863课题申请书抗肿瘤反义核酸药物

1、 国家高技术研究发展计划（863计划）课题申请书 领域名称： 生物和现代农业技术 主题（重大专项）名称： 生物工程技术 所属专题名称： 新型生物技术药物和疫苗的研究 课题名称： 抗肿瘤反义核酸药物“癌泰得”的临床前研究 申 请 人： 申请人单位： 通讯地址： 邮 编： 联系电话： 传真： 电子邮箱： 中华人民共和国科学技术部二一年 九 月 二十 日填 写 要 求一、 请严格按表中要求填写各项；二、 对于第一部分中的多选栏目，采用在所选项编号上划勾的方式确定；三、 申请书文本中外文名词第一次出现时，要写清全称和缩写，再出现同一词时可以使用缩写；四、 申请书文本采用a4幅面纸，可以自行以同样幅面纸

2、复制，填写内容需打印填入,对于篇幅不够的栏目可自行加页；五、 专利查新结论及其他附件需与本申请书装订成一册,一并报送；六、 表中单位性质、所在地区和所属部门代码请查阅863计划网站 ()：863计划课题信息有关代码对照表。一、 基本信息课题申请人情况姓名性别01.男02.女出生年月文化程度01.研究生 02.大本03.大专 04.大专以下职称01. 高级职称 02.中级职称03.初级职称 04.无职称联系电话e-mail课题申请单位名称通讯地址邮编单位性质事业型研究单位代码aa参加单位总数2所在地区（省、自治区、直辖市、计划单列市）代码所属部门（国务院各部、委、局及其机构）代码其它主要联合申请

3、单位单位名称参加形式1.合作 2.协作单位性质（同上）课题活动类型01.应用基础研究 02.应用技术开发 03.试验发展 04.软科学成果提供形式01.发明专利 02.新产品（或农业新品种） 03.新装置 04.新材料 05.新工艺（或新方法、新模式）06.计算机软件 07.技术标准08.论文论著09.其它总经费概算 800.00 万元拟申请863计划资助（万元）400.00 万元其他经费来源（万元）（请将提供经费方出据的同意提供经费的证明，作为其他附件附后。）科技部其他科技计划资助国家其他资助(包括部门匹配)地方政府匹配银行贷款自有资金其它资金 (风险投资)400.00 万元合 计800.0

4、0 万元预计完成年限2004.12申报日期2001.10.所在单位 合计： 13.5 人年在课题中职务（组长、副组长或成员）及分担的任务组长：课题设计及组织实施副组长：临床前动物试验反义核酸合成纯化工艺及制剂质控标准（生物质谱）质量标准（hplc、ce）药代动力学实验一般毒理学试验三致试验药效学研究申报临床试验资料撰写活性测定方法的建立为本课题工作时间（人年）0.80.50.50.40.40.40.30.30.30.20.20.2专 业肿瘤生物学药理毒理学药物分析药物化学药物分析药物分析药理学药理学药理学药理学生物化学分子生物学职务/职称副 研副 研博 士助 研助 研助 研副 研博 士助 研助

5、 研助 研副 研二、课题组主要研究人员情况出生年月性别姓 名序号1234567891011121课题组长、副组长资历情况(从事过的主要研究任务及所负责任和作用，研究成果和获发明专利情况，在国内外主要刊物上发表论文情况。)课题组长: 肿瘤生物学专业，副研究员1995年开始端粒酶的研究，主要研究端粒酶的纯化、活性及rna检测。1997年开始进行端粒酶与肿瘤基因调控关系、反义寡核苷酸及合成药物抑制端粒酶活性等研究。在国内率先建立了端粒酶活性测定技术。1998年应邀在第17届国际癌症大会上宣读有关端粒酶rna反义核酸的论文。曾先后两次在德国从事反义寡核苷酸抑制端粒酶活性的研究工作。从事过的主要研究任务

6、及所负责任和作用:(1)，国家自然科学基金题（1994）, 课题负责人。(2)国家自然科学基金题(1997)，课题负责人。(3)，国家自然科学基金题（1998），课题负责人.(4)省自然科学基金题1997，课题负责人。(5)省医药卫生优秀青年人才基金题(1999)，课题负责人。研究成果和发明专利:获1994年省科技进步奖三等奖大学优秀青年科技工作者(1995年)国内外刊物发表文章: 副组长:，药理毒理学专业，副研究员1994年毕业后开始从事新药的临床前评价，主要从事生物技术药物的药效学、毒理学和药代动力学研究。从事过的主要研究任务及所负责任和作用:(1) 国家863项目参与其 中临床前评价工作

