流式细胞术的原理及应用

1、1流式细胞术的原理及应用流式细胞术的原理及应用临床实验诊断教研室临床实验诊断教研室 施琼施琼2=流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry, FC/MFACSFlow Cytometry, FC/MFACS）是）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选以对特定群体加以分选=研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等微生物、及人工合成微球等=研究的微粒特性包括多种物理及生物学特

2、征，研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量并加以定量3456科研型（大型机）特点：多数字化适用于各类细胞分选4路分选7科研型8细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞结构特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体细胞功能9l19341934年，年，MoldavanMoldavan开创流式细胞自动计数的基础。开创流式细胞自动计数的基础。l1950s1950s，CoulterCoulter公司设计细胞自动计数器，初步解公司设计细胞自动计数器，初步解决了流动细胞的通路问题。决了流动细胞的通路问题。l196519

3、65年，在细胞分选中应用了超声震动器。年，在细胞分选中应用了超声震动器。 l19691969年，年，StanfordStanford、CaliforniaCalifornia大学的研究组发明大学的研究组发明了第一台较满意的流式细胞仪。了第一台较满意的流式细胞仪。l19721972年，年，FACS-FACS-型仪器试制成功，并在美国建国型仪器试制成功，并在美国建国200200周年纪念会上与人造卫星并列展示。周年纪念会上与人造卫星并列展示。10流式细胞仪的工作原理111213=液流系统液流系统=光学系统光学系统激光光源 光收集系统=电子系统电子系统 光电转换 数据处理系统=细胞分选系统细胞分选系统

4、14液流系统：流动室、液流驱动系统液流系统：流动室、液流驱动系统Injector TipSheath fluid15液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱16=入射光系统：入射光系统：激光激光 (Laser)(Laser)是一种相干光源，是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照。照。=发射光系统：发射光系统：散射光和荧光散射光和荧光=光收集系统光收集系统是由若干组透镜、滤波片和小孔组是由若干组透镜、滤波片和小孔组成成, ,将产生的光信号引导至检测器将产生的光信号引导至检测器17单波长、高强度、高稳定性单波长、高强度、高稳定性多采用氩离子激

5、光器或氦氖激光器多采用氩离子激光器或氦氖激光器一般选配一般选配2-42-4根激光，根激光，488nm 488nm 、633nm633nm、355nm355nm和和407nmUV407nmUV激光激光最多检测最多检测1313个荧光参数个荧光参数 1819l散射光信号散射光信号 前向散射光前向散射光（foword scatter, FSfoword scatter, FS）：在激）：在激光束正前方的检测器，用于检测细胞或其他粒子光束正前方的检测器，用于检测细胞或其他粒子物体的表面属性，如大小、形状等。物体的表面属性，如大小、形状等。 侧向散射光侧向散射光（side scatterside scat

6、ter， SSSS）：与激光）：与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器，主要用于检束垂直方向的检测器为侧向检测器，主要用于检测细胞内部结构属性，可获得细胞内超微结构和测细胞内部结构属性，可获得细胞内超微结构和颗粒性质的参数。颗粒性质的参数。l荧光信号荧光信号20FSC（小角散射光)它反应细胞的相对大小和截面积的大小90度角散射光)全血细胞流式全血细胞流式FSC-SSC图图它反应细胞的物理特性它反应细胞的物理特性, ,根据前侧向散射光，可以把不同根据前侧向散射光，可以把不同类型的细胞群加以区分类型的细胞群加以区分21FALS SensorLaser22FALS Sensor90LS SensorL

7、aser23LaserFreqFluorescenceFALS SensorFluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.)Purdue University Cytometry Laboratories24Longpass Shortpass Bandpass460 500 540460 500 540460 500 540光收集系统：滤光片光收集系统：滤光片25 电子系统：光电倍增管（电子系统：光电倍增管（PMTPMT）26FACSCalibur 光路图2728 当含细胞的液滴逐个通过激光束时，受到两种检当含细胞的液滴逐个通过激光束时，受到两种检测器的检测测器的

8、检测: :如果液滴中含有细胞就会激活干涉检测如果液滴中含有细胞就会激活干涉检测器器(interference detector)(interference detector)，只有带有荧光标记细，只有带有荧光标记细胞的液滴才会激活荧光检测器胞的液滴才会激活荧光检测器(fluorescence (fluorescence detector)detector)。当带有荧光标记的液滴通过激光束时，。当带有荧光标记的液滴通过激光束时，将两种检测器同时激活，引起液滴充电信号使鞘液将两种检测器同时激活，引起液滴充电信号使鞘液带上负电荷。由于液滴带有负电荷，移动时就会向带上负电荷。由于液滴带有负电荷，移动时

