生物制药工艺学微生物药物制造工艺

1、 1.定义定义（Microbial Medicines）：）：v微生物在其生命活动过程中产生的生理活性微生物在其生命活动过程中产生的生理活性物质及其衍生物物质及其衍生物，包括抗生素，酶抑制剂，包括抗生素，酶抑制剂，免疫调节剂等一类化学物质的总称，是人类免疫调节剂等一类化学物质的总称，是人类控制感染等疾病，保障身体健康，以及用来控制感染等疾病，保障身体健康，以及用来防治动、植物病害的重要化疗药物。防治动、植物病害的重要化疗药物。抗生素：抗生素：(antibiotic(antibiotic）19421942年，年，WaksmanWaksman首先定义：首先定义： 抗生素是微生物在其代谢过程中所产生

2、的、具抗生素是微生物在其代谢过程中所产生的、具有抑制它种微生物生长及活动甚至杀灭它种微有抑制它种微生物生长及活动甚至杀灭它种微生物性能的化学物质生物性能的化学物质19471947年年19481948年年19501950年年19521952年年19531953年年195080195080，我国译为抗菌素，我国译为抗菌素19801980年后，抗肿瘤、抗寄生虫等抗生素年后，抗肿瘤、抗寄生虫等抗生素的不断发现，超出对微生物作用范围，的不断发现，超出对微生物作用范围，又改译为抗生素又改译为抗生素微生物来源的其他活性物质微生物来源的其他活性物质 酶抑制剂酶抑制剂: 亮肽素亮肽素 bestatin 免疫抑制

3、剂：环孢菌素免疫抑制剂：环孢菌素A 羟基羟基-甲基戊二酰辅酶甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂：还原酶抑制剂：v抗生素类药物抗生素类药物v维生素类药物维生素类药物v氨基酸类药物氨基酸类药物v核酸类药物核酸类药物v酶与辅酶类药物酶与辅酶类药物v酶抑制剂酶抑制剂v免疫调节剂免疫调节剂v甾体类激素甾体类激素 （P12页）页）根据抗生素的生物来源分类：（1）放线菌产生：链霉素,放线菌素（2）真菌产生：青霉素（3）细菌产生：杆菌肽（4）植物及动物产生：蒜素、黄连素根据抗生素的化学结构（1）-内酰胺类抗生素 青霉素、头孢菌素、硫霉素、亚胺培南（2）氨基糖苷类抗生素 链霉素、新霉素、卡那霉素、庆大霉素（3）大环内

4、酯类抗生素 红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素（4）四环类抗生素 四环素、金霉素、土霉素（5）多肽类抗生素 多粘菌素、放线菌素、杆菌肽（6）多烯类抗生素 两性霉素、曲古霉素、制霉菌（7）蒽环类抗生素 柔红霉素、阿霉素、正定霉素（8）苯羟基胺类抗生素 氯霉素、甲砜氯霉素（9）环桥类抗生素 利福霉素（10）其他抗生素 磷霉素、创新霉素根据抗生素的作用对象分类根据抗生素的作用对象分类 抗革兰氏阳性细菌：青霉素、红霉素 抗革兰氏阴性细菌：主要有多粘菌素 抗真菌：制霉菌素、灰黄霉素、两性霉素 抗结核分枝杆菌：链霉素、新霉素、卡那霉素 抗癌: 放线菌素D、博来霉素、阿霉素 抗病毒： 四环类抗生素、艾霉素(ehrl

5、ichin) 抗原虫的抗生素 巴龙霉素、抗滴虫霉素、蒜素根据抗生素的作用机制分类根据抗生素的作用机制分类 、抑制细菌壁合成： 青霉素 、影响细胞膜功能： 多烯类抗生素 、抑制核酸合成： 如影响DNA结构的博来霉素、丝裂霉素C及柔毛霉素等； 、抑制蛋白质合成： 四环素、氯霉素、链霉素 、抑制生物能作用： 如抑制电子转移的抗霉素(antimycin)、抑制氧化磷酸化作用的短杆菌肽S(gramicidin S)和寡霉素(o1igomycin)等。 维生素B2维生素C-胡萝卜素-胡萝卜素目前大部分氨基酸可用发酵法生产如肌苷酸，腺苷酸，肌苷，腺苷等 链激酶、链激酶、L-天冬酰胺酶天冬酰胺酶克拉维酸、洛伐

