小鸡毛囊细胞再生

1、转录组的小囊禽流感内耳毛细胞的再生Yuan-Chieh Ku,1妮可aRenaud 1 a . Veile上升,辛西娅赫尔姆斯1 1考特尼C.J. Voelker,马克eWarchol 2和迈克尔Lovett11遗传学和2耳鼻咽喉部,华盛顿大学医学院,圣路易斯,密苏里州63110感觉毛细胞丢失是听觉和平衡失调的主要原因。哺乳动物是无法持续的头发细胞再生,但较低的脊椎动物这些mechano-electrical传感器可以再生。我们现在第一个全面的转录组(通过信使rna - Seq)小鸡毛细胞再生的小囊。我们提供途径和模式注释与表型关联这些事件发生在再生。这些模式是惊人的同步和高度打断。我们展示这

2、些模式是如何识别组件的新资源的头发细胞转录组和识别494个新假定毛细胞具体基因和验证三种免疫组织化学染色(三个测试)。我们描述了许多令人惊讶的新组件和动态表达模式,尤其是在NOTCH信号。例如,我们表明,HES7明确表示在小囊毛细胞再生和密切的相似之处HES5的表达。同样,ATOH1的表达与HEYL密切相关,通过抑制转录因子ID1、ID2,ID4。我们研究纤维母细胞生长因子信号之间的相关性和支持细胞增殖和显示FGF20支持细胞增殖抑制。我们也提供了一个分析212个差异表达的转录因子基因在再生时间进程,分为9个不同的基因表达模式,其中许多与表型事件在再生和代表有吸引力的候选人未来的分析和操作的感

3、觉上皮细胞和其他脊椎动物neuroepithelia再生项目。关键词:毛细胞;再生;RNA-seq;系统生物学;胞果介绍 失去感觉毛细胞是听觉和平衡失调的主要原因（Marazita等人，1993; Blanchfield等人.,2001)。感觉毛细胞驻留在感觉上皮细胞转导声音和运动。在哺乳动物中,一旦这些上皮细胞成熟,他们不能持续再生(打造et人，1993; Warchol等人.,1993);然而,降低脊椎动物有一个健壮的regenera这个能力在他们的感觉上皮细胞(科文和Cotanche,1988;瑞尔斯和鲁贝尔,1988;Warchol科文,1996)。禽流感毛细胞死亡触发两种结果之一周围

4、支持细胞。他们可以直接转换成新的毛细胞(罗伯森et人，2004;邓肯等人.,2006),这一过程被称为表型转换,或者他们可以进入细胞周期产生新的毛细胞和支持细胞再生pro - liferation（吉伦特等.,1989;石头和Cotanche,1994)。在脊椎动物的耳朵,前庭(平衡)和耳蜗毛细胞(听觉)系统依赖于机械运动转换成电刺激。前庭系统mor-phologically保存在不同的脊椎动物物种中,而哺乳动物的听觉系统已经进化专业struc - 温度没有出现在其他脊椎动物（迈耶斯科文，2008）。作者的贡献:M.E.W.和马丁设计研究;Y.-C.K。,随机变数,简历进行研究;Y.-C.K。

5、,天然橡胶,h,M.E.W.和马丁分析数据;Y.-C.K。,M.E.W.,马丁写的论文。这项工作是由美国国立卫生研究院（赠款RC1DC010677马丁和R01DC006283M.E.W.和国家耳聋和其他沟通障碍研究所格兰特P30DC04665)。作者声明没有竞争的经济利益。信件应该写给教授迈克尔洛维特NHLI,竹荚鱼大楼,帝国理工学院Dovehouse街,伦敦SW3 6光年电子邮件：m.lovettimperial.ac.uk。DOI：10.1523 / jneurosci.2606 - 13.2014版权©2014年作者0270 - 6474/14/343523 - 13美元的15

6、.00 / 0  知之甚少的遗传机制,调节感觉上皮细胞再生。一个例外是NOTCH通路,它一直在研究哺乳动物和鸟类都在开发和再生毛细胞(林德-出售et人，1996;兰福德等人.,1999;石头和鲁贝尔,1999)。这样的研究表明,基因转录因子ATOH1和各种他扮演了一个重要的角色在决定通过相互抑制毛细胞和支持细胞命运循环。值得注意的是,这些转录因子和下游的上游管理机制,进一步指定一个毛细胞在很大程度上是未知的。  我们小组进行了第一次大规模的基因表达分析再生过程的禽流感内耳specif专注于带转录因子基因表达的变化锡安(霍金斯et人.,2007)。在这里,