9、就会向正极移动，进入到荧光标记细胞收集器中。正极移动，进入到荧光标记细胞收集器中。细胞分选的原理细胞分选的原理29Fluorescence Activated Cell Sorting488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector30自发荧光特异荧光特异荧光能量级激发激发态发射激光能量损失31FALS SensorLaser前向散射光前向散射光 32前向散射光前向散射光33FALS Sensor90LS SensorLaser侧向散射光侧向散射光34侧向

10、散射光侧向散射光35l每种荧光染料都有特定的激发波长和发射波长，流每种荧光染料都有特定的激发波长和发射波长，流式细胞仪利用不同波长的式细胞仪利用不同波长的光学滤片光学滤片来检测这些特定来检测这些特定发射波长的光学信号。发射波长的光学信号。l长通滤片长通滤片允许长于设定波长的光通过允许长于设定波长的光通过 短通滤片短通滤片允许短于设定波长的光通过允许短于设定波长的光通过 带通滤片带通滤片允许一定带宽允许一定带宽波长的光通过波长的光通过 二向色性滤片二向色性滤片当以当以 4545o o 角角放置滤片时放置滤片时, ,该滤片该滤片可以通过一定波长的光可以通过一定波长的光, ,同时也可以阻断并折射该波

11、同时也可以阻断并折射该波长以下的光长以下的光 36=荧光素吸收激光能量荧光素吸收激光能量=荧光素将吸收能量释放，转换为荧光素将吸收能量释放，转换为 振动能和热能振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子释放较入射光波长更长的光量子=荧光素与特异抗体结合荧光素与特异抗体结合=荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强3738PMTPMTPMTPMT 4DichroicFiltersBandpassFiltersFlow Cytometry PrincipleLaser 1234Flow cell3940常用荧光染料的特性荧光染料 激发波长 (nm

12、) 发射波长(nm) 用途 颜色FITC 488 525 免疫荧光 绿色PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色ECD 488 620 免疫荧光 橙红PeCy5 488 675 免疫荧光 红PI 488 620 DNA染色 橙红PECy7 488 755 免疫荧光 深红PerCP 488 670APC 633 67041 进行信号检测和分析进行信号检测和分析=当细胞携带荧光素标记物当细胞携带荧光素标记物, , 通过激光照射区时受到激发通过激光照射区时受到激发, , 产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号=荧光信号由光电接收器接收，转变为电

13、信号，可分析电荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号，可分析电压脉冲的高度、面积和宽度压脉冲的高度、面积和宽度=电脉冲信号经电脉冲信号经A/DA/D转换成数字信号转换成数字信号=数字信号传送到计算机，进行储存、数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、作图、 统计分析统计分析42数据处理 检测数据的显示视测量参数的不同有多种形式检测数据的显示视测量参数的不同有多种形式可供选择可供选择单参数数据单参数数据 以直方图的形式表达，其以直方图的形式表达，其X X轴为测轴为测量强度，量强度，Y Y轴为细胞数目。轴为细胞数目。双参数或多参数数据双参数或多参数数据 既可以单独显示每个参既可以单独显示每个参数的

14、直方图，也可以选择二维的散点图、等高线数的直方图，也可以选择二维的散点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。图、灰度图或三维立体视图。43=直方图分析直方图分析X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率单参数直方图（Histogram）44=点图分析点图分析便于数据统计不同的细胞群可以用不同的颜色标记主要表达方式 Dot Plot45二维等高图和密度图46Pseudo 3D Plot3D Plot47流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用48 淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分淋巴细胞亚群测定

15、、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、造血干细胞移植监析、白血病和淋巴瘤免疫分型、造血干细胞移植监测、测、 HLA-B27HLA-B27分析、分析、PNHPNH诊断、人类同种异体器官移诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、植中应用、细胞因子测定、AIDSAIDS诊断与治疗和疗效诊断与治疗和疗效评价、评价、flow-FISHflow-FISH法测定端粒长度法测定端粒长度49 淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定