7、。(2）国家自然科学基金题负责其中临床前安全评价 和筛选工作。(3) 近8年与本单位和院外单位合作先后完成重组细胞因子、基因治疗制剂和一些化 学药品共40余项的临床前安全性评价试验，业务骨干或作为负责人。(4)负责一项分题“高通量抗辐射药物 筛选”。(5)课题负责人。研究成果和发明专利:(国内外刊物发表文章:(1)二、 课题情况三、1主要研究内容、拟解决的技术难点，以及预期达到的目标、主要技术指标和水平 主要研究内容 3年来在国家自然科学基金、国家“863”及多项基金资助下进行针对端粒酶催化亚单位（hest2）的反义寡核苷酸抗肿瘤研究。通过设计、合成、修饰和筛选得到一条抗肿瘤活性最佳的序列，对

8、裸鼠人移植性肿瘤的最大抑瘤率达89.9%，被命名为“癌泰得”。本课题目的在于对“癌泰得”临床前研究中的中试生产、药理毒理学等进行研究，从而开发出国内第一个具有抗肿瘤活性的新型反义类药物。(1) “癌泰得”的药学研究l 中试研究：生产工艺研究产品质量, 三批中试产品制造，检定规程，制剂，初步稳定性试验l 药学其它：序列测定，生产用原料质控，标准品制备和检定，处方确定(2) “癌泰得”的临床前药理学和毒理学研究l 药理学研究：主要药效学，一般药理学试验，药代动力学试验l 毒理学研究：单次给药和重复给药毒性试验，特殊毒理和免疫毒性试验(3) “癌泰得”申报临床试验l 三批中试产品送检l 撰写申报临床

9、试验的文件并申报拟解决的关键技术难点(1) 中试生产的规模。目前我们已有克级的dna合成仪，临床试验时要求达公斤级 的dna合成仪，如oligo process system，届时将由合作的公司购买。(2) 在临床前药代动力学研究中血液和组织中反义寡核苷酸原型药的检测及方法的灵 敏度能否达到要求。预期达到的目标 按i类新生物制品要求完成临床前所有工作并获得临床试验的批文。主要技术指标和水平l 中试生产规模达10克/批以上（临床试验前达到500g-1000g/天）平均缩合率大于98.5%，产品纯度大于95，回收率80%以上。满足临床前研究的要求。l 主要药效学试验中，依给药剂量和给药持续时间，抑

10、瘤率在40%-70。l 药代动力学试验中，原型药和代谢产物检测方法的灵敏度能检出3-5个半衰期后的血药浓度，检出相差1个碱基的代谢产物。l 毒理学试验中，端粒酶的反义寡核苷酸的安全剂量应高于药效学有效剂量，毒性限制剂量应在药效学有效剂量的10倍以上。2预期可获得的发明专利等知识产权情况获利发明专利12项。3课题主要研究技术内容的国内外发展现状与趋势，国内现有技术基础，以及与课题有关的技术领域的国内外专利申请和授权情况（附有关专利查新结论）(1) 国内外发展现状与趋势及国内现有技术基础:反义药物可在基因水平特异性阻断特定基因的表达，因此被认为是一种很有希望的高选择性和高效率的潜在疾病治疗药物。随

11、着功能基因组学的深入研究，将会有越来越多的疾病相关基因及药物作用靶标被发现。反义核酸作为以基因为药靶的新一代药物将发挥更大优势。目前利用反义核酸作为药物和基因功能研究的文献呈爆发式增加的趋势。目前已有一种反义核酸在美国上市，另有16种反义核酸药物在进行临床实验。国内在该领域也做了大量的研究工作，但没有一个反义药物进入临床试验阶段，有待于在靶标的选择和合成规模等方面取得重大突破。随着人类基因组计划的深入，特别是后基因组计划的实施，将会有越来越多的疾病相关基因及药物作用靶标被发现。反义核酸作为基因为靶的新一代药物将会发挥其更大的优势。端粒(telomere)是真核细胞染色体末端一段重复dna序列，

12、其功能是保持染色体的稳定性。端粒dna的长短和稳定性决定了细胞寿命，并与细胞的癌变密切相关。端粒酶是由一条单链rna(htr)和一些蛋白质亚单位组成的核糖核蛋白复合物。研究结果表明，恶性肿瘤端粒酶阳性率为85-90%；正常组织除胚细胞和造血细胞外，无端粒酶活性，癌旁组织端粒酶阳性率为6%；良性瘤和癌前病变组织端粒酶阳性率为14%。这表明端粒酶在癌细胞的形成和增殖中起着重要的作用。端粒酶作为恶性肿瘤标志物愈来愈被人们所接受。研究表明端粒酶的抑制可引起肿瘤细胞凋亡或诱导其分化, 抑制端粒酶的活性有可能抑制癌细胞的生长，从而达到治疗癌症的目的。因而端粒酶被认为是潜在的肿瘤治疗新靶点。国外有人针对端粒

13、酶rna部分设计了一种锤头型核酶，在体外可以切割端粒酶rna，抑制端粒酶活性。norton等针对端粒酶rna模板区设计合成了不同长度的硫代反义寡核苷酸(s-asodn)和肽核酸(pna)对恶性肿瘤细胞提取物中的端粒酶和细胞内的端粒酶均有不同程度的抑制作用。feng等构建了反义 htr表达载体，转染hela细胞，经过23-26代，细胞端粒缩短，细胞开始死亡。mata等使用6个碱基硫代反义寡核苷酸（ttaggg）抑制burkitt 淋巴细胞体外生长和接种裸鼠的肿瘤生长均取了较好的结果。(2) 与课题有关的技术领域的国内外专利申请及授权情况（附有关专利查新结论）: 有关端粒酶具有逆转录酶活性蛋白亚基