7、我们目前的第一个全面的转录组,由RNA-Seq毛细胞再生的小鸡小囊acrossa7d时间进程从第一阶段的应对伤害到生产新的毛细胞的再生增殖。我们提供大量的途径和模式注释和相关基因表达数据与支持细胞的增殖,生产新的毛细胞的表型转换,和后来的生产重新生成扩散的毛细胞。我们还描述了主要明显的帕特-燕鸥和途径,其中一些是令人惊讶和动态和展示这些新发现资源准确一致格彻底的头发细胞转录组的组件。最后,我们investi门之间的关系成纤维细胞生长因子(FGF)的控制信号和支持细胞增殖和呈现一个聚类分析212个差异表达的基因表达改变转录因子的再生时间,绝大多数从未被研究过的再生和代表有吸引力的候选人为未来在许

8、多脊椎动物再生项目的分析和操作系统。材料和方法  小鸡小囊文化和孤立的感觉上皮细胞.Organotypic尽头 - 温度的小鸡小囊（从两性）是由先前描述的方法（松井等，2002）胞果服用1毫米链霉素24 h。未经处理的并行文化保存和担任匹配控制。24小时后,所有标本收集进行分析或被清洗和维护文化1 - 第7天链霉素，无介质和美联储在2 d的间隔。组成的纯感觉上皮细胞,只有毛细胞和支持细胞,分离从底层组织后立即streptomy治疗cin(0 h时间点）或 - 168年24小时后复苏的体外胞果被冲洗，然后孵化30分钟的嗜热菌蛋白酶（500。微克/毫升37°C）。每个

9、时间点和治疗孤立的上皮细胞组汇集和溶解在试剂盒试剂(表达载体)。至少有两个生物样品(16上皮细胞池从链霉素治疗组和对照组16)收集每一个时间点。  免疫组织化学，培养胞囊和4多聚甲醛固定为30分钟，用PBS，孵化for2h在PBS 5%正常马血清,和孵化一夜之间在初级抗体。毛细胞与抗体标记otoferlin(HCS-1;礼物杰弗里科文弗吉尼亚大学的夏洛茨维尔,弗吉尼亚州)或Mysoin a因子（1:50 0;变形杆菌）。抗体对AP3B2，MDFI DNM1来自Abcam的标本冲洗PBS和孵化2 h与二次抗体共轭荧光标记(Alexa萤石488或488;表达载体)。标本应用共焦

10、显微镜成像(LSM 700;蔡司）和处理Volocity软件（珀金埃尔默）。细胞分裂和头发细胞复苏的量化扩散在1 - 。7天氨基糖苷类抗生素治疗后评估文化收到尿嘧啶（3微克/毫升），最后4 h体外。固定后,胞囊被处理为BrdU免疫组织化学,一个试验系统,已经被前面描述(松井et人.,2002),并通过共焦显微成像。BrdU-labeled细胞被量化的100×100µm六个区域内extrastriolar每个标本的一部分。数据从6 -10小囊/时间点/治疗组。头发细胞复苏量化使用类似的方法。再生毛细胞与抗体标记对肌球蛋白VIIa(参见上面的方面nohistochemistry

11、)。共焦图像获取和毛细胞量化在6 100×100微米extrastriolar地区每小囊。  FGF信号和支持细胞增殖。培养胞囊治疗与FGF20(激活FGFR1和/或FGFR3)或SU5402(抑制FGFRs)。胞果治疗24 H 1毫米streptomy - CIN，如小囊培养所述，以上文化是冲洗和特定介质 - 199补充1的边后卫和包含FGF20（1微克/毫升，1微克/毫升硫酸肝素;研发系统)或SU5402(30µM;圣克鲁斯生物技术)。控制文化收到了1µg /毫升硫酸肝素（FGF20实验）或0.1DMSO（SU5402实验）。每个治疗组包含