16、、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究5051l首选直接标记抗体首选直接标记抗体l根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体 PEPE最强，适用于弱表达抗原最强，适用于弱表达抗原 FITCFITC最便宜，适用于强表达抗原最便宜，适用于强表达抗原l使用双标以上抗体必做荧光补偿使用双标以上抗体必做荧光补偿52Emission wavelength (nm) 530 580 630 680 730 780FITCPEPE-TRPE-CY54 colors - simultaneous collection两色以上荧光分析存在 光谱交叉53所有补偿调

17、为“0”调节电压，用同型对照或阴性对照，使阴性群位于“左下角”依单阳群体调节荧光补偿54l制备制备单细胞悬液单细胞悬液是流式细胞分析的基础。是流式细胞分析的基础。l标本应标本应新鲜新鲜；采用密度梯度离心分离外周血淋巴细胞，在分；采用密度梯度离心分离外周血淋巴细胞，在分离和洗涤过程中应离和洗涤过程中应避免高速离心避免高速离心而致细胞膜结构破坏。而致细胞膜结构破坏。l常用常用溶血剂溶血剂处理红细胞。处理红细胞。l温度和温度和pHpH：25-3725-370 0C C，pH 7.0-7.2pH 7.0-7.2。l制备实体组织标本的单细胞悬液时多采用制备实体组织标本的单细胞悬液时多采用机械法机械法，而

18、少用化，而少用化学法或酶消化法。学法或酶消化法。l被检细胞或颗粒大小被检细胞或颗粒大小0.20.280um80uml样品中至少样品中至少2000020000个细胞，浓度个细胞，浓度10105 5-10-107 7个个/ /毫升毫升55l空白对照：空白对照：l阴性对照：阴性对照： 常用同型抗体对照常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）（用于仪器校正）l阳性对照：阳性对照：检测阴性时检测阴性时56l单细胞悬液的制备：胰酶消化单细胞悬液的制备：胰酶消化l抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应抗体或标

19、记分子的染色：抗原抗体反应l非特异结合的去除：洗涤和封闭非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体封闭：血清和同型抗体57l荧光染料浓度的控制：荧光染料浓度的控制：合适的荧光染料浓度是保证合适的荧光染料浓度是保证最佳信号产生的重要技术指标。最佳信号产生的重要技术指标。 1 110106 6/ml/ml细胞细胞，用，用2020l l荧光标记的单克隆抗体（荧光标记的单克隆抗体（0.1-1 0.1-1 g/ ml)g/ ml)。l常用固定剂：常用固定剂：细胞周期测定时应将细胞用细胞周期测定时应将细胞用PBSPBS洗涤洗涤三次后用三次后用70%70%冰乙醇固定，在冰乙醇固定，在4 40 0 C

20、 C保存数月；荧光染保存数月；荧光染色后不能及时上机检测，可用色后不能及时上机检测，可用1-4%1-4%多聚甲醛固定，多聚甲醛固定， 4 40 0 C C保存。保存。58l同型对照：同型对照：为阴性对照；实验中选用的大鼠或小为阴性对照；实验中选用的大鼠或小鼠源性标记单抗，就一定选用相同源性的标记单鼠源性标记单抗，就一定选用相同源性的标记单抗作为同型对照来调整设置电流电压。抗作为同型对照来调整设置电流电压。l上机前一般需过目：上机前一般需过目：200-300200-300目目l全程质控：全程质控：从样品制备和标记、溶血、洗涤、仪从样品制备和标记、溶血、洗涤、仪器质控和上机检测，需全程质控。器质控

21、和上机检测，需全程质控。59 样品培养细胞新鲜组织石蜡包埋单细胞 悬液 标记荧光抗体检测表型测定细胞分选流式细胞术操作流程统计学 分析继续培养6061lPIPI（碘化丙啶）是一种（碘化丙啶）是一种DNADNA结合剂，能非特异性嵌结合剂，能非特异性嵌入到入到死细胞死细胞的的DNADNA、RNARNA上；细胞经上；细胞经Triton X-100Triton X-100或或NP-40NP-40打孔，把染料引入细胞内，经过一段时间打孔，把染料引入细胞内，经过一段时间染色后，用染色后，用FCMFCM检测，可判断检测，可判断DNADNA的相对含量。的相对含量。62上机63去甲斑蟊素对肝癌细胞周期的作用去甲

