实验1细胞工程基础实验技术实验准备MS培养基母液配制按配方表...

1、实验1 细胞工程基础实验技术 实验准备：ms培养基母液配制按配方表配制ms培养基母液：大量元素配20×，微量元素和其它成分配制成200×，母液贮存于24的冰箱中。 植物激素配制ba和naa配制成浓度为0.5mg/ml的溶液，贮存在24下备用。1.1 实验目的使学生了解培养基母液的配制方法和注意事项；掌握培养的配制及灭菌方法，为植物愈伤组织诱导实验准备培养基。1.2 实验用品及溶液实验按每4个学生一组，每组分发培养基母液及激素母液一套，50ml量筒、1000ml有刻度烧杯、吸球、电炉各1 个，5ml移液管9支，50ml三角瓶20个。公用设备：ph计，高压灭菌锅。1.3 操作方

2、法实验按500ml容量一组配制培养基，保证下一次实验每一学生有5瓶培养基供接种用。愈伤组织诱导培养基：msba 2mgl-1+naa mgl-1+ sucrose 20g-1+ agar 7g-1a向容量瓶中顺序加入培养基母液：大量元素 25ml微量元素 2.5ml铁 盐 2.5ml其它成分 各2.5mlba和naa 各2.0mlb加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水，加入10g蔗糖后搅拌使其溶化，用0.5n的naoh和0.5n的hcl调整ph至5.8-6.0。c加入3.5g琼脂，将烧杯置于电炉上，搅拌加热使琼脂完全溶化，然后用蒸馏水定容至终体积500ml，继续加热几分钟使之混合均匀

3、后分装于三角瓶中。用记号笔写上学号或姓名。d. 分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件为温度121，压力1.1kg/cm2，灭菌时间20min.左右。灭菌后的培养基置于无菌室保存备用。1.4 记载内容培养基配制过程。灭菌方法介绍不同类型灭菌设备的使用方法；采用高压蒸汽灭菌器对配置的培养基进行灭菌。实验2 无菌操作及愈伤组织诱导技术 实验准备：烟草无菌试管苗培养：将烟草种子用消毒液84消毒后，无菌水洗3次，无菌吸水纸吸干水分，接种在ms培养基上。种子苗具4-5叶时继代扩繁90盒，保证每学生1盒。无菌培养皿每学生2套。实验课开始前30min. 将实验用具、培养基及无菌烟草苗同时用酒精用7

4、5%酒精擦洗后置于超净工作台，打开超净工作台风机和紫外灯。2.1 实验目的掌握无菌操作技术；基本掌握植物愈伤组织诱导培养技术和调控条件。2.2实验材料及设备外植体材料：烟草无菌苗叶片；实验1配制的培养基。设备及工具：超净工作台；不锈钢镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯等；75%酒精。2.3 操作方法a. 在自来水管下将手洗净，然后用75%酒精将手消毒，再进入超净工作台开始接种操作。b. 点燃酒精灯，将镊子、解剖刀在酒精灯下烤干。c. 取一无菌培养皿，然后用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于无菌培养皿中，并用锋利解剖刀将叶片切成2mm2左右的小片，然后将其接种于准备好的培养基上，一般每瓶接种4-5小片。d

5、. 快速封好瓶口，用记号笔写上姓名和接种日期。e. 接种后的三角瓶置于24，条件下黑暗培养一周，然后在同样温度下有光照和全黑暗下培养直至愈伤组织形成。注意外植体切割时，动作要快，否则会造成失水而影响生长。为防止操作时失水也可在培养皿中滴几滴无菌水，然后将无菌苗置于其中进行切割。2.4 记载内容培养基凝固状况；实验操作过程；叶片生长状况、接种外植体大小；每瓶接种数、接种总瓶数。实验3 器官发生与植株再生调控培养；愈伤组织增殖培养 实验准备：配制器官分化和愈伤组织诱导培养基。培养基配方：分化培养基ms基本培养基附加2.0mgl-1ba、和0.5mgl-1naa。愈伤组织增殖培养基ms基本培养基附加

