝胶凝胶色谱法，主要用于较色谱法，主要用于较大分子的分离。它是基于试样分子的大分子的分离。它是基于试样分子的尺寸和形状尺寸和形状不不同来实现分离的。同来实现分离的。 尺寸排阻色谱被广泛用来分析大分子物质相对尺寸排阻色谱被广泛用来分析大分子物质相对分子质量的分布。特点：（分子质量的分布。特点：（1 1）保留时间是分子尺）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息。寸的函数，有可能提供

44、分子结构的某些信息。(2)(2)保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器（的检测器（3 3）固定相与分子间作用力极弱，趋于）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。（4 4）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于质量差别必须大于1010才能得以分离。才能得以分离。1分离原理分离原理 尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。其行分离的一种色谱方法。其固定相固定相为化为

45、化学情性多孔物质学情性多孔物质凝胶凝胶，孔径比分子，孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大小的孔穴，体筛大。凝胶内具有一定大小的孔穴，体积积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。2固定相固定相 排阻色谱固定相可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。排阻色谱固定相可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。 凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。 （1）软性凝胶）软性凝胶 如葡聚糖