14、及其反义药物的抗肿瘤研究国内外均有专利申请，其中国内专利属于课题组前期工作，国外专利也有一项属于本课题组的工作。4课题拟采取的研究方法（或技术路线、实施方案）及其可行性和风险分析研究方法:(1) “癌泰得”的中试研究l 生产工艺的研究：采用固相“流过式”自动法合成，离子交换反相法纯化产品。l 中试产品质量研究和活性测定方法建立：采用毛细管电泳检测产品纯度，结构采用质谱法，定量采用hplc法，活性采用体外端粒酶活性测定法。l 中试产品生产和检定规程草案。l 三批中试产品的初步稳定性试验和制剂处方的研究。l 三批中试品的送检。l 端粒酶反义寡核苷酸序列的确证：采用生物质谱法。(2) “癌泰得”的临

15、床前药理学和毒理学研究l 主要药效学研究：在体外进行抗瘤谱的筛选。再进行敏感瘤株的体外和体内（裸鼠）抗瘤试验。至少重复三次。严格设置阳性对照药。l 一般药理学试验：在安全剂量范围内观察端粒酶反义寡核苷酸对精神、心血管系统和呼吸系统的影响。l 药代动力学研究：观察反义序列的组织器官分布、测定药代动力学参数（vc、t1/2 和cls等）和代谢转化。采用固相提取法、毛细管凝胶电泳、荧光标记和质谱分析相结合方法检测。l 毒理学试验。观察单次给药和重复给药后在动物的潜在毒性和毒性靶器官。(3) 撰写申报“癌泰得”临床试验的资料，申报临床试验。可行性分析和风险分析:(1) 技术及条件的可行性：课题组成员已

16、掌握反义寡核苷酸的合成、化学修饰、纯化及端粒酶活性检测等方面技术。在临床前评价方面，课题组成员从事生物技术药物临床前评价已有多年，建立了较为完整的生物技术药物临床前评价的实验技术和方法，同时有较多的有关反义核酸药物临床前评价的国外文献资料可供借鉴。因此从技术上完成本课题的工作是可行的。(2) 工作基础：前期工作包括合成方法研究、三批小试合成和纯化、质量检验、ld50、药效学试验和采用荧光标记结合ce测定反义寡核苷酸的浓度等。结果表明，我们所设计和合成的“癌泰得”毒性小（ld50大于1g/kg），对肝癌(hepg2)、肺癌(glc)、脑胶质瘤(bt325)、胃癌(bgc823)及乳腺癌(mcf-

17、7)细胞均有不同程度的抑制作用，具有明显的抗裸鼠移植性肿瘤生长作用。因此，预计通过对端粒酶反义寡核苷酸进行系统的临床前研究最终能进入临床试验。(3) 风险分析：本课题的难点在于中试生产和临床前药代动力学方法学的研究。反义寡核苷酸可采用自动化dna合成仪合成，目前国外有10g-500g/批合成规模的商业化仪器。由于采用自动化合成，因此能满足临床前的中试生产规模要求。在药代动力学方法学研究方面，有基因重组产品的药代动力学研究的丰富经验，近年我们对反义核酸的检测方法进行了探索，采用荧光标记方法，结合毛细管凝胶电泳法可达到定量检测的要求。因此要达到本课题目标的风险较小。5预期研究成果应用转化的前景预测

18、及分析（包括国内外应用或市场现状、潜在用户、市场前景及风险预测, 经济效益和社会作用、影响分析等）国内外应用或市场现状：目前已有16种反义寡核苷酸药物进入临床试验，包括针对感染性疾病、癌症及炎症的反义寡核苷酸，有1种药物获得fda批准进入市场。反义药物在临床前实验及临床试验中取得了喜人的结果，进一步促进了反义技术的发展。但目前无针对端粒酶的反义药物进入临床试验。潜在用户及市场前景及风险预测：本课题的研究成果，获利新药临床试验的批文。目前国内尚无反义类药物进入临床试验。由于国外反义药物试验结果较好，陆续有反义药物进入临床试验，反义药物逐渐受到国内外重视。我们研究的针对端粒酶的反义药物，药靶明确及

19、特异，试验结果发现具有较强的抗肿瘤活性。目前已有企业合作，愿共同出资开发这一新药。药物治疗是恶性肿瘤的主要治疗方法之一。但目前市场上缺少针对特定靶分子、效果较为理想的抗肿瘤药物，尤其是对实体瘤和耐药肿瘤的有效的药物。因此，本课题最终成果应具有较好的市场前景。由于本课题具有较好的先期工作基础，表明其质量可控和有效，参照国外经验，我们认为达到本课题目标的风险较小。经济效益和社会作用、影响分析等：肿瘤是目前威胁人类健康的最重要疾病之一，是人类健康和生命的头号杀手，发病率居10 种重大疾病的第二位，而且随着各种因素的影响其发病率依然呈上升趋势。据报导目前欧美每年诊断出的癌症新患者达250万。我国每年死