12、-12标本。胞囊孵化在媒体48小时和增殖细胞分裂的量化测量，以上。统计学意义是利用学生的牛逼测试评估。  RNA-Seq准备。每个时间点的样本处理使用Illumina公司mRNA-seq或TrueSeq准备工具。总之,信使RNA被oligo-dT选择磁珠从1µg总RNA和分散。使用的第一链cDNA生成的随机引物。两样东西合成、修复,添加一个基地，适配器结扎被执行。每个RNA-seq图书馆使用Illumina公司测序基因组DNA分析仪IIx或HiSeq 2000。在所有情况下,纯感觉上皮细胞的生物复制样本进行了分析。生物replicates之间的平均相关系数为0.9

13、423。在某些情况下,我们还跑技术复制。技术复制之间的平均相关系数为0.9979。  RNA测序数据分析。生读入FASTQ格式对齐到运用背带吊裤带参考基因组（WUGSC2.1 E66）使用大礼帽V1.4.0（杰尔等.,2009)。输出。bam文件处理Partek基因组组装套件6.6版本读取记录和评估他们的丰度。基因数据集模型结合En - sembl和国家生物技术信息中心注释用于生成每千碱基读取每百万碎片外显子映射(RPKMs)已知基因和潜在的小说文本。Sta - tistical重要性水平计算单向方差分析。生物复制94%的平均R。读取映射到不同亚型的一个给定的基因结合在一起

14、进行分析。至少有一个样品在整个时间进程是需要0.5 RPKM。至少一个时间点必须有显着改变（P < 0.05折折1.8)。相同的过滤器被应用于单个时间点产生差异表达数据集。从聚类分析基因列表上传到g:分析器和分析基因群func一对剖析。从g途径预测:数据库分析器literature-supported交互数据集的可视化表示细胞等。所有序列数据和注释已经提交给NCBI基因表达综合(GEO)和网上。   定量实时PCR。总RNA分离一段时间的治疗和控制鸡感觉上皮细胞在所有时间点和转换为互补。实时定量PCR(存在)都使用了ABI荧光定量基因表达主人混合（应用生物系

15、统公司）于7900年ABI HT实时PCR机器。所有的存在化验是来自DNA技术和集成运行一式三份0.18小号rRNA的表达被用作标准化控制。20个基因(包括ATOH1和HES5)被选为验证在每一个时间点(一式三份)一套新的并行的生物样本(660中存在化验)。平均的褶皱变化之间的相关性存在和RNA - 序列是86，在所有的情况下同意的趋势。结果我们使用了一个体外器官型培养系统类似于毛细胞再生的体内观察到(1999年Warchol,松井et人.,2002)。整个胞囊被放置在文化和接受24小时的氨基糖苷类抗生素治疗,杀死毛细胞 93的人口（Warchol和蒙特 - couquiol,2010)。未经

16、处理的并行小囊是培养和担任控制。氨基糖苷类抗生素治疗后,一些标本的感觉上皮细胞(以及未经处理的con - 控制）被移除的RNA序列;这是零时间点（见材料与方法）其他标本冲洗和小路 - 1 - 7天约束我们在24小时采样间隔168 h。我们所有的RNA-Seq数据来源于纯粹的感觉上皮细胞没有任何检测基质污染。这些感觉上皮细胞由毛细胞和支持细胞,后者作为毛细胞再生的祖细胞支持细胞毛细胞的比例是4：（固特异等人，1999）。1最初的头发细胞密度在这些文化180 /10,000m2和滴12 / 10,000m2后抗生素治疗。大型NUM -伯斯的支持细胞增殖抗生素治疗后96小时内,导致最终的补充,毛细胞

17、的数字。此外,少数新的毛细胞是由直接表型转换后第一个2 - 3 d内抗生素损伤。很明显从我们最初的样品,令人惊讶的在基因表达发生改变环在48 -72 h的再生因此我们山姆 - 承认每隔6小时在48 -72 h窗口（56岁，60岁，66 h)。在所有情况下,至少有两个生物复制在每个时间点进行了分析。材料与方法部分包括信息数据再现性。我们进行了RNA样本中存在一个单独的时间进程所有11个基因验证mRNA-Seq 20日时间点的数据。在所有情况下，这些趋势同意（网上数据）。图1所示。差异表达基因集群分析索姆。差异表达基因集群到36质心索姆(Partek)。每个轴表示单个时间点。轴显示平均归一化褶皱变

