急性毒性实验内容ppt课件

1、1急性毒性试验方法急性毒性试验方法2一、急性毒性一、急性毒性 急性毒性指人或动物一次或急性毒性指人或动物一次或24 h之内多次接触外源化学物后，在短期内之内多次接触外源化学物后，在短期内所发生的毒性效应，包括致死效应。所发生的毒性效应，包括致死效应。3一次：指瞬间给实验动物染毒，如经口、经静脉注射染毒。一次：指瞬间给实验动物染毒，如经口、经静脉注射染毒。24 h之内多次：指外源化学物毒性过低，需给予动物较大剂量。之内多次：指外源化学物毒性过低，需给予动物较大剂量。4 急性毒性效应出现的快慢和毒性反应的强度与外源化学物的性质和染毒剂量急性毒性效应出现的快慢和毒性反应的强度与外源化学物的性质和染毒

2、剂量的大小有关。的大小有关。 如：丙烯腈，过氧化二碳酸二环己酯如：丙烯腈，过氧化二碳酸二环己酯5急性毒性试验目的n了解外源化学物急性毒性的强度，求出了解外源化学物急性毒性的强度，求出LD50n了解外源化学物毒作用的性质、毒效应的特征及可能的靶器官，初步评了解外源化学物毒作用的性质、毒效应的特征及可能的靶器官，初步评价外源化学物的危险性。价外源化学物的危险性。n探求外源化学物的剂量探求外源化学物的剂量-反应（效应）关系，为亚慢性毒性、蓄积毒性和反应（效应）关系，为亚慢性毒性、蓄积毒性和慢性毒性及特殊毒性试验染毒慢性毒性及特殊毒性试验染毒剂量的设计和观察指标的选择提供参考。剂量的设计和观察指标的选

3、择提供参考。n初步了解动物致死的原因，为研究毒作用的机制提供线索，进而为制定初步了解动物致死的原因，为研究毒作用的机制提供线索，进而为制定中毒急救治疗措施提供依据中毒急救治疗措施提供依据。6 由急性毒性试验可得到两类毒性参数由急性毒性试验可得到两类毒性参数l上限参数上限参数 是以死亡为终点的毒性，包括绝对致死量、半数致死量、是以死亡为终点的毒性，包括绝对致死量、半数致死量、最小致死量、最大耐受量等；最小致死量、最大耐受量等；l下限参数下限参数 是以非致死性急性毒作用为终点的毒性，包括急性阈剂是以非致死性急性毒作用为终点的毒性，包括急性阈剂量和无作用剂量等。量和无作用剂量等。7 用小动物试验可求

4、出外源化学物对一种或几种实验动物的急性用小动物试验可求出外源化学物对一种或几种实验动物的急性LD50或或LC50; 用大动物试验可求出近似致死剂量（用大动物试验可求出近似致死剂量（approximate lethal dose, ALD）; 根据根据LD50（LC50）值可进行急性毒性分级，以初步评价外源化学物对机体）值可进行急性毒性分级，以初步评价外源化学物对机体急性毒性大小和急性毒作用的强度。急性毒性大小和急性毒作用的强度。8急性毒性试验项目急性毒性试验项目n急性半数致死量测定急性半数致死量测定n半数耐受限量测定半数耐受限量测定n7d喂养试验喂养试验n其他：近似致死量试验、其他：近似致死量

5、试验、固定剂量法、急性毒性分级法、阶梯法、金固定剂量法、急性毒性分级法、阶梯法、金字塔法、限量试验、急性系统毒性试验等字塔法、限量试验、急性系统毒性试验等。 9急性毒性试验设计急性毒性试验设计 实验动物选择实验动物选择品种品种品系品系个体个体 性别性别 年龄年龄 体重体重 生理病理状况生理病理状况 对外源化学物毒性反应与人近似；对外源化学物毒性反应与人近似； 易于饲养管理，方便实验操作；易于饲养管理，方便实验操作； 易于获得，品系纯化，价格低廉。易于获得，品系纯化，价格低廉。原则原则10 实验动物的年龄与体重的关系实验动物的年龄与体重的关系 动动 物物 大鼠大鼠 小鼠小鼠 豚鼠豚鼠 兔兔 犬犬