20、于癌症的患者超过80万。据专家预测世界抗癌药物的市场年递增13。从上述完全统计的数字可以看出研究和开发抗癌药物，特别是新型抗癌药物有仅具有非常重要的社会效益，而且其经济效益也是其它药物所无法比拟的。根据目前我国抗肿瘤生物制品的市场情况保守估计，该项目最终上市投产后平均年利润应超过5亿元人民币。6课题现有工作基础与申请单位承诺提供的支撑条件，其他所需增添的支撑条件和主要仪器设备（说明用途）工作基础：(1) 药学初步研究l 已进行了三批小规模“癌泰得”的合成、纯化及质量控制方法的研究。利用本室的dna合成仪合成了三批“癌泰得”，平均缩合率达98.5±0.5%。采用阴离子加反相柱层析法纯化

21、了三批合成硫代“癌泰得”，平均回收率85.0±2.0%。，用阴离子交换hplc和毛细胞管凝胶电泳方法对硫代hest212进行定性分析和质量控制，可分辨n-1及非硫代“癌泰得”。l 针对人端粒酶具有逆转录酶活性蛋白质亚基（hest2）的反义寡核苷酸的靶位筛选和序列长度的优化。根据序列和rna二级结构特征，利用相应软件设计和合成了20条硫代反义寡核苷酸，观察在体外和体内的抗肿瘤活性。其中一条序列“癌泰得”抑瘤率达89.9%，申请了中国和国际专利。国内专利公开号为cn1253179a，国际专利号为pct/cn99/00173。(2) 临床前药理毒理学初步研究l “癌泰得”作用的序列特异性分

22、析。通过合成正义、随机（碱基组成相同）及错配的序列（gc含量相同）及硫代修饰，在体外观察到“癌泰得”（0.2、0.4和0.8mmol/l）抑制肿瘤细胞生长（hepg2）最高达65.0%，表明“癌泰得”的序列作用特异性。l “癌泰得”抗瘤谱和作用时间的研究。在体外观察到“癌泰得”对胃癌细胞（bgc-823）作用最强（ec50为0.25mmol/l），对肝癌、肺癌和乳腺癌的作用强度中等。连续作用4天，“癌泰得”的体外抗瘤活性达峰值。l “癌泰得”对裸鼠肝移植瘤抗癌活性的研究。腹腔注射10天“癌泰得”12.5 mg/kg、25 mg/kg和50mg/kg，抑瘤率分别为29.4%、 47.9%和52.

23、7%。静脉注射25mg/kg抑瘤率为49.3%。其中连续腹腔注射“癌泰得”（6.2 mg/kg、12.5 mg/kg和25mg/kg）30天，最大抑瘤率达80以上。l 单次给药毒性试验。结果发现“癌泰得”在雌性小鼠的ld50为1173.9 mg/kg，雄性小鼠的ld50为1098.8mg/kg。提供的支撑条件l 人员: 具有多学科长期从事反义核酸、细胞生物学、药理学、药物分析及临床前安全性评价等的专门人才参与本课题研究。大多数是具有博士或硕士学位的年轻人且在各自的研究领域有一定的工作经验。l 已有的仪器设备: akta oligopilot(amersham-pharmacia,14万usd)

24、及390z(abd公司，11.7万usd)大规模dna合成仪2台，用于组合寡核苷酸库、体内外活性实验用反义寡核苷酸的合成。3900高通量(48柱，abd公司，13.0万usd)、单柱(abd,2.0万usd)和双柱(abd,3.0万usd)小规模dna合成仪共3台，用于体外筛选和优化用多个小规模反义寡核苷酸的合成。制备和分析型高效液相色谱仪各1台(waters,10.0万usd)，用于寡核苷酸的纯化和分析。毛细管电泳仪(backman,mdq，6万usd)，用于寡核苷酸质量分析。还有自动基因序列分析仪、g计数仪、全自动生化分析仪、全自动细胞计数仪、显微自动成像仪、组织切片机和八道生理分析仪等。

25、尚缺仪器设备 从事该研究无需购置任何大型仪器和设备。7合作单位任务分工反义核酸合成和组织申报临床试验。四、审核意见1申请人所在单位意见 本项目符合863招标指南的各项要求，项目科学性强，研究方案可行，具有良好的开发和应用前景。经本单位审查，同意上报。如获得资助，本单位将在人力、财力和设备方面给予优先支持。 签 章 二00 年 九 月 二十五 日2联合申请单位意见联合申请单位（一） 签 章 二00 年 月 日联合申请单位（二） 签 章 二00 年 月 日联合申请单位（三） 签 章 二00 年 月 日附件：有关专利查新结论 通过检索中国生物医学文献数据库、medline数据库、中国专利数据库和es

