第六章 基因工程抗体

1、医学院免疫学研究所王嘉宁Emil von Behring, 1901, antitoxinsGeoreges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibodySusumu Tonegama,1987, structure of Ig geneGerald Edelman and Rodney Porter, 1972, structure of antibodyPaul Ehrlich , 1908, production of antibodyNobel Prize winners免疫球蛋白的功能免疫球蛋白的功能5OrthocloneR

2、eoProRituxanZenapaxSimulectSynagisRemicadeHerceptinMylotargCampath-1HZevalin移植排斥移植排斥心绞痛心绞痛B B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞非霍奇金淋巴瘤移植排斥移植排斥移植排斥移植排斥婴儿呼吸道合胞病毒婴儿呼吸道合胞病毒类风湿关节炎类风湿关节炎乳腺癌乳腺癌急性复发性髓性白血病急性复发性髓性白血病难治性慢性淋巴细胞白血病难治性慢性淋巴细胞白血病难治性难治性B B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞非霍奇金淋巴瘤19861994199719971998199819981998200020012002一一 抗体抗体分子结构分子结构complim

3、entarity determining region, CDRCDRhypervarible region (HVR)(HVR)( (complimentarity determining region, CDRCDR) :formation of the Ag binding sitepurple : HV CDR ( in both the ribbon and ball and stick views) green : antigen HV sequences contact the antigen.antibodyantigenantigen-antibody complex: ep

4、itopethe antibody molecular surface, with the PorA antigen superimposed. Closeup of a hydrogen bond The Tyr 101 of the antibody forms a hydrogen bond with the Gln 121 of the antigen13在Ig分子多肽链中，型、型轻链和Ig的重链分别写作Ig、Ig和IgH，基因依次写作IGK、IGL和IGH，其分别位于第2、22和14号染色体上。 14CV区编码基因: VH (可变区) - 48 DH (多样性区) - 23 JH (

5、连接区) - 6C区编码基因: CH (恒定区): C, C, C等10个片段15V区编码基因: - V, J - 40, 5 - V, J - 30, 4C区编码基因: C (1); C(4)二、细胞工程抗体和基因工程抗体二、细胞工程抗体和基因工程抗体第一代：多克隆抗血清第一代：多克隆抗血清第二代：细胞工程抗体第二代：细胞工程抗体第三代：基因工程抗体第三代：基因工程抗体抗体技术的发展经历了三个阶段抗体技术的发展经历了三个阶段1890年年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素，和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素，并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。 193

6、7年年Tiselius等人用电泳法将血清分为白蛋白、等人用电泳法将血清分为白蛋白、甲种（甲种（）球蛋白、乙种（）球蛋白、乙种（ ）球蛋白、丙种（）球蛋白、丙种（ ）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。组分。 1975年年Khler and Milstein等首次利用等首次利用B淋巴细胞淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体杂交瘤技术制备出单克隆抗体 (monoclonal antibody, MAb)。19941994年基因工程抗体年基因工程抗体。1、多克隆抗体多克隆抗体(polyclonal antibody; PcAb)多价抗原多价抗原多个

7、多个克隆克隆（致敏的（致敏的B细胞）细胞）多多克隆抗体克隆抗体 （1）预防、治疗感染性疾病，）预防、治疗感染性疾病， 如：破伤风抗毒素血清如：破伤风抗毒素血清 抗抗破伤风，破伤风， 胎盘球蛋白胎盘球蛋白 抗病毒感染抗病毒感染等，等， 副作用：副作用： 超敏反应。超敏反应。 （2）临床诊断，）临床诊断， 如：肥达氏反应如：肥达氏反应 - 伤寒、副伤寒，伤寒、副伤寒， 缺点：特异性差。缺点：特异性差。2、单克隆抗体（单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb） 由单一克隆由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗细胞杂交瘤产生的，只识别抗原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。原分子