6、 猫猫成年年龄（周）成年年龄（周） 3 2 2 34 34 34 体重（克）体重（克） 150 15 250 1.5kg 715kg 1kg寿命（年）寿命（年） 23 23 68 49 1520 101211急性急性毒性试验的动物体重毒性试验的动物体重n大鼠大鼠 120150n小鼠小鼠 1822n豚鼠豚鼠 200250n家兔家兔 22.5 kgn犬犬 1015kg（成年）（成年）n变异范围不得超过所用动物平均体重的变异范围不得超过所用动物平均体重的10。12急性急性毒性试验的动物要求毒性试验的动物要求n动物数量：小动物动物数量：小动物46组，每组至少组，每组至少10只；犬等大动物每组只；犬等大

7、动物每组6只。只。n性别：雌雄各半，也有例外，如，致畸试验的剂量准备，只作雌性动物性别：雌雄各半，也有例外，如，致畸试验的剂量准备，只作雌性动物LD50。n年龄：刚成年，未曾受孕、交配年龄：刚成年，未曾受孕、交配13实验实验动物的标记动物的标记 染色法染色法 耳缘孔口法耳缘孔口法 烙印法烙印法 挂牌法挂牌法14染色法染色法 用不同颜色的染料涂擦于动物不同部位来用不同颜色的染料涂擦于动物不同部位来 表示不同号码，适用于大鼠、小鼠和豚鼠。表示不同号码，适用于大鼠、小鼠和豚鼠。 常用染料：常用染料： 35苦味酸酒精饱和液，呈黄色；苦味酸酒精饱和液，呈黄色； 甲基紫酒精饱和液，呈紫色；甲基紫酒精饱和液

8、，呈紫色； 0.5中性红或品红溶液，呈红色等。中性红或品红溶液，呈红色等。15实验实验动物的标记动物的标记 方法一：方法一： 按右前肢、右肋、右后肢、颈部、背中、尾根、左按右前肢、右肋、右后肢、颈部、背中、尾根、左 前肢、左肋、左后肢，顺序编号为前肢、左肋、左后肢，顺序编号为19号，不染色号，不染色 为为10号。在动物相同部位涂染另一种颜色染料表示号。在动物相同部位涂染另一种颜色染料表示 十位，两种颜色可编十位，两种颜色可编199号。号。 方法二：方法二： 以头部为以头部为1号，顺时针方向依次从右耳、右前肢、右号，顺时针方向依次从右耳、右前肢、右 后肢、颈部、背中、尾根、左耳、左前肢、左后肢后

9、肢、颈部、背中、尾根、左耳、左前肢、左后肢 染色，分别为染色，分别为210号。号。61617染色法染色法优点：优点： 简单方便，不痛苦，无损伤。简单方便，不痛苦，无损伤。缺点：缺点： 时间较长时，染色剂易褪色；时间较长时，染色剂易褪色； 标记容易模糊不清。标记容易模糊不清。18耳缘孔口法：耳缘孔口法： 在耳缘先用针穿孔和用剪刀剪口，再用酒精墨汁涂抹，使黑色渗入孔口，在耳缘先用针穿孔和用剪刀剪口，再用酒精墨汁涂抹，使黑色渗入孔口，伤口愈合后不易脱落，这种标号亦可标号。伤口愈合后不易脱落，这种标号亦可标号。 适用于大、小鼠。适用于大、小鼠。19烙印法：烙印法： 将铸铁号码加热后，在动物体表部位烧烙

10、，以破坏毛囊，留下印记。适用将铸铁号码加热后，在动物体表部位烧烙，以破坏毛囊，留下印记。适用于大动物。于大动物。挂牌法：挂牌法： 用金属或塑料制成号牌，固定在动物的耳部或系于其颈部。适用于较大动用金属或塑料制成号牌，固定在动物的耳部或系于其颈部。适用于较大动物。物。20实验动物分组实验动物分组 目的：目的：减少个体差异对实验结果的影响；原则：按统计学原则随机分组，使非减少个体差异对实验结果的影响；原则：按统计学原则随机分组，使非处理因素最大限度地保持一致，提高每组实验动物间的均衡性。处理因素最大限度地保持一致，提高每组实验动物间的均衡性。 常用方法：常用方法：完全随机完全随机和和随机区组随机区