26、pcenet世界专利数据库，有关端粒酶具有逆转录酶活性蛋白亚基及其的反义药物的抗肿瘤研究国内外均有文献报道，其中国内部分报道属于本课题组（国内文献（1）（6），并为首先开展研究；有关专利国内外均有报道，其中国内专利属于本课题组（专利文献1），国外专利中（专利文献2）也有一项属于本课题组。其他附件（1）科技查新项目报告书。（2）国内发明专利申请公开说明书。（3）申请专利合作条约请求书（4）抗肿瘤基因反义药物“癌泰得”合作研究与开发合同。登记序号： 项目编号：中医药、中西医结合科研项目课题设计书课题名称：痛痹颗粒对骨关节炎细胞凋亡和增殖的机理研究申报单位： 江苏省中医院课题负责人： 朱萱萱计划年限

27、：邮政编码： 210029 联系电话： 8661714130306申报日期：江苏省中医药局制填写提纲一、立项依据：与选题直接相关的国内外现状、水平和发展趋势；选题的理论和实践依据；研究目的、意义；本研究达到的科学技术水平，预期社会经济效益和应用推广前景。二、科研假说或技术构思，主要研究内容、关键技术、目标（达到的主要技术指标或技术经济指标），技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。三、研究试验方法及技术路线（工艺路线）。四、现有工作条件和基础：开展本项研究的技术优势，现有的主要仪器设备及应用合格实验动物的基本条件等；已有工作基础，预试验情况。五、计划进度：根据总的研究期限、年度计划进度，分

28、别列出具体的目标和进度的考核指标。六、参加（协作）单位意见及具体分工（附协议书）。七、经费概算（包括其他部门的拨款、贷款、自筹记忆取得的自主）和核算依据，以及分年度使用计划。填写说明一、内容填写自备附页，用纸大小和封页一致，字迹清楚，装订整齐后按申报要求上报。二、填写提纲所列内容，要全面详细、如实填写。三、封面上“登记序号”“项目编号”请勿填写。1、 立项依据1.1 研究目的、意义骨关节炎（osteoarthritis，oa）又称退行性关节病，以关节软骨发生弥漫性龟裂、纤维化和脱失及因骨组织增生性变化为特征的一组临床征候群，是多见于中年以后的慢性进行性关节疾患。该病发病率随年龄增长而升高，据调

29、查，在美国目前2亿多人口中，就有骨关节炎4500万，发病率占总人口的20%，在老年人中所占比例更高，50岁以上人群中，oa的患病率仅次于心血管疾病，位居第二位。在我国，根据流行病学调查显示，5564岁的人群中发病率达40%，而65岁以上人群的患病率达60%90%。随着计划生育政策的长久实施及经济发展，我国已进入老龄化社会，oa的发病率还将越来越高，这不仅严重危害人民的生活、健康，对社会也将造成很大负担。同时世界其他国家也面临着同样的问题，因而oa引起了国际、国内医学界的相当重视。近年来对oa的研究颇多，在发病机制、检测手段以及治疗方法上均取得较大进步，但总的来说还缺乏令人满意的突破性进展。西药

30、治疗oa的主要手段是非甾体药，但存在副作用大、作用单一及有较多禁忌症等缺点。虽然中药治疗oa也取得了一些经验，但对其具体的作用机制有深入研究的却很少，因此在中医理论的指导下，运用现代科学技术，对疗效确切的中药复方进行深入的机理研究，使中药治疗oa的疗效在国际先进行列中占一席之地，是摆在我们面前非常重要的课题。1.2 国内外现状水平和发展趋势近十年来，国内外对oa进行了较深入地研究，大致归纳如下：1.2.1 流行病学研究已广泛开展在近100种不同类型的关节疾病中，oa是影响人类健康最常见的关节疾患之一，没有明显的种族和地域差异，本病的患病率随年龄增加而增高，故随着人类平均寿命的延长，患病率也有增

31、高的趋势。felson等报道70岁以下人群膝oa患病率为7%（男6.4%，女11.4%），80岁以上为11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射学膝oa70岁以上为27.4%（男30.4%，女25.1%），80岁以上为43.7%。butter等报道，44岁以下、4559岁、60岁以上人群中，放射血oa 患病率各为6.2%、21.6%和42.0%。国内陈顺乐等队13541名钢铁工人的调查结果显示，症状性oa患病率2.2%；无症状性oa患病率53%，其中3039、4049、5059岁患病率各为11%、27%和62%。汕头大学医学院统计551例，结果40岁以下、4049、5059和60岁以上各占