18、化(log2)基因在质心,酒吧的显示范围。数量在每一个重心是指一个基因簇在文本。特定数量的基因和基因在每个集群id补充表4中列出。一些功能注释和大卫之间的相关性模式显示在每一个重心,使用以下代码:艺术展,氨基酸生物合成;麦,氨基酸代谢,美联社,细胞凋亡;钙、渠道活动;CB,钙结合;CC,细胞周期,厘米,细胞迁移,CYT,细胞骨架,DD,DNA损伤;哦,细胞外基质,呃,内质网;g,糖基化,通过,螺旋循环螺旋基因;干扰素,干扰素反应;MIB,金属离子结合,MP,膜蛋白;NB,核仁生物合成;ND,神经发育,NOS,核细胞器合成,帕特,模式,RB,RNA绑定;RD,差异化监管;SPS,感官知觉的声音;

19、老,压力反应;TM、跨膜运输;VGC,电压门控通道。定义再生转录组我们设置阈值差异表达基因在1.8倍和p值< 0.05在任何一个时间点治疗和控制文化。原始序列已被提交给NCBI地理(加入申请),所有的注释都在线。我们也需要丰富的每个记录0.5 RPKM(Mortazavi et al .,2008)在任何样品。这导致了3661个基因不同的列表,按在任何单一的时间点。之间的相关性表达模式和功能注释调节和表达下调的基因列表在各个时间点上传到大卫生物信息学资源6.7(da黄et al .,2009)执行基因本体论(去)丰富,分析(补充表中数据在线9)。在早期的时间点(毫无疑问),感知声音的过程

20、是耗尽( 10%基因的假定值< 10 5),重新弯曲毛细胞的死亡。调节基因,GO术语丰富细胞周期注释从24到120 h( 20%的基因和假定值< 10 5)。这个开关在细胞周期(在24 h和120 h)同意研究观察mitotically再生毛细胞 6 d氨基糖苷类抗生素治疗后(Cotanche et al .,1994)。120 h后,差异表达基因的数量下降了52%,反映出停止增殖pro -克。在这些后期,注释点开关生产和糖蛋白在细胞外基质。这正值时期成熟毛细胞再生增殖的开发支持细胞。确定更具体的模式,我们聚集所有与众不同多弧离子镀表达基因通过自我组织中无监督聚类地图(索姆;Koh

21、onen,1982)在时间进程识别36模式(图1)。这许多不同的模式是到达小(20质心)和派生出来的经验越来越大量的无监督集群。这是康博之间的协定派生(如复制模式。、细胞周期模式)和观察离散dif丰富有趣的模式不同的细胞过程。例如质心19、25、31日在图1中是高纯度的细胞周期计划,表明这个启动24小时,到120年已基本停止了h。我们也共同导管功能注释和分析这些SOM网络集群使用大卫g:分析器(Reimand et al .,2011),和Cytoscape工具(斯穆特et al .,2011)。这些功能的几个共同关系如图1所示。相关的时间过程具有再生的表型关联时间与再生的表型研究毛细胞再生通

22、常使用两把典型的测量:(1)支持细胞增殖以BrdU整合进DNA(Gratzner,1982)和(2)的生产成熟毛细胞测量的头发-特异性蛋白质如肌凝蛋白VIIA(亚et al .,1995)。我们量化这些再生时间进程。图2显示了扩散指数和毛细胞恢复值。DNA复制(图2)是一个高度间断的过程,与峰值48 h后急剧下降。这个峰值与cell-cycle-related记录的光谱(图1,), > 300不同GO-annotated基因产物和collec有效显示长高原的表达式。这些记录只下降在96 96 h表达式作为一个群体,大概是因为复制机器是用于确保完整的胞质分裂。测量的出现新的毛细胞MYO7a

23、污点荷兰国际集团(ing)的持久性是复杂的死(但unextruded)受伤的感觉上皮细胞内毛细胞。少neverthe证据MYO7a染色(图2 b),毛细胞num -伯斯下降通过48小时时间点,然后补充了72 h(符合一段表型转换时间框架),紧随其后的是一个 2倍增加168 h(从再生增殖)。图2。表型的测量在再生时间进程。支持细胞,DNA复制是衡量BrdU合并分析。轴表示单个时间点。y轴显示每10000µm BrdU-labeled细胞2的平均数±SD在控制和streptomycin-treated organotypic文化。B,成熟毛细胞的数量被测量MYO7a-labe