11、组21完全随机设计完全随机设计 将实验动物编号，从随机数字表上任意横行或纵行的任意数字开始，顺序将实验动物编号，从随机数字表上任意横行或纵行的任意数字开始，顺序取下数字，标于每个动物号下，然后用计划组数去除随机数字，所得余数取下数字，标于每个动物号下，然后用计划组数去除随机数字，所得余数即为所属组别。如将只动物分为组，从随机数字表的第行开始，即为所属组别。如将只动物分为组，从随机数字表的第行开始，顺序取个数字，用除的余数即为组别。顺序取个数字，用除的余数即为组别。2220只动物的完全随机分配只动物的完全随机分配 23完全随机分配后各组所属动物号完全随机分配后各组所属动物号 2420只动物完全随

12、机分配的结果 2520只动物的完全随机分配只动物的完全随机分配动物编号动物编号1234567891011121314151617181920随即数字随即数字5483805390755378934772095466954468676786除除4后余后余数数23012312130122300332所属组别所属组别二二三三 四四 一一 二二 三三 一一 二二 一一 三三 四四 一一 二二 二二 三三 四四 四四 三三 三三 二二26完全随机分配后各组所属动物号完全随机分配后各组所属动物号 组别组别动物编号动物编号一一47912二二1581320 14三三26101518 19四四3111617272

13、0只动物完全随机分配的结果 组别组别动物编号动物编号一一4791219 二二1581314 三三2 6101518 四四31116172028随机区组设计随机区组设计 将动物称重，按体重顺序依次排列编号，分成若干个区组，每一区组的动物体将动物称重，按体重顺序依次排列编号，分成若干个区组，每一区组的动物体重相近，每一区组的动物数即为组数。再从随机数字表上任意抄下随机数字，重相近，每一区组的动物数即为组数。再从随机数字表上任意抄下随机数字，依次标在每个动物的编号下，如欲将动物分为组，则将每一区组动物编号下依次标在每个动物的编号下，如欲将动物分为组，则将每一区组动物编号下的随机数字，按顺序分别用、除

14、之，根据余数大小将动物分入各的随机数字，按顺序分别用、除之，根据余数大小将动物分入各组。组。29 原则是余数即为所属组别，余数原则是余数即为所属组别，余数0属最后一组。当同一区组中有相同余数时，属最后一组。当同一区组中有相同余数时，非非0余数按顺序分配至未分配动物的首位组，而余数按顺序分配至未分配动物的首位组，而0余数则按顺序分配至未分余数则按顺序分配至未分配动物的末尾组。如下表第一区组中，第一个余数是配动物的末尾组。如下表第一区组中，第一个余数是0，将，将1号大鼠分到第号大鼠分到第4组；第组；第2个余数为个余数为1，2号大鼠分到第号大鼠分到第1组；第组；第3个余数仍为个余数仍为1，未分配动物

15、的，未分配动物的第第2组居首位，故将组居首位，故将3号大鼠分到第号大鼠分到第2组；余下组；余下4号大鼠则分到第号大鼠则分到第3组。组。 优点：各组的动物数目相等，动物平均体重相近，可以减少实验误差；动物优点：各组的动物数目相等，动物平均体重相近，可以减少实验误差；动物数目较多时比完全随机法快。数目较多时比完全随机法快。3020只小鼠按随机区组设计分组表 31随机分配到各组的动物 32 剂量选择及分组n剂量选择剂量选择 广泛查阅文献资料，估计毒性中值广泛查阅文献资料，估计毒性中值预试，求出待测化学物预试，求出待测化学物0 %100 %或或 10 %90 %的大致致死剂量范围的大致致死剂量范围设计

16、正式试验的剂量和分组设计正式试验的剂量和分组 33剂量分组剂量分组ilgLD100-lgLD0/n-1 或或ilgLD90-lgLD10/n-1n：设计的剂量组数：设计的剂量组数 i：组距，相邻两个剂量组对数剂量：组距，相邻两个剂量组对数剂量 之差之差34受试物的配制受试物的配制n溶剂的选择溶剂的选择n配制方法配制方法n等容量稀释等容量稀释n等浓度稀释等浓度稀释35受试物的配制受试物的配制等容量稀释：等容量稀释： 要求不同剂量组实验动物单位体重所给受试物的体积相同时，就将受要求不同剂量组实验动物单位体重所给受试物的体积相同时，就将受试物配成不同浓度。等比稀释法（试物配成不同浓度。等比稀释法（1