6、2.0mgl-1ba、和2.0mgl-1naa。3.1 实验目的观察和分析不同光照条件形成的愈伤组织对器官分化的影响，观察和分析愈伤组织诱导和器官分化的激素使用差异；了解器官分化和植株再生的过程。掌握离体培养中的转接技术。 3.2 实验材料及设备实验材料：实验2中诱导的愈伤组织实验设备和用具：同实验2。3.3 操作方法a. 观察实验1愈伤组织诱导结果：统计愈伤组织诱导率；观察记载黑暗和光照条件下愈伤组织的差异，结合理论学习进行分析。愈伤组织形成率愈伤组织数/接种外植体数b. 按照实验2相同的步骤，作好无菌操作准备。c. 将实验2中光照下诱导的愈伤组织，全部转入分化培养基上，黑暗诱导的愈伤组织一

7、半转入分化培养基，所有转入分化培养基的愈伤组织均置于连续光照或16h/d光照，温度2022条件下培养。需要注意的是，愈伤组织的状态常常受许多因素的影响，如果转入分化培养后34周仍然没有芽的形成，或愈伤组织状态没有明显变化，应及时调整培养基激素浓度，更换新鲜培养基。d. 将另黑暗下培养的另一半愈伤组织转入增殖培养基中，继续置于黑暗条件下培养，培养温度24。3.4 记载内容上次实验愈伤组织诱导结果：愈伤组织诱导率；愈伤组织状态、大小；不同光照形成的愈伤组织状态描述；污染率统计。本次实验操作过程，接种瓶数，每瓶接种量。实验4 细胞悬浮培养 实验准备：用ms培养基配置2%的果胶酶并用过滤灭菌器过滤；配

8、置液体培养基分装于200ml的三角瓶中，每瓶50ml。培养基配方：ms无机盐附加烟酸0.05mgl-1、vb6和vb1各0.01mgl-1、甘氨酸3mgl-1、肌醇100mgl-1、激动素0.2mgl-1、2,4d 0.1mgl-1、蔗糖20gl-1，ph5.8。4.1 实验目的了解细胞悬浮系建立的全过程，掌握细胞液体悬浮培养技术。4.2 实验材料烟草叶片在黑暗条件下培养形成的愈伤组织，再经过1-2次增殖培养后用于悬浮细胞系的建立（可与体细胞胚诱导实验同时培养）。4.3 操作方法a. 按照实验2相同的步骤，作好无菌操作准备。b. 在净化工作台上，用无菌注射器将果胶酶1ml加入到已灭菌的含有液体

9、培养基的三角瓶中，轻轻摇匀，再将复合要求的松散愈伤组织用细胞铲接种于液体培养基中。接种量大约为培养基体积的十分之一。c. 接种后的三角瓶用1/100的天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速100rpm，25下培养。d. 培养24小时后，将培养物收集到50的离心管中，在800 rpm下离心5min.，去除含有果胶酶的培养基，加入新鲜培养基，摇匀再离心一次，去除上清夜，然后按照细胞与培养基1：10的比例接种到三角瓶中。e. 培养5天后观察结果。4.4 结果观察内容采用重量法测定细胞生长量。实验5 种子细胞筛选与细胞规模化培养 实验准备：经过多次继代的悬浮细胞；配置含8%琼脂糖的固体培养基，按组

10、分装成7份；配置液体培养基2升；每人2套灭菌培养皿。5.1 实验目的掌握单细胞分离和培养技术；了解细胞规模化培养设备与进样接种技术。 5.2 种细胞的筛选单细胞平板培养。a. 将琼脂糖培养基在加热器上融化，将悬浮细胞过滤除去大的细胞团，然后离心并将密度调整至5×105左右。b. 将融化的琼脂培养基在未凝固前，与上述细胞悬浮液按4:1混合后，平铺在培养皿中，操作时特别注意温度不能过高，以免给细胞造成伤害。c. 在细胞分裂形成可见的小愈伤组织时，将单个细胞的愈伤组织分别接种在平板培养基上单独培养，由每个细胞形成的愈伤组织即为一个细胞系（clone）。* 实际应用中，待单个愈伤组织长至能检