6、他汀克拉维酸、洛伐他汀1、寻找新的微生物资源 稀有放线菌 极端微生物 海洋微生物 通过 预处理的方法可以减少真菌及细菌的数量，增加放线菌的数量，如1）土样自然风干5至30天，可大大减少细菌的数量；2）风干土样在120干热处理1小时，可减少真菌、细菌的数量；3）综合处理，如用0.05的SDS（5mmol/L磷酸缓冲液配制）加1%的腐殖酸或6%的酵母膏，40 震荡20min。 一种产生antimycin的链霉菌（垂直型） 一种产生ankinomycin的链霉菌（松螺旋型）一种产生deoxylaidlomycin的链霉菌（双轮螺旋型） 链霉菌已经有过太多研究，因此淘汰常见的链霉菌，增加“稀有”或特殊

7、的链霉菌的出菌率就是一个重要问题，可采用1）从特殊环境（如酸碱性土壤、放射性地区、温泉等）采集样品；2）可在培养基中加入大剂量抗生素，如白霉素等；3）可加入特殊的碳氮源，如Vickers等曾发现棉子糖和组氨酸对一些“稀有”链霉菌有选择作用。小单孢菌小双孢菌小四孢菌2.新的筛选模型及手段 新药物作用靶标 微生物产物库 高通量筛选 虚拟筛选3、组合生物合成技术的应用、组合生物合成技术的应用酮基合成酶(KS)、酰基转移酶（AT）、脱氢酶（DH）、烯醇还原酶（ER）、酮基还原酶（KR）和酰基载体蛋白（ACP）等功能域4、代谢调控与基因敲除5、基因改组（DNA Suffling）v-内酰胺类抗生素内酰胺

8、类抗生素v氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素v大环内酯类抗生素大环内酯类抗生素v培养发酵：培养发酵：v发酵液预处理发酵液预处理v固液分离固液分离 胞内产物胞内产物 细胞破碎细胞破碎 固液分离固液分离 胞外产物胞外产物 初步纯化初步纯化 精制初步纯化方法：初步纯化方法：沉淀、吸附、萃取、超滤沉淀、吸附、萃取、超滤精制方法：精制方法：层析、电泳、结晶层析、电泳、结晶1 1、产品性质：、产品性质： 化学组成、分子量、稳定性、溶解度、化学组成、分子量、稳定性、溶解度、解离特性等解离特性等2 2、主要杂质属性：、主要杂质属性：3 3、方法前后衔接要求、方法前后衔接要求4 4、产品质量要求、产品质量要求 a

9、 青霉烷青霉烷* b 青霉烯青霉烯 c 头孢烷头孢烷 d 头孢烯头孢烯* e单环单环-内酰胺内酰胺 f 碳青霉烷碳青霉烷* g 碳青霉烯碳青霉烯* h 碳头孢烷碳头孢烷 I 碳头孢烯碳头孢烯 j 氧青霉烷氧青霉烷* k 氧青霉烯氧青霉烯 l 氧头孢烷氧头孢烷 m 氧头孢烯氧头孢烯 *天然产物天然产物v九十年代各国首次应用的抗细菌杭生素共24种，其中有头孢菌素14种，碳青霉烯2种，青霉烯1种，一内酰胺酶抑制剂与其制剂1种，氨基糖苷、大环内酯与安莎类抗生索各2种。新上市的合成抗菌药共10种，包括喹诺酮类化合物9种和二氢叶酸还原酶抑制剂1种。CNHCHCHCOOCNCHCH3CH3COOHSSite

10、 of penicillinase action.Breakage of the - lactam ring.STRUCTURE OF PENICILLIN共性：共性： 羧基有弱酸性：羧基有弱酸性： 影响溶解度影响溶解度 -内酰胺环不稳定内酰胺环不稳定（A A）、理化性质：）、理化性质：1 1、溶解性：受、溶解性：受pHpH影响影响 游离酸：易溶于有机溶剂，难溶于水游离酸：易溶于有机溶剂，难溶于水 盐：易溶于水，几乎不溶于有机溶剂盐：易溶于水，几乎不溶于有机溶剂2 2、酸碱性：有机弱酸、酸碱性：有机弱酸3、稳定性： 温度、pH对其稳定性的影响4降解反应5、聚合反应 氨苄青霉素在水溶液中易形成聚