17、：k）等浓度稀释：等浓度稀释： 将受试化学物配成一种浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给受试将受试化学物配成一种浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给受试化学物的体积不同。化学物的体积不同。36试验期限及观察指标n观察期限为观察期限为714dn求求LD50时，目前国内外一般要求计算实验动物接触外源化学物后时，目前国内外一般要求计算实验动物接触外源化学物后14 d内的总死亡数内的总死亡数n对于速发性死亡的化学物也可只计算对于速发性死亡的化学物也可只计算24 h的死亡数，如久效磷的死亡数，如久效磷24 h与与14 d的的LD50没有差别没有差别37观察指标观察指标n中毒症状：确定靶器官中毒症状：确定

18、靶器官 行动：不安定、多动、发声；行动：不安定、多动、发声； 神经系统反应：举尾、振颤、痉挛、运动失调、姿态异常；神经系统反应：举尾、振颤、痉挛、运动失调、姿态异常； 自主神经系统反应：眼球突出、流涎、流泪、排尿、下泻、竖毛、皮肤自主神经系统反应：眼球突出、流涎、流泪、排尿、下泻、竖毛、皮肤变色、呼吸。变色、呼吸。n体重：隔日测量体重：隔日测量n死亡和死亡时间死亡和死亡时间 n病理学检查及其他指标病理学检查及其他指标 38LD50的计算的计算nLD50测定是以动物死活为指标的质反应，当死亡呈正态分配时，一般具有以下测定是以动物死活为指标的质反应，当死亡呈正态分配时，一般具有以下特点：特点：n剂

19、量对数值与动物死亡频数之间为正态分布曲线关系；剂量对数值与动物死亡频数之间为正态分布曲线关系；n剂量对数值与死亡率之间为正剂量对数值与死亡率之间为正“S”型曲线；型曲线；n从实验数据可计算从实验数据可计算LD50以外的其它信息。以外的其它信息。39对数剂量剂量曲线：中间高、两侧低，右侧延长较远正态曲线中 点中 点40n计算计算LD50的常用方法的常用方法:n概率单位法概率单位法nBliss法法n改良寇氏（改良寇氏（Krber）法等）法等41LD50的计算公式的计算公式42校正公式校正公式43LD50的标准误的标准误44LD50 的的95 %可信限可信限LD50 的的95 %可信限可信限=log

20、-1(log LD501.96Sx50)45n i组距，即相邻两组剂量对数剂量之差组距，即相邻两组剂量对数剂量之差nXm最大剂量对数最大剂量对数nP各剂量组死亡率各剂量组死亡率(死亡率均用小数表示死亡率均用小数表示)nPm最高死亡率最高死亡率nq各剂量组存活率，各剂量组存活率，q=1-pnPn最低死亡率最低死亡率np各剂量组死亡率之和各剂量组死亡率之和nn各组动物数各组动物数nSx50logLD50的标准误的标准误46n寇氏原法：要求最小剂量的反应率（寇氏原法：要求最小剂量的反应率（P）为）为0，最大剂量反应率（，最大剂量反应率（P）为为100，结果才精确。，结果才精确。n 改良寇氏法只要求在

21、最小剂量时改良寇氏法只要求在最小剂量时P0.2，最大剂量，最大剂量p0.8即可。还要求即可。还要求每个剂量组的组间距呈等比或剂量对数等差，每个剂量组动物数相等，每个剂量组的组间距呈等比或剂量对数等差，每个剂量组动物数相等，中间剂量接近于中间剂量接近于LD50。47 九灵胃康在小鼠的经口急性毒性试验结果九灵胃康在小鼠的经口急性毒性试验结果 48n LD50=log-10.8859-0.11(2.8-0.5) = log-10.6329 =4.29 （g/kg）n Sx50=0.0307n logLD50及其及其95%可信限可信限 =0.63291.960.0307=0.63290.0602n 小鼠的经口小鼠的经口LD50为为4.29g/kg，其，其95%可信范围可信范围 为为3.744.93g/kg49急性毒性评价 外源化学物相对毒性分级标准外源化学物相对毒性分级标准 50急性毒性分级（急性毒性分级（WHO）51鱼类急性毒性分级鱼类急性毒性分级52LD50的局限性的局限性n消耗动物量大消耗动物量大n获得的信息有限获得的信息有限n动物死亡和观察的症状不足以反应生理学、血液学和其它化验检查所提供的毒动物死亡和观察的症状不足以反应生理学、血液学和其它化验检查所提供的毒性信息性信息n有许多因素影响有许多因素影响LD50值的测定，实际上测得的值