32、12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同关节oa易感性不同。美国在卫生统计中心调查结果，oa患病率以手最高，以下依次为足、膝、髋。国内陈顺乐等调查结果oa是颈椎最多，以下依次为腰椎、膝、手和腕。本病性别差异在脊柱差别不大，但手、膝、髋oa均以女性较多，且女性骨关节炎的遗传易感性较男性高。在framingham的研究中，felaon等发现女性体重减少11磅，骨关节炎形成的风险相应减少50%。 saase等调查结果，膝oa患病率男、女峰值分别为24.7%和54.6%。根据1994年统计，在美国，骨关节炎的消耗为155亿美元，约为类风湿关节炎的3倍，其中一半以上消耗缘于工作丧失。在我

33、国虽未作全国大范围的普查，但随着老龄化社会进程的不断加快，oa的发病率会越来越高，这必将给家庭、社会带来沉重负担。1.2.2 病因、发病机制有了巨大突破目前基础研究认为软骨的损伤与退变是oa的根本，随着分子生物学免疫学的发展，近年来众多学者对oa关节软骨退行性改变的原因从不同角度进行了大量研究，其发病机制仍未完全明了，又提出了许多学说，如软骨下骨内高压学说：由于骨血液动力学的改变，在骨髓腔容积不变的前提下增加内容物引起压力增高，即表现为骨内压力增高。骨内高压持续增高存在下关节滑液ph值下降，成分改变，干扰并破坏了软骨细胞的正常代谢导致细胞变性坏死，胶原纤维解聚，蛋白多糖分解，软骨下骨破坏、修复

34、，最终产生骨性关节炎。自由基学说：认为自由基对软骨细胞dna和pg的合成具有抑制作用。自由基作用软骨细胞后，引发膜脂质过氧化，使脂质过氧化代谢产物丙二醛增多，丙二醛可与dna发生交联，自由基也可直接攻击软骨细胞dna即合成dna所需的酶，使dna链断裂、碱基损伤从而影响了dna的合成，也造成前列腺（pg）合成障碍。骨关节炎时，滑膜、滑液、血管翳内常有中性白细胞、巨嗜细胞浸润，其表面受免疫复合物、补体等作用能释放大量o2-和h2o2；细胞因子学说：细胞因子对骨关节炎的发生、发展起了重要作用，如白细胞介素-1（il-1）、白细胞介素-6(il-6)、肿瘤坏死因子（tnf）等在oa中水平明显增高。i

35、l-1具有刺激软骨细胞分泌一氧化氮、前列腺e和il-6的作用，引起滑膜炎症和疼痛，同时il-1也是软骨基质降解的主要驱动因子；软骨酶降解学说：oa软骨细胞的基质降解酶类的合成与分泌率明显增加，并与关节炎的严重程度密切相关。参与降解基质大分子的降解酶类可以增加达到几倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白。基质金属蛋白酶，尤其是基质溶素和胶原酶，参与关节软骨的降解过程，这些酶类可以降解细胞外基质的所有成分，与循环系统中的纤维蛋白溶酶和局部合成的纤溶酶原一起，快速降解软骨。在滑膜细胞和软骨细胞产生的il-1和tnf的作用下，软骨细胞以酶原的形式分泌大量的基质金属蛋白酶，而对金属蛋白酶组织抑制

36、剂无影响，使二者失衡从而增加对软骨主要成分型胶原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使软骨进行性破坏；一氧化氮学说：no是一种细胞间信使分子，可介导许多生物学现象。nos可催化重要炎性介质no的产生，oa患者血清、滑液中no含量明显高于正常。no可通过抑制软骨细胞增殖，促进软骨细胞凋亡，改变蛋白多糖和胶原蛋白的合成与分泌功能，同时使软骨细胞分泌透明质酸减少，滑膜粘蛋白解聚，抑制软骨细胞合成软骨基质，促进软骨细胞糖酵解，使软骨破坏。细胞凋亡学说：细胞凋亡是细胞死亡的形式之一，许多正常组织均可发现凋亡，但凋亡亢进与不足则会引起相关疾病，在骨关节炎患者软骨中软骨细胞的凋亡有异常表现，且凋亡细胞数目与骨关节炎严

37、重程度明显相关。凋亡小体存在于软骨细胞小孔或间隙内，其产生的焦磷酸盐能从溶液中沉积钙，有ntpph（nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase）和碱性磷酸酶作用,造成余下软骨细胞修复过程失败，而逐渐发展成关节软骨的完全丢失。oa软骨细胞凋亡主要通过两种相互独立的途径完成，一种是同滑膜炎症无关的途径,由no介导;另一种是同滑膜炎症相关的途径,由fas介导。典型的oa不存在明显的炎症反应,此时软骨细胞凋亡以no途径为主;当产生炎症反应时,则通过as途径加剧软骨细胞凋亡和关节破坏。no通过两种方式造成组织及细胞损伤。一是高浓度的no能抑制多种与线粒体呼吸