11、测成分的大小时，取每个愈伤组织的一半用于成分分析，另一半继续培养。成分分析完成后，淘汰不符合要求的愈伤组织，对复合要求的愈伤组织扩大繁殖。繁殖到一定规模后即可用于规模化生产。5.3 细胞规模化培养以班为单位，将各自的悬浮细胞收集在一起，按照生物反应器的进样操作接种，接种后每隔3天取样测定培养情况，2周后结束实验，根据测定结果绘制细胞生长曲线图。实验6 原生质体分离与体细胞杂交 实验准备：配置并过滤灭菌2%的纤维素酶和0.4%果胶酶；蔗糖22%的原生质体漂浮培养基；原生质体培养基；fda母液和工作液。6.1 实验目的掌握植物细胞酶解去壁方法；原生质体活力鉴定的方法；了解细胞杂交的基本程序和方法。

12、 6.2 原生质体分离实验材料：烟草无菌苗叶片，烟草悬浮细胞系。实验操作：a. 取生长3周的烟草无菌苗平展嫩叶，置于含有一薄层600mmol/l甘露醇-cpw溶液中，置于4黑暗下预处理6-8小时；悬浮细胞置于4黑暗下预处理48小时。b. 预处理的叶片用吸管吸去预处理液，悬浮细胞离心转入培养皿中，然后加入2纤维素酶、0.4果胶酶溶液，用封口膜将培养皿封严，置于暗处在2426下保温酶解；c. 在倒置显微镜下观察，细胞壁已降解，有圆球形原生质体释放到溶液中，即终止酶解。用吸管轻轻压挤，以释放出全部原生质体；d. 通过一个6080m的细胞筛过滤以除去较大的碎屑。滤液置于1个螺帽离心管中，在100g下离

13、心3min，使原生质体沉降；e. 弃取上清夜，将沉降物缓慢加入含有cpw配制的860mmol/l蔗糖溶液的螺帽离心管中，在在100g下离心10min；f. 将蔗糖溶液的上部原生质体带收集起来，并转入到另一个离心管中。在离心管中加入原生质体培养基以使原生质体悬浮，在100g下离心3min，重复本相清洗过程至少3次；g. 最后一次清洗之后，加入培养基调整原生质体密度至0.5×105到1×105/ml。将原生质体按讲授的方法培养。6.3 原生质体活力与密度测定a取一小指形管（已灭菌），加入1ml刚分离的原生质体悬浮液，再在其中加入1-2滴fda工作液；b在血球计数板上滴一滴经fd

14、a处理的原生质体悬浮液，置于荧光倒置显微镜下观察。c根据发荧光细胞占总细胞的比例计算原生质体生活力，根据单位体积的细胞数计算细胞密度。6.4 peg诱导细胞体融合a. 将上述分离的原生质体密度调整为4×105/ml的原生质体悬浮液备用；b. 在1个60×15mm的培养皿中滴1滴（23ml）硅液200，然后在硅液上面放一张22×22mm的盖片；c. 将叶片原生质体和悬浮细胞原生质体等体积（一般各0.5ml）混合，然后用吸管吸取大约150l原生质体悬浮液置于盖玻片上。静止大约5 min，以使原生质体沉降在盖片上形成一个薄层；d. 然后在原生质体悬浮液中，加入等体积的p

15、eg溶液（50%peg1540，10.5mmol/lcacl2?2h2o，0.7mmol/lkh2po4?h2o）。室温（24）下，将peg溶液中的原生质体保温1020 min.，在倒置显微镜下观察原生质体粘连的情况；e. 以5 min间隔轻轻加入2滴稀释液（50 mmol/l甘氨酸，50mmol/lcacl2?2h2o，300 mmol/l葡萄糖，ph910.5），保持5 min后，加入1滴原生质体培养基；f. 用新鲜的原生质体培养基，以各为5 min的间隔，将原生质体清洗5遍，每次洗完之后，不要把盖片上的培养基全部去掉，要在原生质体上留下一薄层旧培养基，而将新鲜培养基加于其上。此时可在倒置

16、显微镜下，根据叶绿体标记统计异核融合率；g. 洗涤完成后在盖玻片上滴大约500l原生质体培养基，在盖玻片周围以小滴形式再加入5001000l培养基，以保持培养皿内的湿度，封口后置于25黑暗条件下培养。6.5 细胞电融合演示通过实际操作，演示电融合的操作过程和细胞融合过程。实验7 实验结果统计分析与实验论文写作 1实验结果统计分析1.1 愈伤组织诱导编号每瓶接种数培养条件(暗、光)愈伤组织诱导率(%)愈伤组织状态污染率(%)              