24、led量化细胞。鸡小囊感觉上皮细胞organotypic文化与链霉素治疗和免疫组织化学标记MYO7a检测成熟毛细胞。轴表示单个时间点。y轴显示每10000µm毛细胞的平均数±2 SD。确定组件的头发细胞转录组更精细的测量跟踪- - -荷兰国际集团(ing)提供的毛细胞生产小组32基因标记小囊内毛细胞感觉上皮细胞(包括MYO7a)RNA-Seq数据如图3所示。所有这些显示> 2倍(范围的下降2倍后基因表达的16倍)氨基糖苷类反生物治疗,反映毛细胞损失,然后显示复苏的各种模式,表现出较高的表达水平在168 h。有趣的是,很多人表现出峰值或高原的表情 72 h,同时可能出现

25、板式换热器- notypic转换和少数新的毛细胞的生产。大多数这些标记由168 h不回到野生型的水平,这是符合的补充正常毛细胞数量的25%。 我们使用这种模式作为一个过滤器来确定新的毛细胞特定的标记。定义的头发细胞转录组仍然是一个挑战。目前,只有一小部分的头发细胞转录组已被确认。例如,各种数组-图3。表达谱的32个毛细胞标记。轴表示单个时间点。y轴显示的褶皱变化streptomycin-treated log2范围与控制样本。这些哨兵基因明显下调在0和24小时的时间点和显示复苏趋势的结束时间。图4。索姆潜在毛细胞的标记。为潜在的毛细胞标记基因通过过滤器(表达下调在0倍-24 h 168 h和复

26、苏趋势的时间点)被索姆集群分成25组(Partek)。每组的轴表明单个时间点。y轴显示的是标准化的褶皱变化。表明表型转换OC - （罗伯森等人，2004年）杂种狗3 d后抗生素去除和由我们意味着 - 肯定是MYO7A蛋白质。  来确定我们的过滤设置确实丰富了善意的头发-特异性基因,我们选择三个验证通过im - 组化可用的抗体第一个，DNM1编码的一员DY - 纳明亚GTP结合亲 - 爱因斯坦它已经涉及信号转导和囊泡运输（切断，2002; Wiejak Wyroba，2002）。与MYO7A DNM1与内毛细胞(图5),这表明它可能是一个静纤毛束的一部分。AP3B2第二个基因

27、,编码的子单元适配器蛋白质复合体3和在神经递质释放过程中发挥作用(纽曼et人，1995;能力'ndez等人，1998）.AP3B2明确表示在毛细胞表示细胞物质（图5 b),在所有毛细胞相似的水平。第三个基因是MDFI,合成一个MyoD家庭抑制剂。基于方法(麦克德莫特et人，2007; Hertzano等人，2011;。Sinkkonen等，2011）和蛋白质组学研究（Herget等人，到2013年;胫骨等.,2013)发现了几百个毛细胞标记。因此,我们实现了一个过滤整个列表所需的3661个基因表达倍下降在0 -24 h和相对恢复到168年h。这导致了一个526个基因列表(一些例子如表1

28、所示),在其中是我们32毛细胞“哨兵”基因。然后我们25 SOM集群来自这组(图4)。所有这些集群显示相同的趋势在课程开始和结束的时候,但也有可再生的波动在-72年48 H，这是符合表型转换支持细胞毛细胞。这一解释是由以前的研究这种转录因子负调节其他肌原性的家庭蛋白质,与轴蛋白相互作用,调节物和WNT通路(Kusano拉布 - 特劳布，2002）。大约90的小囊头发细胞被标记为MDFI（图5），但核染色的强度不同，33被强烈的彩色。我们的结论是，494过滤的基因富集新的头发细胞标记。此外，除了MDFI，一个额外的13的转录因子的基因是存在于我们的推定的毛细胞簇。这些是值得注意的，因为这么几个毛

29、发细胞特异性转录因子之前已经描述了。表2中列出的14个转录因子基因，3是已知的毛细胞特异性转录因子（POU4F3，GFI1和LHX3），一个是MDFI基因我们验证，和使剩余10是用于毛发细胞基因调控进一步调查新的候选人。值得注意的是，我们的新推定的毛细胞标记物，勿庸置疑，具有与在上文所引用的各个基于阵列和蛋白质组学基stud-独立实体描述的几百几乎没有重叠。的整个526推定的毛细胞特异性基因网络分析提供了独立的证据，他们的交互的比例。图6显示了其中的一部分这一总体克：探查（Reimand等，2011）-predicted毛细胞网络，其中在再生转录的基因检测94链接内的网络（由文献引文支持要在克