11、合物，是氨苄青霉素过敏反应的主要过敏原之一。6. 过敏反应 可能为青霉噻唑多肽和青霉噻唑蛋白1 1、菌种、菌种最早的原始菌种是点青霉菌最早的原始菌种是点青霉菌( (Penicillium Penicillium notatumnotatum) )；现用产黄青霉菌现用产黄青霉菌( (Pen.chrysogenumPen.chrysogenum) )按菌丝的形态分为丝状菌和球状菌两种。按菌丝的形态分为丝状菌和球状菌两种。国内青霉素生产厂大都采用绿色丝状菌。国内青霉素生产厂大都采用绿色丝状菌。2 2、发酵工艺流程、发酵工艺流程丝状菌发酵工艺流程丝状菌发酵工艺流程 孢子培养 孢子培养 种子培养 砂砂土

12、土管管斜斜面面母母瓶瓶大大米米孢孢子子种种子子罐罐 繁繁殖殖罐罐 25,67 天 25,67 天 25,4045h,1:2.0(v/v/min) 种子培养 发 酵 冷至 15 发发酵酵罐罐放放 罐罐至至提提炼炼部部门门 25,1315h,1:1.5(v/v/min) 26,67 天,1:1.0(v/v/min) 3、提炼工艺流程工业钾盐生产工艺流程工业钾盐生产工艺流程p5811 1）发酵液预处理和过滤）发酵液预处理和过滤 放罐后，首先要放罐后，首先要冷却冷却 目前采用鼓式过滤及板框过滤，加助滤剂。酸化时目前采用鼓式过滤及板框过滤，加助滤剂。酸化时pHpH应控制得高些应控制得高些(pH4(pH4

13、5)5)，再加些絮凝剂如十五，再加些絮凝剂如十五烷基溴化吡啶烷基溴化吡啶(PPB)(PPB)等等, , 过滤。过滤。 随着高效高速萃取离心机的出现，如德国随着高效高速萃取离心机的出现，如德国WestfaliaWestfalia公司出品的倾析器公司出品的倾析器(decantor) (decantor) ，可革去过滤工序，可革去过滤工序，比用板框过滤除去菌丝后再提取的收率高出比用板框过滤除去菌丝后再提取的收率高出2 23%3%。2 2）影响青霉素提取的主要因素）影响青霉素提取的主要因素 青霉素提取效果除了已选定适当的有机溶媒，青霉素提取效果除了已选定适当的有机溶媒，破乳化剂和离心分离设备外，还与下

14、列主要因破乳化剂和离心分离设备外，还与下列主要因素有关素有关: : pH pH值值 一般从滤液萃取到醋酸丁酯时，一般从滤液萃取到醋酸丁酯时，pHpH选择选择2.02.02.52.5，而从丁酯反萃取到水相时，而从丁酯反萃取到水相时，pHpH选择选择6.86.87.27.2之间。之间。 温度温度 要求提取在低温要求提取在低温(10(10以下以下) )条件下进行较条件下进行较为有利。在设备上要考虑用冷盐水进行冷却，为有利。在设备上要考虑用冷盐水进行冷却，以降低温度，特别是酸化岗位，温度要求更低以降低温度，特别是酸化岗位，温度要求更低些。些。时间时间 酸化时速度应快些。碱化时速度可放慢酸化时速度应快些

15、。碱化时速度可放慢些，因青霉素在中性下半衰期要长些，破些，因青霉素在中性下半衰期要长些，破坏要缓和些，故以能分离得清为原则。坏要缓和些，故以能分离得清为原则。 萃取方式和浓缩比萃取方式和浓缩比 萃取剂和萃取方式选择萃取剂和萃取方式选择 目前生产上采用二级逆流萃取方式。浓缩比目前生产上采用二级逆流萃取方式。浓缩比的选择也很重要，因为丁酯的用量与收率的选择也很重要，因为丁酯的用量与收率和质量都有关系。丁酯用量为滤液体积的和质量都有关系。丁酯用量为滤液体积的252530% 30% 时，色素相对含量低，浓缩比为时，色素相对含量低，浓缩比为1.51.52.52.5倍。倍。胍基pK 11.5甲氨基pK 7

16、.71 1、溶解性：易溶于水，难溶于有机溶剂、溶解性：易溶于水，难溶于有机溶剂2 2、酸碱性：强碱性、酸碱性：强碱性3 3、稳定性：较稳定、稳定性：较稳定 pH47pH47溶液数周内稳定溶液数周内稳定 pH4.04.5pH4.04.5最稳定最稳定 降解反应：降解反应： 酸、碱条件下水解出链霉胍等酸、碱条件下水解出链霉胍等4 4、醛基反应：、醛基反应： 与伯胺形成席夫碱与伯胺形成席夫碱6789101112pH%10080604020Str-H33+StrStr-H22+Str-H+5 5、成盐：、成盐： 与磷钨酸、苦味酸、甲基橙等成盐沉淀，用于鉴与磷钨酸、苦味酸、甲基橙等成盐沉淀，用于鉴别别 与