17、60;                     愈伤组织诱导率（）实际形成愈伤组织数/接种外植体数×1001.2 器官分化与植株再生烟草叶片愈伤组织再生植株情况统计表编号愈伤组织来源分化率(%)每个愈伤组织分化芽数分化芽状态污染率(%)            

18、                        分化率（）能够分化芽的愈伤组织/接种愈伤组织数×1001.3 两种类型愈伤组织分化能力差异显著性分析a. 分化率的差异显著性分析；b. 芽分化数的差异显著性分析。2. 论文写作2.1 基本要求字数不少于2000字；参考文献不少于12篇。文字流畅，逻辑性强；注意应用科学语言进行协作，避免口语化描述；对于

19、所涉及的科学概念与术语力求准确、严谨。2.2 格式要求按理科学术论文发表格式撰写。2.3 具体要求a. 前言部分应对细胞工程的整体情况进行必要的综述；b. 材料与方法部分要求详细叙述实验过程；c. 结果分析部分，要求实事求是对本人实验结果进行清晰的叙述，实验失败的必须详细分析可能的原因；实验结果涉及到数据的内容必须准确、不得使用大概、约多少等不确定词；能够用本课程的理论原理对实验结果进行分析讨论；并能够将相关学科的知识应用于结果分析中。* 选修实验是在完成上述基本实验训练基础上，根据学生兴趣开设的实验课，由于所用实验条件要求较高，实验周期较长，因此对每位学生而言，一般限报1项，实验采用周末非课

20、堂时间进行。同时，选修实验也可与学“华中农业大学大学生srf科技创新基金”结合进行，学分单独计算，所选材料除了模式实验材料外，还选用与相关任课教师科研课题有关的材料。细胞工程基础实验技术 1. 器皿洗涤玻璃器皿洗涤：新的玻璃器皿上附有游离的碱性物质，其洗涤方法是用1%的hcl溶液浸泡一昼夜，再用合成洗涤剂洗刷，然后用清水反复冲洗，最后用蒸馏水冲洗12次，干燥后即可使用。已使用过的试管、烧杯、三角瓶等的洗涤方法是，先将器皿中的残渣除去，用清水洗净，再用合成洗涤剂洗刷，用清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗12次。用过的吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品，需先放入铬酸洗涤液中浸泡两小时以上，取出后经流水冲洗

21、半小时左右，再用蒸馏水冲洗12次，然后烘干或晾干。载玻片和盖玻片容易破碎，洗涤时不宜用力擦洗，其洗涤方法是先用清水冲洗，然后放入铬酸洗涤液中浸泡几小时或用稀铬酸洗涤液煮沸半小时，取出后用清水冲洗干净，将其储藏在95%的酒精中。塑料用品洗涤：塑料用品一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较强，因此冲洗时必须反复多次，最后用蒸馏水冲洗。金属用品洗涤：金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤，需要清洗时，一般用酒精擦洗，并保持干燥。2. 培养基配制2.1 母液配制为工作方便起见，常用培养基通常先按配方配制成浓度高于实际使用浓度若干倍的母液，使用时按按比例稀释即可。一般大量元素配制成1020倍母液，微量元素和其它成

22、分配制成100200倍母液。常用的ms培养基母液配制见附表。配好的母液需贮存于24的冰箱中，定期检查有无沉淀和微生物污染，如果出现沉淀或微生物污染，则不能使用。2.2 植物激素配制植物激素一般配制成浓度为0.11.0mg/ml的溶液，贮存在24下备用。由于多数激素难溶于水，一般按以下方法配制。iaa： 先用少量95%乙醇使之充分溶解，再加蒸馏水定容至需要浓度的体积。naa： 可溶于热水中，也可采用与iaa同样的方法配制。2,4-d： 先用少量1n的 naoh溶液充分溶解，然后缓慢加入蒸馏水定容至需要浓度体积。细胞分裂素类： kt和ba等细胞分裂素类物质均溶于稀盐酸，应先用少量1n的hcl溶解后