30、内发现：探查数据库），其包括一个已知的毛细胞标记（KCNA2），我们的一个新的有效的标志物（DNM1），和13我们假定新的毛细胞特异性标记。因此，在其他细胞系统有独立的证据表明，这些基因产物直接交互。表1.本研究中鉴定推定的毛细胞特异性基因的实例 对基因的说明 BSN大管（突触前cytomatrix蛋白）CAB39L钙结合蛋白39样CACNA1B钙通道，电压依赖性，N型，-1B亚基CADM2细胞粘附分子2CAPSL Calcyphosine样CASQ2肌集钙蛋白2（心肌）GPR143 G蛋白偶联受体143 GPR149 G蛋白偶联受体149 GPR98 G蛋白偶联受体98K

31、CNA1钾电压门控通道，摇床相关亚家族，成员1 KCNA3钾电压门控通道，摇床相关亚家族，成员3 KCNA4钾电压门控通道，摇床相关亚家族，成员4 KCNAB1钾电压门控通道，振动筛 - 相关亚科，成员1 KCNAB2钾电压门控通道，摇床相关亚家族，成员2 KCNH6钾电压门控通道亚科H（EAG相关），成员6 KCNJ2钾内向整流通道，亚科，成员2KCNS2钾电压门控通道，延迟整流，亚科S，成员2KCNU1钾通道，亚家族U，成员1MYBPC1肌球蛋白结合蛋白C，慢热型的MYH7B肌球蛋白重链7B，心肌，MYLK4肌球蛋白轻链激酶的家庭，成员4 MYO18B球蛋白XVIIIBMYO1H肌球蛋白I

32、HMYO3A肌球蛋白IIIAMYO3B肌球蛋白IIIBPCDH20 Protocadherin 20PCDH8 Protocadherin 8PCDH9 Protocadherin 9PCLO短笛（突触前cytomatrix蛋白）PCP4浦肯野细胞蛋白4SLITRK4 SLIT和NTRK样家族，成员4SMPX小肌蛋白，X-连接SNTN先端，纤毛顶结构蛋白SPHKAP SPHK1交互器，包含SPINK4丝氨酸肽酶抑制剂AKAP域，Kazal型4SPOCK3 SPARC /骨结合，cwcv和kazal样结构域蛋白聚糖SPRY3 Sprouty同系物3（果蝇）SV2B突触小泡糖蛋白2BSYN3突触蛋

33、白IIISYNC Syncoilin，中间丝蛋白SYT10突触XTESC TescalcinTM4SF18跨膜4升6家族成员18TMC5跨膜通道样5TMCC2跨膜和卷曲螺旋结构域家族2TMEM117跨膜蛋白117TMEM151B跨膜蛋白151BTMIGD1跨膜和含1免疫球蛋白域TMPRSS7跨膜蛋白酶，丝氨酸7TMPRSS9跨膜蛋白酶，丝氨酸9推定新毛细胞特异性标记五十实例列从确定了我们的图案和聚类分析494个基因（可在线）的总列表。图新型毛细胞标记5.免疫组化染色。鸡椭圆囊被标记的抗体，以公知的头发标记（MYO7A或otoferlin），并在本研究中鉴定潜在的新的毛发细胞标记物。比例尺，16

34、微米。甲，DNM1（绿色）和MYO7A（红色）的所有毛细胞内共定位和表达水平相似。 B，毛细胞被标记为otoferlin（绿色）。 AP3B2（红色）均匀表达的毛细胞的细胞质内。 C，MYO7A（绿色）标记毛细胞和MDFI（红色）标记的毛细胞的亚群的细胞核中，在不同的强度水平。的图像显示的感觉上皮与支持细胞填充标记毛细胞之间的间隙的顶面。表2.显著转录因子基因簇的实例说明基因表2.续生长因子独立1转录抑制易洛魁同源2 GFI1aIRX2锚蛋白重复结构域33四年半LIM结构域2 ANKRD33 FHL2LIM同源盒3 LHX3a叉头框F1 FOXF1MyoD的家庭抑制剂MDFIb易洛魁同源2 I