17、磺酸、羧酸、磷酸酯成盐，可溶于有机溶剂中，与磺酸、羧酸、磷酸酯成盐，可溶于有机溶剂中，可用于溶媒萃取法。可用于溶媒萃取法。 与某些盐形成复盐，用于精制，如：与某些盐形成复盐，用于精制，如： 链霉素盐酸盐与氯化钙（在甲醇中）形成复盐，链霉素盐酸盐与氯化钙（在甲醇中）形成复盐，从甲醇中析出。复盐溶于水，可通过阴离子交换从甲醇中析出。复盐溶于水，可通过阴离子交换树脂（树脂（SOSO4 4）转为硫酸盐。）转为硫酸盐。p585v1.发酵液的过滤处理v2 树脂的吸附、洗脱v3 活性炭脱色、低温浓缩 结构特点：以大环内酯为母体结构特点：以大环内酯为母体共性：共性： 1 1、无色弱碱性化合物、无色弱碱性化合物

18、 2 2、微溶于水，在水中溶解度随温度上、微溶于水，在水中溶解度随温度上升而下降升而下降 3 3、酸性条件苷键易水解，碱性内酯环、酸性条件苷键易水解，碱性内酯环易破坏易破坏1 1、酸碱性：二甲氨基呈碱性、酸碱性：二甲氨基呈碱性2 2、溶解性：易溶于醇、丙酮、氯仿、酯，、溶解性：易溶于醇、丙酮、氯仿、酯，微溶于乙醚和水，在水中溶解度微溶于乙醚和水，在水中溶解度5555时时最小最小3 3、稳定性：、稳定性：pH68pH68最稳定最稳定工艺要点：发酵液的预处理和过滤；树脂的吸附、洗涤和解吸、反萃取、结晶结构上都含有四并苯母核结构上都含有四并苯母核1 1、溶解性：、溶解性： 在在pH4.57.5pH4

19、.57.5之间难溶于水之间难溶于水 游离碱能溶于吡啶、甲醇、丁醇等有机溶剂和稀酸、游离碱能溶于吡啶、甲醇、丁醇等有机溶剂和稀酸、稀碱稀碱 盐酸盐能溶于水，不溶或微溶于有机溶剂盐酸盐能溶于水，不溶或微溶于有机溶剂2 2、稳定性：、稳定性： 干燥低温稳定干燥低温稳定 水溶液碱性条件下不稳定，酸性条件下（水溶液碱性条件下不稳定，酸性条件下（pH45pH45）较稳定较稳定3 3、化学反应、化学反应 差向异构化：弱酸性差向异构化：弱酸性pH26pH26 脱水反应：较强酸性脱水反应：较强酸性pH2pH2时脱水时脱水 碱性条件下降解：弱碱性碱性条件下降解：弱碱性pH8pH8，C C环打开环打开 螯合反应：螯

20、合反应： 与高价金属离子与高价金属离子 成盐：四环素与尿素形成复盐，用于精制成盐：四环素与尿素形成复盐，用于精制 与长链季胺碱成盐，带同萃取反应与长链季胺碱成盐，带同萃取反应 工艺要点：发酵液的预处理中酸化的作用、纯化剂的选择；结晶与尿素复盐一、微生物产生的酶抑制剂一、微生物产生的酶抑制剂（一）（一）-内酰胺酶抑制剂内酰胺酶抑制剂 克拉维酸克拉维酸 舒巴坦舒巴坦 v克拉维酸，英文名称Clavulanic acid，简称CVA，又名棒酸 1975年，美国哈佛大学教授Woodward提出如把青霉素和头孢菌素的骨架进行组合的青酶烯一定会有很强的抗菌活力的假说S -oc-3 -羟基乙叉取代基C-6 上

21、没有酰氨基v19761976年从棒状链霉菌的代谢产物中分离年从棒状链霉菌的代谢产物中分离得到了克拉维酸，本身抗菌活性很弱，得到了克拉维酸，本身抗菌活性很弱，但与羟氨苄青霉素组成的复合剂但与羟氨苄青霉素组成的复合剂奥格门奥格门汀汀、与羧噻吩青霉素组成的复合剂、与羧噻吩青霉素组成的复合剂timentintimentin都具有很好的协同作用，并应都具有很好的协同作用，并应用于临床。用于临床。工艺要点：萃取与浓缩 沉淀：与碱性有机胺成盐而沉淀析出；10，搅拌加入5%（2（二甲氨基） 乙基）醚的乙醇溶液 转型（二）降血脂作用的酶抑制剂：洛伐他汀（二）降血脂作用的酶抑制剂：洛伐他汀 -胆固醇的生物合成途径