23、再稀释至需要浓度。赤霉素： 赤霉素的水溶液稳定性较差，一般用95%的乙醇配制成510mg/ml的母液低温保存，使用时再稀释。2.3 培养基配制按实际配制培养基体积，取各母液的需要量加入一适当体积的烧杯或其它配制培养基的容器中，加入实际配制培养基体积约2/33/4的蒸馏水，然后按每升所用蔗糖的量称取相应量的蔗糖（如1l培养基加20g蔗糖，若只配0.5l培养基，则称取15g蔗糖）放入培养基中使其溶化。用1n的naoh或1n的hcl调整ph至5.86.0，再按0.60.8%的比例加入琼脂，并搅拌加热使琼脂完全溶化，然后用蒸馏水定容至终体积，混合均匀后分装于培养器皿（三角瓶或试管等）或其它培养器皿中，

24、然后进行高压灭菌。3. 培养基及实验用具灭菌分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件为温度121，压力1.1kg/cm2，灭菌时间灭菌时间与培养基容量的关系见下表。如果使用人工控制的灭菌锅，必须注意灭菌温度的稳定控制，因为温度过高会引起培养基成分和ph的改变，而温度过低则会造成灭菌不彻底。灭菌后的培养基室温下最好在12周内用完，特殊情况可贮存于4下1个月左右。 培养基体积与灭菌时间的关系培养基体积（ml）灭菌温度（）灭菌时间（min.）2050121205050012125500500012535玻璃器皿可任选湿热和干热灭菌方法灭菌。湿热灭菌条件与培养基灭菌条件一致，但要适当延长灭菌时

25、间，一般以2530分钟为宜。湿热灭菌后器皿和包装表面常常有水蒸气覆盖，如果不及时干燥常常容易微生物的再侵染，因此，器皿灭菌后应及时放入净化工作台上吹干。干热灭菌即在烘箱中加热至160180后恒温保持40分钟，或120灭菌2小时。玻璃器皿放入烘箱之前必须完全干燥，以免引起破碎，灭菌时温度要缓慢上升，灭菌后待温度逐渐下降到60以下时才能开箱门，以免器皿因突然冷缩而破碎。镊子、剪刀、解剖刀、接种针等金属制品，使用前和使用过程中均必须灭菌并保持无菌状态。使用前的灭菌可采用干热灭菌。使用过程中的灭菌通常是将其浸泡在70%的酒精中，再以火焰将酒精烧去，待冷却后使用。也可使用一种小型电热石英砂灭菌器，代替酒

26、精灯，每次使用完后，将用具插入消毒器的中消毒，用时取出冷却。4. 外植体灭菌a. 选取生长正常、无病虫危害的组织材料，除去多余部分后将材料整理成适当的大小放入烧杯中。特别不洁的材料则应先行用自来水冲洗。b. 用7075的乙醇处理材料0.51 min.，立即除去乙醇。c. 然后在烧杯中加入消毒剂（建议使用次氯酸钠或饱和漂白粉溶液），同时滴12滴土温20。，将烧杯置于摇床上振荡1015min。如果材料污染较严重或组织较老，可适当考虑延长灭菌时间。d. 将烧杯置于净化工作台上，弃去消毒液，用无菌水清洗34次，每次1min。e. 灭菌后的材料可置于垫有无菌纸的培养皿中备用。需要注意的是，灭菌后的材料应

27、立即接种培养，否则会造成二次感染，同时对于茎芽、花等组织材料，灭菌后若不立即接种培养，即会影响其生活力而使培养失败。从灭菌处理完成后进入净化工作台操作开始，操作人员必需严格按无菌操作规则完成以后的步骤，否则会造成外植体污染。愈伤组织诱导及器官发生 1. 愈伤组织诱导1.1 实验材料：烟草无菌苗叶片1.2. 诱导培养基：ms附加naa2.0mg/l，ba2.0mg/l，蔗糖20g/l，琼脂6-7g/l，ph调整至5.8。1.3. 设备及工具：超净工作台；不锈钢镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯等；75%酒精。1.4 接种操作方法用75%乙醇将净化工作台擦洗干净，将接种所用的材料、工具、培养基等准备好放入