35、RX2MLX相互作用蛋白样MLXIPL LIM结构域3（rhombotin样2）LMO3活化的T细胞，细胞质，钙神经依赖性含有1 MAMLD11 NFATC1策划样结构域的核因子脑特异性同源框/ POU结构域蛋白3 POU4F3a重组信号对免疫球蛋白卡巴RBPJL结合蛋白SKI家庭转录辅阻遏1 SKOR1区样SKI家庭转录辅阻遏2 SKOR2维生素D（1,25-二羟维生素D3）受体VDR说明基因毛细胞特异性转录因子锚蛋白重复域5 ANKRD5SWI / SNF相关，矩阵关联，肌动蛋白染色质依赖监管机构，亚家族C，成员1SMARCC1D4，锌和双博士手指，家人3 DPF3背根神经节同源DRGX叉

36、头框F1 FOXF1锌指，MYND型含10 ZMYND10峰在54 -72小时（8个基因）相一致的表型转化（心数= 16）锌指蛋白385B ZNF385B转录因子基因表达集群浸54小时（18个基因）一致表型转化（心数= 7）B细胞易位基因1，抗增殖BTG1有14个转录因子的基因，是潜在的新毛细胞标志物聚类分析。的转录因子的基因，含有三个基因表达的图案的关联的列表显示在图8.所有基因列表和质心号码可在网上。aKnown毛细胞标志物。bValidated在这项研究中（参见图5）。CB / p300的相互作用反式，与谷氨酸/富含天冬氨酸羧基末端结构域，4CITED4内的公知的通路和过程的部件多毛和分

37、裂5 HES5增强多毛和分裂7 HES7增强干扰素调节因子4 IRF4多毛和分裂5类LOC419390增强MyoD的家庭抑制剂MDFI含5 PRDM5公关领域刺痒同系物1 PRICKLE1刺痒感同源2 PRICKLE218号染色体上样1 SS18L1滑膜肉瘤转基因Storkhead箱1 STOX1含24 TRIM24三方主题Teashirt锌指同源盒1 TSHZ1锌指，苦参碱型4 ZMAT4锌指蛋白385B ZNF385B锌指蛋白395 ZNF395锌指蛋白804A ZNF804A浸在120小时（25个基因）一致与细胞周期停止（心数= 13）AT丰富的互动域5A（MRF1类）ARID5A营反应

38、元件调节CREM组蛋白去乙酰7 HDAC7DNA抑制剂结合2，显性负螺旋 - 环 - 螺旋蛋白质ID2缺口1 NOTCH1核受体亚科4，A组，成员3 NR4A3过氧化物酶体增殖物激活受体PPARD差异表达的基因接下来，我们提取的整体数据集已知的和有趣的信令信息，通路/基因家族的组成部分。我们提取47途径/基因家族已经牵连在毛细胞发育或再生数据（数据可在线）。在这里，在这些数据中的丰富信息内容的例子中，我们强调的只是两个这些途径发挥关键作用的感觉上皮生物学的意见：（兰福德等，1999;斯通和鲁贝尔，1999）NOTCH和FGF（阿尔瓦雷斯等人，2003）信令。Notch信号通路我们的数据包括显著

39、改建Notch信号的25个组件的表达。其中之一是ATOH1。 ATOH1的元素氧基团水平与毛细胞分化有关，并启动其中ATOH1重新按压HES基因侧抑制的处理。 ATOH1升高也导致了增强三角洲和铁血的水平。这些结合Notch受体的adjoin-荷兰国际集团细胞。 NOTCH处理然后导致各种HES转录因子的基因，抑制ATOH1 EX- PRESSION这些邻近小区内，并将它们朝向支承细胞命运的表达（1999 Morrison等人，;锌等人，2001）。先前的研究已经表明，在椭圆囊Notch信号下游的主要HES旁系同源物是HES1和HES5（Heitzler等人，1996;2000年兰福德等人）中

40、。 HES1不表明基因表达显著改变我们的数据，AL-虽然它检测的表达。然而，HES5大量表达并在禽流囊regen-累加器动态调节。值得注意的是，HES5的表达急剧立即耳毒性损伤后减少。此观察，结合了高水平的NOTCH表达，表明Notch信号是在正常的椭圆囊tonically活性，而这是由毛细胞死亡中断。我们也注意到在HES5 EX- PRESSION浸在24 -72 H间在我们原来的时间过程（图7A）。因此，我们在6小时的时间间隔（图7B 54，60和66小时）研究此的更多细节。 HES5表达显着地在 - 跨越的时间过程的折痕和出现这样做在一个振荡保守党方式。一些HES基因是已知的内自然振荡网