38、传递系统及柠檬酸循环有关的酶,从而抑制线粒体呼吸,造成组织损伤;二是no与超氧化阴离子2-反应,生成氧化亚硝基阴离子onoo-,在酸性条件下(如病理条件)迅速分解为oh-和no2自由基,这两种自由基具有很强的细胞毒性,可造成组织细胞损伤。在oa患者中,受损区软骨细胞的凋亡比例明显高于未受损区。fas表达的结果与其相符,oa受损区的fas表达远高于未受损区,提示fas表达可诱导软骨细胞凋亡。除no途径和fas途径外,还有一些因素可导致软骨细胞凋亡、关节破坏,如il-1、il-8、tnf-、pge2、aggrecan g1区等。1.2.3 治疗方面有了不少新方法目前中西医治疗oa的药物较多，西药治

39、疗oa主要有三大类，第一类为快作用药，即非甾体药，特点是发挥作用快，但副作用较大，对胃肠、肝肾、血小板均有较大影响，oa多为老年人，长期服用此类药尤其不能耐受，且部分药物价格不菲，而且由于过分的镇痛，导致病人失去警惕过分运动，以致出现“消炎痛髋”，从长期疗效来看反而不佳，最新观点认为乙酰氨基酚应作为治疗oa的首选药，但尚有一定争议，且同样存在上述副作用；第二类为慢作用药，发挥作用慢，疗效不确切，价格昂贵，临床上尚未广泛运用；第三类为软骨保护剂，尚未问世。关节清理术、膝关节置换术，适应症较少，费用高，创伤大，病人难以接受。中哦药治疗oa的研究取得了可喜的进步，但中药治疗仍存在较多共性的问题：多属

40、临床经验，无对照组，特别是西药对照组观察，处方不固定。缺乏用客观的最新的国际公认的、量化的临床观察指标及疗效判断标准为手段来寻找治疗oa的中药。未针对oa发病机制进行临床及动物试验从生化、免疫、病理、细胞分子水平来探讨中药的药物作用机理。缺乏高效的、作用综合、副作用小的新药。中医认为oa属痹症中的痹、痛痹、骨痹，认为其病因与年老体衰、长期劳损、外感风寒湿邪有关，明确指出肝肾亏虚、气血不足、筋骨失养为oa的发病基础，而寒湿、痰瘀为病理因素及病理产物。周尊谦等人在传统中医理论基础上，阐述了膝oa骨内高压血瘀证氧自由基之间的密切关系；谢林等论述了膝oa与血瘀证之间的内在联系，旨在为运用活血化淤药治疗

41、oa提供理论依据。治疗方面从古到今绝大部分医家皆针对其病因病机采用益肝肾、强筋骨、补气血治其本；散寒通络、化痰胜湿治其标。独活寄生汤是用于治疗风寒湿痹、关节疼痛和脑血管后遗症的传统固防，具有补肝肾、活血通络之功，临床常见本方加减治疗oa，疗效比较肯定。朱健儿以本方加味治疗262例，总有效率94.7%。单文龙等用本方加减治疗骨关节炎24例，有效率为87.5%。陆智报道用本方加减治疗104例，总有效率91.3%。1.2.4 实验研究方面有了较大的进展随着对oa发病机理的不断深入认识，对oa的实验研究方面也开始了向多层次多角度的方向发展。动物实验不再只局限于微循环和一般抗炎、镇痛试验，现已使用针对o

42、a的动物实验，并采用相关的指标进行检测。目前实验研究内容主要有以下几个方面，研究最多的是oa的血液流变学、氧自由基及一氧化氮含量等，这些试验一般均可通过建立骨关节炎的模型来完成，也可通过使用其它相似的模型检测相关指标来进行，如可建立急性血淤模型来检查血液流变学指标，使用老龄动物通过检测体内sod及mda含量推断药物的抗氧自由基的能力等。在no对oa影响的实验中，一般采用硝酸还原酶法来测定no含量，运用pt-pcr技术测定nos基因表达。il-1、il-6、tnf等细胞因子、软骨降解酶尤其是基质金属蛋白酶、诱导关节滑膜炎症的物质如纤溶酶原/纤溶酶原激活物和前列腺素pge2、软骨细胞的细胞凋亡及增

43、殖情况、性激素水平等也越来越多地被作为检测指标使用到实验研究中来。1.3 选题的理论和实践依据祖国医学并无骨关节炎的病名，从历代文献来看本病应归属于“骨痹”、“痛痹”范畴。我们认为oa病人除了肝肾亏虚，寒湿痹阻外，一般oa病人体重超重较多，也即为痰湿偏盛之体，另外脾虚生湿及寒湿痹阻日久湿聚成痰，痰淤交阻是引起膝关节肿胀畸形、活动受限的重要因素，所谓顽症怪病皆质之于痰淤。基于现代医学对oa发病机理的深入研究，我们在补益肝肾、活血通络基础上，结合中药对缓解软骨降解，增加软骨细胞功能，抑制滑膜增生及炎症的研究成果，于1995年即对备急千金要方中的独活寄生汤进行化裁，重用活血化淤，加用化痰清热之品，总