8、某一特定抗原决定簇的特异性抗体。 特点：具有高度均一性。特点：具有高度均一性。 杂交瘤细胞：杂交瘤细胞： 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 - 无限增殖；无限增殖； 免疫免疫B细胞细胞 - 合成、分泌特异性抗体。合成、分泌特异性抗体。 杂交瘤技术杂交瘤技术 - HAT培养基：次黄嘌呤培养基：次黄嘌呤(H), 氨氨基蝶呤基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶核苷(T)。 单抗制备的流程图单抗制备的流程图 （1）抗原的纯化和结构分析；）抗原的纯化和结构分析； （2）细胞发生、分化及功能的阐明；）细胞发生、分化及功能的阐明； （3）临床疾病的诊断和治疗，）临床疾病的诊断和治疗， 如：免疫分子检测；如：免疫分子检测

9、； 免疫导向药物治疗恶性肿瘤免疫导向药物治疗恶性肿瘤 - McAb抗癌药物抗癌药物(毒素或毒素或 放射核素偶联放射核素偶联)。 多克隆抗体多克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体来源来源动物免疫血清、恢复期病人血动物免疫血清、恢复期病人血清或免疫接种人群清或免疫接种人群多为鼠源性多为鼠源性特点特点来源广泛、制备容易来源广泛、制备容易纯度高、特异性强、效价高、少纯度高、特异性强、效价高、少或无血清交叉或无血清交叉反应反应组成组成针对不同抗原表位的抗体的混针对不同抗原表位的抗体的混合物合物针对单一表位，结构和组成高度针对单一表位，结构和组成高度均一，抗原特异性及同种型一致均一，抗原特异性及同种型一致应用应用

10、疾病的被动免疫治疗疾病的被动免疫治疗疾病诊断、特异性抗原或蛋白的疾病诊断、特异性抗原或蛋白的检测和鉴定、疾病的被动免疫治检测和鉴定、疾病的被动免疫治疗和生物导向药物制备疗和生物导向药物制备缺点缺点特异性不高、易发生交叉反应，特异性不高、易发生交叉反应，不易大量制备不易大量制备人体应用后可导致人鼠抗体反应人体应用后可导致人鼠抗体反应多克隆抗体与单克隆抗体的比较多克隆抗体与单克隆抗体的比较单抗体内应用和疗效受限原因：1.鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量甚少3.生产成本高,难于普及应用人杂交瘤技术未获真正突破原因:融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫

11、新思路：尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。基因工程抗体：根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体，主要包括嵌嵌合抗体合抗体、人源化抗体、小分子抗体、抗体、人源化抗体、小分子抗体、抗体融合蛋白和双特异性抗体融合蛋白和双特异性抗体。27基基因因工工程程抗抗体体1 小分子抗体小分子抗体3 鼠单抗人源化鼠单抗人源化基因工程改造的抗体基因工程改造的抗体2 从杂交瘤细胞分离出从杂交瘤细胞分离出功能功能性可变区基因，与人性可变区基因，与人IgIg恒定区（决定恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达免疫原

12、性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人载体，转染宿主细胞，表达人- -鼠嵌鼠嵌合抗体。合抗体。 特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。Pr 鼠鼠VH 人人 CH Pr 鼠鼠VL 人人 CL免疫球蛋白免疫球蛋白基因载体的构建基因载体的构建H链嵌合载体链嵌合载体L 链嵌合载体链嵌合载体共转染细胞共转染细胞启动子启动子人人- -鼠嵌合抗体基因工程改造策略鼠嵌合抗体基因工程改造策略 鼠鼠VH鼠鼠V L人人CL人人CH抗体分泌细胞抗体分泌细胞人人- -鼠嵌合基因工程抗体鼠嵌合基因工

13、程抗体决定簇互决定簇互补区补区CDR序列序列 CDR序列序列 鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体 人抗体人抗体人源化抗体人源化抗体鼠单克隆鼠单克隆V区人源化（区人源化（CDR移植）移植） 定义：用基因工程方法，定义：用基因工程方法，将抗体将抗体VHVH和和VLVL（重链和轻链可变（重链和轻链可变区）通过一个连接肽连接而成的区）通过一个连接肽连接而成的小分子抗体，小分子抗体， 功能：具有较好的抗原结合功能：具有较好的抗原结合能力，且分子量小、穿透力强、能力，且分子量小、穿透力强、免疫原性低等特性。可与其他效免疫原性低等特性。可与其他效应分子构建成多种具有新功能的应分子构建成多种具有新功能的抗体分子，是构建