28、工作台。打开紫外灯和风机至少15分钟后开始操作。a. 在自来水管下将手洗净，然后用75%酒精将手消毒，再进入超净工作台开始接种操作。b. 关闭紫外灯，点燃酒精灯，将镊子、解剖刀在酒精灯下烤干。c. 取一无菌培养皿，然后用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于无菌培养皿中，并用锋利解剖刀将叶片切成2mm2左右的小片，然后将其接种于准备好的培养基上，一般每瓶接种4-5小片。d. 快速封好瓶口，用记号笔写上姓名和接种日期。e. 接种后的三角瓶置于24条件下，黑暗培养一周，然后在同样温度下分为光照和黑暗培养直至愈伤组织形成。注意外植体切割时，动作要快，否则会造成失水而影响生长。为防止操作时失水也可在培养皿中

29、滴几滴无菌水，然后将无菌苗置于其中进行切割。2. 器官分化与植株再生2.1 分化培养基培养基采用ms基本培养基附加2.0mg/l ba、0.1mg/l zeatin和0.5mg/l naa。2.2 实验材料实验一诱导的两种类型愈伤组织。2.3 操作步骤a. 观察并详细记载实验一的培养结果，比较光照和黑暗条件下形成的愈伤组织状态的差异，根据理论课学习内容，分析其原因，理解培养条件下光照的调控作用。b. 按照实验一的无菌操作程序，将愈伤组织转入新配制的分化培养基上，置于连续光照或16h/d光照，温度2022条件下培养34周。c. 培养34周后，调查芽分化情况，统计愈伤组织分化率、每个愈伤组织形成的

30、芽数，比较不同光照下形成的愈伤组织对芽分化的影响。体细胞胚诱导 1. 实验材料: 胡萝卜种子。2. 培养基2.1 胚性愈伤组织诱导培养基ms无机盐附加：烟酸0.05mgl-1、vb6和vb1各0.01mgl-1、甘氨酸3mgl-1、肌醇100mgl-1、激动素0.2mgl-1、2,4d 0.1mgl-1、蔗糖20gl-1、琼脂25gl-1，ph5.8。2.2 体细胞胚形成培养基ms无机盐附加：烟酸0.05mgl-1、vb6和vb1各0.01mgl-1、甘氨酸3mgl-1、肌醇100mgl-1、激动素0.2mgl-1、蔗糖20gl-1，ph5.8。3. 实验过程a. 烟草种子以10次氯酸钙溶液表

31、面消毒15min，用无菌蒸馏水洗3次，置于培养皿内无菌的湿润滤纸上，在25下于暗处萌发；b. 取7日龄幼苗切取下胚轴部位长1cm，单个地置于胚性愈伤组织诱导培养基上，接种好的材料置于25温度下黑暗培养4-6周；c. 将愈伤组织小块转移到与原来成分相同的新鲜培养基上，一半置于于25下照光培养，另一半继续在黑暗条件下培养，若以类似方式每4周继代1次，可对组织进行繁殖；d. 诱导体细胞胚胎发生：将在光照下继代培养的愈伤组织块转移到不含2,4d的培养基中培养，34周后，将出现大量的各处在不同的发育阶段的体细胞胚。e. 观察体细胞胚的发育过程，统计每个愈伤组织形成的体细胞胚数，统计不同发育时期的体细胞胚

32、占胚总数的比例，分析培养中体细胞胚形成的时间、控制其一致性可能采取得调控措施。细胞悬浮系的建立与种细胞筛选 1. 细胞悬浮系的建立1.1 实验材料胡萝卜上胚轴经黑暗培养形成的愈伤组织（可与体细胞胚诱导实验同时培养）。1. 2 培养基ms无机盐附加：烟酸0.05mg/l、vb6和vb1各0.01mg/l、甘氨酸3mg/l、肌醇100mg/l、激动素0.2mg/l、2,4-d 0.1mg/l、蔗糖20g/l，ph5.8。1.3 实验操作a. 按照培养基配方配制液体培养基，分装于200ml三角瓶中，每瓶30-50ml培养基，灭菌待用；b. 在净化工作台上，将复合要求的松散愈伤组织用细胞铲接种于含有培

33、养基地三角瓶中。接种量大约为培养基体积的十分之一；c. 接种后的三角瓶置于摇床上，在转速100rpm，25下光照培养；d. 每隔4周将悬浮培养物继代1次，方法是把5ml培养物转移到50ml新鲜培养基中（1:10），如果有大的细胞块，则在继代时先用一细胞筛过滤除去过大的细胞块，在进行接种。2. 种细胞的筛选种细胞的筛选是为细胞次生产物生产提供高产细胞系的中间环节，为了获得高效一致的细胞产量和产物产量，根据不同的植物和产物类型，有不同的筛选方法。其基本操作是单细胞平板培养。a. 将细胞悬浮系在上述培养基和培养条件下，每隔7天继代一次，每次按细胞悬液与新鲜培养基1:5的比例接种；b. 将新鲜配制的琼