22、胆固醇的生物合成途径洛伐他汀lovastatin1223Av2000年，降血脂药（降胆固醇药）成为全球第二大治疗药物类别，全年销售额达159亿美元，比同期增长21%。而他汀类降血脂药是降血脂药的主力军，主要品种有: 辉瑞的Lipitor（阿伐他汀） 默克的Zocor（辛伐他汀） BMS的Pravachol/Mevalotin（普伐他汀） 拜耳公司的Lipobay/Baycol（西立伐他汀）诺华的Lescol（氟伐他汀） vMevacor(洛伐他汀)1991年世界销售额为10.92亿美元，1992年为12.85亿美元，1993年达13.5亿美元，然后逐年下降，1998年为7.45亿美元，1999

23、年下降到4.59亿美元，而到了2000年，洛伐他汀的销售额出现反弹，上升到5.20亿美元，比上年增长了4.16%,并且这种反弹的趋势还将有一段延续。之所以会有这种变化，可能与洛伐他汀增加适应症有关。v氟伐他汀（Fluvastatin）为第二代调血脂产品，由瑞士山道士公司开发成功，上品名为来适可，1993年12月通过美国FDA批准，次年在英美上市。该药由诺华公司生产，1998年已在80多个国家地区上市，1996年获我国行政保护。2000年的全球销售额为4.283亿美元，较1999年增长了5.1%，占他汀类药物的2.8%。2001年来适可的全球销售额为4.82亿美元，同比增长了12.4%，日本田边

24、的氟伐他汀也有近亿美元的收入。 v洛伐他汀为第一个上市的HMG-CoA还原酶抑制剂，它具有显著的降血脂效果，一般可使血浆总胆固醇下降30%40%，低密度脂蛋白下降35%40%，甘油三脂中等程度下降，还有升高高密度脂蛋白的作用。 溶解性：易溶于有机溶剂,游离酸不溶于水121.发酵液的预处理发酵液的预处理 发酵生成的洛伐他汀以游离酸为主，由于游离酸在发酵生成的洛伐他汀以游离酸为主，由于游离酸在水中的溶解性很小，因而大部分存在于菌丝体中。水中的溶解性很小，因而大部分存在于菌丝体中。为将洛伐他汀溶出，可将发酵液调节至碱性，再过为将洛伐他汀溶出，可将发酵液调节至碱性，再过滤滤2.醋酸乙酯萃取醋酸乙酯萃取

25、3.硅胶柱层析硅胶柱层析二、二、微生物产生的免疫调节剂微生物产生的免疫调节剂 免疫抑制剂免疫抑制剂 环胞菌素环胞菌素A A 免疫增强剂免疫增强剂 乌苯美司乌苯美司 最早是最早是19681968年年LazaryLazary等从真菌中筛选到等从真菌中筛选到ovalicinovalicin 1969/1970 1969/1970年瑞士山道士公司分离光泽柱孢菌年瑞士山道士公司分离光泽柱孢菌和多孔木霉，产生具窄谱抗真菌活性的环孢和多孔木霉，产生具窄谱抗真菌活性的环孢菌素菌素A A。19781978年首次应用于临床肾移植实验。年首次应用于临床肾移植实验。19831983年年FDAFDA批准上市。批准上市。

26、19761976年年 UmezawaUmezawa从橄榄网状链霉菌的发酵液种分离从橄榄网状链霉菌的发酵液种分离得到得到BestatinBestatin。三三 微生物来源的具有神经保护作用的微生物来源的具有神经保护作用的物质物质 难点：神经保护作用 血脑屏障四四 微生物来源的受体拮抗剂微生物来源的受体拮抗剂 CytosporinA B CCytosporinA B C 从链霉菌分离得到的六肽类催产素受体拮抗剂 1 Annual Review of Microbiology2 Antimicrobial Agents and Chemotherapy3 Journal of Bacteriology4 Journal of Antibiotics5 Biocatalysis and Biotransformation6 Current Opinion in Biotechnology7 Current Opinion in Chemical Biology8 Current Opinion in Microbiology9 Drugs10 Enzyme and Microbiology11 FEMS Microbiology Review12 Journal of Bi