22、斑蟊素对肝癌细胞周期的作用64G0-G1SG2-MFluorescence Intensity# of EventsA typical DNA Histogram of cell proliferation65圈门去除细胞碎片，分析细胞凋亡圈门去除粘连体，分析细胞周期66细胞凋亡分析 67l在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，；细胞膜皱折卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏但早期细胞膜的完整性未受到破坏l凋亡细

23、胞的凋亡细胞的FSCFSC降低，降低，SSCSSC增加。增加。l细胞坏死时，细胞肿胀，细胞坏死时，细胞肿胀，FSCFSC增大，增大，SSCSSC也增大也增大68lDNADNA含量分析含量分析lAnnexin-Annexin-检测法检测法lTUNELTUNEL检测检测l与凋亡相关的蛋白测定，如与凋亡相关的蛋白测定，如APO 2.7APO 2.7，Bcl-2, Bcl-2, Bax, Fas, FasLBax, Fas, FasL等检测等检测69DNA DNA 含量分析含量分析 凋亡的细胞因核酸内切酶的活性增强，使凋亡的细胞因核酸内切酶的活性增强，使DNADNA分裂成一些小分裂成一些小片段，这些小

24、片段因细胞膜的通透性的增加而漏出胞外，使凋亡片段，这些小片段因细胞膜的通透性的增加而漏出胞外，使凋亡细胞的细胞的 DNADNA含量相对减少，因此在含量相对减少，因此在DNADNA的直方图上出现一个位于的直方图上出现一个位于 G1G1峰左侧的小峰（峰左侧的小峰（亚亚G1G1峰峰），称为），称为APAP峰。峰。 FCMFCM的的DNADNA分析检测细胞凋亡存在一定的局限性。比如，机分析检测细胞凋亡存在一定的局限性。比如，机械处理的肿瘤标本常有许多碎片，在械处理的肿瘤标本常有许多碎片，在 DNADNA直方图上出现较宽的杂直方图上出现较宽的杂信号峰，使凋亡细胞被信号峰，使凋亡细胞被“淹没淹没”其中，不

25、少文献将其中，不少文献将G1G1峰前的所有峰前的所有信号均算为凋亡细胞，可能会过高计算凋亡细胞的数量；因此在信号均算为凋亡细胞，可能会过高计算凋亡细胞的数量；因此在评价细胞早期凋亡时，该指标不够灵敏。评价细胞早期凋亡时，该指标不够灵敏。7071Annexin Annexin 磷脂结合蛋白作为探针识别细胞膜表面磷脂结合蛋白作为探针识别细胞膜表面磷脂酰丝氨酸磷脂酰丝氨酸 细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞膜内部的细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞膜内部的磷脂酰丝氨酸（磷脂酰丝氨酸（PSPS）可以迁移到细胞外层表面。巨噬细胞就）可以迁移到细胞外层表面。巨噬细胞就是通过识别凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨

26、酸将凋亡细胞或凋亡是通过识别凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸将凋亡细胞或凋亡小体吞噬，保护机体避免因细胞内部暴露引起的炎症反应。小体吞噬，保护机体避免因细胞内部暴露引起的炎症反应。Annexin Annexin 是一种是一种CaCa离子依赖的、对离子依赖的、对PSPS有高度亲和力的磷脂有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别细胞膜是否有结合蛋白，可作为探针识别细胞膜是否有PSPS而识别凋亡细胞，而识别凋亡细胞，由于坏死细胞也可能在膜表面出现由于坏死细胞也可能在膜表面出现PSPS，故需要同时进行染料，故需要同时进行染料（PIPI）排斥实验，凋亡细胞膜完整，不能染色。）排斥实验，凋亡细胞膜完整，不能染

27、色。Annexin-Annexin-检测检测72Annexin V/PI双染活细胞为（Annexin V-/PI-）坏死细胞为（Annexin V+/PI+）凋亡细胞（Annexin V+/PI-）7374Phosphatidylserine exposure on outer leaflet of membrane bilayer during apoptosis757677双阴：活细胞 Annexin V-PE单阳：早期凋亡细胞双阳：晚期凋亡细胞 7-AADd单阳：坏死细胞784. Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) MediateddU

28、TP Nick End Labeling (TUNEL) AssaySchematic Representation of the Principle of TUNEL AssayThe enzyme TdT catalyses a template-independent addition of bromolated deoxyuridinetriphosphates (Br-dUTP) to the 3-hydroxyl (-OH) ends of double- and single-strandedDNA. After Br-dUTP incorporation, DNA break sites are identified by a FITC-labeledanti-BrdU monocl