34、脂培养基在未凝固前，与处于对数生长期的细胞悬浮液按4:1混合后，平铺在培养皿中，操作时特别注意温度不能过高，以免给细胞造成伤害。如果悬浮系中的有过大的细胞团，需过滤除去大的细胞团。c. 在细胞分裂形成可见的小愈伤组织时，将单个细胞的愈伤组织分别接种在平板培养基上单独培养，由每个细胞形成的愈伤组织即为一个细胞系（clone）。d. 待愈伤组织长至能检测成分的大小时，取每个愈伤组织的一半用于成分分析，另一半继续培养。成分分析完成后，淘汰不符合要求的愈伤组织，对复合要求的愈伤组织扩大繁殖。原生质体分离与体细胞杂交 1. 原生质体分离1.1 实验材料: 烟草无菌苗叶片，烟草悬浮细胞系。1.2 实验操作

35、a. 取生长3周的烟草无菌苗平展嫩叶，置于含有一薄层600mmol/l甘露醇-cpw溶液中，置于4黑暗下预处理6-8小时；b. 用吸管吸去预处理液，然后加入用cpw盐溶液配制，经过过滤灭菌的含有2纤维素酶、0.4离析酶、600mmol/l甘露醇的酶溶液，用封口膜将培养皿封严，置于暗处在2426下保温酶解1618h；c. 在倒置显微镜下观察，叶片细胞壁已降解，有圆球形原生质体释放到溶液中，即终止酶解。用吸管轻轻压挤叶片，以释放出全部原生质体；d. 通过一个6080m的细胞筛过滤以除去较大的碎屑。滤液置于1个螺帽离心管中，在100g下离心3min，使原生质体沉降；e. 弃取上清夜，将沉降物缓慢加入

36、含有cpw配制的860mmol/l蔗糖溶液的螺帽离心管中，在在100g下离心10min；f. 将蔗糖溶液的顶部绿色原生质体带收集起来，并转入到另一个离心管中。在离心管中加入原生质体培养基以使原生质体悬浮，在100g下离心3min，重复本相清洗过程至少3次；g. 最后一次清洗之后，加入培养基调整原生质体密度至0.5×105到1×105/ml。将原生质体按讲授的方法培养。附cpw配方：kno3101mg/lmgso4·7h2o246mg/lkh2po427.2mg/lki0.16mg/lcuso4·5h2o0.025mg/lcacl2·2h2o1.

37、48mg/l2. 原生质体密度测定原生质体密度测定一般用血球计数板。2.1 血球记数板的构造记数板是1块特制的厚载玻片，上面有4条与玻片长边垂直的槽，每2个槽之间构成1个平台，故共有3个平台。其中两侧平台比中间平台高0.1mm，中间平台较宽，又有1条与玻片长边平行的短槽将其一分为二，在每一半上各刻有1个记数室，每个记数室划分为9个大方格，每个大方格面积为1mm×1mm，深度为0.1mm，盖上盖玻片后容积为1 mm3（即0.1l或10-4ml）。中央的大方格又用双线划分为25个中方格。每个中方格又用单划线划分为16个小方格，共计400个小方格，原生质体记数即可在中央的大方格内进行。2.2 记数方法a. 首先在显微镜下检查记数板上的记数室是否干净，若沾有污物，须用酒精棉轻轻擦洗，用蒸馏水冲静，再用吸水纸吸干；b. 将盖玻片盖在记数室上面；c. 将悬浮培养基中的原生质体悬浮液滴在盖玻片一侧边缘，使它沿着盖玻片和记数板间的缝隙渗入记数室，直到充满记数室为止；d. 记数时要使显微镜栽物台保持水平，不能倾斜。依次逐个记数中央大方格内25个中方格里的原生质体，然后根据下式求出每毫升中的原生质体数： 1ml悬浮液中的原生质体数=1个大方格悬浮液（0.1 mm3，即0.1l）中的原生质体数&