14、免疫毒素和双抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体等的理想而基本的元特异抗体等的理想而基本的元件件 。Ag123免疫球蛋白基因载体的构建H链表达载体链表达载体L链表达载体链表达载体共转染细胞共转染细胞Pr VH CH1 Pr VL CLFab 抗体分子的制备抗体分子的制备I Fab antibody molecule抗体分泌细胞抗体分泌细胞VHVLCL-S-S-CH1Fab 抗体分子的制备抗体分子的制备II Fv antibody molecule分别构建载体分别构建载体L链表达载体链表达载体H链表达载体链表达载体共转染细胞共转染细胞Pr VH Pr VL Fv 二硫键稳定的二硫键稳定的Fv (

15、disulfide-stabilized Fv,ds-Fv)小分子抗体的制备小分子抗体的制备(1) ds-Fv抗体分泌细胞抗体分泌细胞VHVL-S-S-Fv小分子抗体的制备小分子抗体的制备disulfide-stabilized Fv,ds-FvVH VL接头接头DNA (Gly4Ser)3 VH引物引物PCR VH 接头接头DNA酶切、克隆酶切、克隆 ScFv (single chain Fv,scFv )的构建的构建 变性、复性变性、复性VL引物引物(2) Sc-FvVL抗体抗原结合是经过补体决定区（抗体抗原结合是经过补体决定区（CDRCDR）来）来实现。因此，实现。因此，CDRCDR是构

16、成抗原抗体结合的最小是构成抗原抗体结合的最小结构单位。根据这一特点，可以设计出那些结构单位。根据这一特点，可以设计出那些在抗原识别及亲和力方面有重要意义的在抗原识别及亲和力方面有重要意义的CDRCDR多多肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的结果。这种只含有一个结果。这种只含有一个CDRCDR多肽的抗体，称为多肽的抗体，称为超变区多肽，亦称为最小识别单位超变区多肽，亦称为最小识别单位(minimal (minimal recognition unit, MRU)recognition unit, MRU)。提高抗体提高抗体效应功能效应功能抗体融合蛋白抗体融

17、合蛋白双特异性抗体双特异性抗体偶连细胞毒物质偶连细胞毒物质细胞内抗体细胞内抗体提高抗体效应功能提高抗体效应功能抗原抗原A A抗原抗原B B-S-S-FabVHCH1VL-S-S-CH1VHVLFvVHVLCTLCD3TUMORCELL-S-S-VHCH1VL-S-S-CH1抗原抗原A A抗原抗原B B（1）杂化杂交瘤技术：将具有某种特异性（如抗瘤细胞）的Mab细胞株与具有抗第二抗原（如蓖麻毒蛋白）的小鼠脾细胞进行融合，即产生出杂化杂交瘤细胞株的二价瘤体。它们分泌的是重链、轻链被杂化的抗体分子，有10种形式： 重链、轻链都无改变，保持原特异性的配对抗体分子： LH-HL，KG-GK 重链特异性相

18、同的配对抗体分子： LH-HK，KH-HK KG-GL，LG-GL 重链、轻链特异性不同的配对抗体分子： LH-GK，LH-GL KH-GL，KH-GK 在这些杂化抗体分子中，只有LH-GK配对的才是所需的双功能抗体分子。（2）化学交联法：Nisonoff和Rivers最早从事这方面的研究。化学交联的方法无需经过细胞融合，所以比较简便易行。 通常利用重链与轻链这间的二硫链经还原和再氧化，将两种不同特异性抗体的半分子结合在一起。或用双功能交联剂，如邻苯酸酯等，把两个抗体半分子交联在一起。 用于制备双功能抗体的Mab可以是完整分子，也可是经胃酶水解获得F（ab）2片段。后者在减少鼠源免疫原性方面，效果较好。（3）利用基因工程技术将两套重轻链基因导入骨髓瘤细胞或传染瘤细胞中。 这种方法制备的双功能抗体可选择合适的稳定区和合适的类及亚类，而得到较好的产量较高的双功能抗体。由于只有较少的嵌合导入并整合到宿主基因组，故传染瘤细胞更为稳定，染色体不易丢失 免疫毒素免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicin ARicin A（-FcRI-Ricin A）Ricin A:蓖麻毒素A,对肿瘤细胞具有毒性作用偶连细胞毒物质偶连细胞毒物质连接放射性同位素连接放射性同位素( (131131I I、99m9