44、结制定出了高效、药源广泛、安全可行的痛痹颗粒，并于1999年采用痛痹颗粒的组方治疗膝oa，方中以独活为君药，以祛下焦与筋骨间风寒湿邪；威灵仙舒筋通络止痹痛；淫羊藿、怀牛膝补肝肾，强筋骨，通经络，其中怀牛膝为引经药；当归养血柔肝、舒筋活血；川芎则通达四肢关节，为血中气药；虎杖活血清热解毒，同时防诸药辛燥太过。诸药合用共起补肝肾、祛风湿、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保护软骨。通过36例的临床研究、观察，结果表明本方疗效显著且副作用小。因此有必要对痛痹颗粒治疗骨性关节炎的作用机制尤其是该方对软骨细胞的细胞凋亡与增殖机理做进一步的研究，冀能证实痛痹颗粒的临床疗效，明确其作用机制，并初步探讨本病发病的可能

45、机理，为新药问世提供客观的依据，所以进行设计并立题。1.4本研究达到的科学技术水平，预期社会效益和应用推广前景1.4.1继承和发扬祖国医学，保持中医特色，以临床疗效为前提，以实验研究为基础，制造规范化大鼠的膝oa模型，从发病机理探讨本药的作用机制。本实验采用可靠地国际公认的方法复制动物模型，并采用最新的检测指标il-1、tnf、sod、mda、no等，总之本研究基于现代医学对oa发病机制的最新研究成果，从生化、免疫等多个角度多个层次，系统观察并进行归纳总结，确保本课题不但可行而且先进，冀能填补省内外运用中药治疗oa的空白，并希望以此为基础，进一步从细胞水平（包括本药对软骨细胞及细胞凋亡与增殖的

46、影响）研究中药对oa的长久作用及影响，从而达到挤身国际先进水平的目的，让中药真正走向世界。1.4.2目前，中药治疗oa的方法颇多，但大多以临床疗效研究为主，大样本、规范化的研究很少，中医中药治疗机理的研究，虽有涉及，但大多分散且存在一定的重复性，理想的治疗药物尚未问世，具有公认疗效的小儿迁延性腹泻临床治疗方案尚未确立，其疗效评价体系尚需研究确定，尤其是缺少中医药治疗学整体研究思路与方法，使中药复方治疗oa的疗效机理尚未能全面揭示，影响了该领域研究的深入。而痛痹颗粒是在中医理论指导下选用千金要方中独活寄生汤进行加减所得，并采用可靠的实验模型及最新的国际公认的相关指标进行实验研究，观察其对oa的确

47、切疗效及作用机理，这必将对oa的中医理论产生较大影响，同时对临床治疗也起到更好的指导作用，从而产生较好的社会经济效益。随着改革开放的形势发展，以及中国加入wto与国际接轨的进程的不断完善，祖国医学国际地位不断的提高，我们将从祖国医学宝库中发掘出的治疗oa的高效药物与现代新技术、新方法进行研究总结，从而为人类造福，为振兴中医事业做出应有的贡献。2.科研假说或技术构想：主要内容、技术关键目的，技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。2.1主要内容2.1.1探讨oa的病因病机，提出新见解，发展中医理论。2.1.2运用现代科学技术，开展实验研究，从分子生物学、免疫学、生理生化学等多方面来探讨“痛痹

48、颗粒”治疗膝oa的疗效机制及药理毒理作用。2.2主要技术关键2.2.1膝oa模型的复制目前所使用的oa动物模型一般可分为两大类，其一是诱发模型，即通过各种操作方法如制动、手术、关节内注药、关节内植入软骨碎片或微粒等诱导oa产生；另一类为自发模型，即不用任何外界干预，动物自发oa，如c57黑鼠等。在选择动物模型时一般应考虑动物的种属（包括其生活习性、关节结构、组织学及病理学特征）、不同方法的造模机制和oa模型的特点，并应参照研究目的加以选择。在诱发模型中，常用的方法是手术造成关节的应力改变及关节腔内注入木瓜蛋白酶， 这两种方法都能复制出较成功较高的oa模型，且操作较为简单。具体的造模机制在于低应

49、力可以造成软骨厚度减少，so染色变淡，水分增加，蛋白聚糖聚集度损伤等变化，木瓜蛋白酶作为一种蛋白水解酶会引起关节软骨的退行性改变。在具体的造模过程中我们选用以上两种方法来分别复制动物模型。用于动物模型的动物一般有狗、兔、鼠等，我们选用大鼠做oa模型，因为该模型关节软骨退变的组织学特征与人类相似，且动物来源较广泛，且经济。2.2.2关节软骨细胞的获取和培养基于来源广泛，操作可行的原则，目前用于体外培养的软骨细胞一般均为兔关节软骨细胞原代培养所得。软骨需在严格无菌的条件下分离，经过一系列的漂洗、消化等工作后获取软骨细胞。目前还没有专门用于软骨细胞培养的培养液，国外采用的培养液种类繁多，有199、1640、f12、改良eagle等，国内的有199、1640、dmem（高糖）等，其中加入胎牛血清（占15%），一般以使用dmem