41、络（别所等，2001起作用。Hirata等人，2002）。图基因网络的聚类的数据内6.实施例。甲，推定的毛细胞特异性基因之间的相互作用的网络。如材料和方法中所述探查和分析：从聚类分析所有526毛细胞特异性基因名称被上传到克。这个数字只包括检测地表达于再生时间过程的基因。红色圆圈表示526推定的毛细胞特异性输入组内的基因。红色线表示那些基因/基因产物之间的相互作用。蓝色圆圈表示差异表达子集内的其他基因。黑色圆表示基因是detect-能够但不差异表达。黑线表示基因/基因产物之间的互操作。乙，簇13和15（图8）显示出在表达一个浸在120小时内的一些转录因子基因之间的相互作用的网络。只有这包括检测地

42、EX-在再生时间过程按下基因。颜色编码如在不同的红色基因差异表达的这些集群转录因素。HES5表达出现在48 -72 H间内下降。这对应于用于表型转换的时间框架并与毛细胞标记表达的中间峰值良好相关。一个令人惊讶的发现是由HES7基因（图7B）显示出基因表达的紧密paral- LEL图案。该基因在体节形成了关键作用振荡（Niwa等，2011），但从来没有被调查或涉及内耳DE-velopment。它被表示在一个10倍水平低于HES5在我们的数据集中，但它也显示出在表达一个平行浸在54小时，并用再生时间过程的末尾> 8倍的增加的表达。 ATOH1，像HES5，是再生转录组内的丰富。它显示出在54

43、和120小时（图7C）的2倍的增加中丰度以上的时间过程与骤降。后者是一致时细胞分裂停止和毛细胞的分化发生的时间段。 ATOH1这种表达模式是高度相关的HEYL基因的表达（毛毛/带YRPW主题类相关的增强，分割的）。此coexpres-锡永以前尚未描述的和我们的观察表明，这两种基因的bHLH一个可进行固件上游coregulator可能的regener-阿婷囊感觉上皮中存在。 ATOH1之一下游目标是HES6（Qian等人，2006年），它表现出比ATOH1大得多倍数变化，达到到CON组trols 10倍的增加的表达相在72小时（图7C）。有趣的是，在54小时下降HES5表达不与任何相应马JOR增

44、加ATOH1表达（HES5的已知阻遏）相关。因此，一些效应（S）比其他ATOH1可能下调HES5表达在这时间点。总之，这些意见强调，涉及Notch信号之前unex- plored组件数协调的基因EX- PRESSION模式。他们还指出，在再生的表型转化一致的48 -72 H窗发生在Notch信号高度间断切换。图7.中的更改NOTCH和FGF信号传导途径的再生过程中的特定组件。 x轴表示个人的时间点。 y轴示出了链霉素处理与对照样品上的log2对数值的倍数变化。 A，ATOH1，DLL1，并HES5在24小时的时间间隔在整个168小时的加速时间当然表达谱。乙，HES5和HES7中，并添加详细的取

45、样的48-72小时期间内，在6小时的时间间隔中的表达概况。 C，ATOH1，HES6和HEYL的表达谱。研发，差异表达胞的FGFs表达谱（FGF12和FGF14）。 E，差异表达的旁分泌的FGFs表达谱（FGF3，FGF16，并且FGF20）。楼FGF19，FGFR1和FGFR3的表达谱。的时间过程。有FGF14和电压门控钠（NAV）通道功能的稳压LATION之间的良好建立的连接（娄等人，2005），因此她建议的regen- erative时间过程的早期阶段，可能是一个时间迅速变化的通道功能的支持细胞。的FGF3，FGF16，FGF20和基因编码的FGFR通过充当经典旁分泌的FGFs。在这些中

46、，FGF16和FGF20最密切相关（伊藤和Ornitz，2008）。这些基因表达的巳燕鸥示于图7E和一些相似之处可以看出。他们都表现出波动，总体呈上升转，分歧的时候课程结束。与此相反，FGF3是downregu-迟来整个再生时间进程，只有在反弹来临的毛细胞分化中的144 -168小时的加速时间周期。传递我们的过滤器的最后FGF是FGF19。这是小户型的有一定距离的一种内分泌MAN-仪（伊藤和Ornitz，2008年）行动能力的FGFs中的一员。该基因0和54小时（图7F），然后显示出在66 -72小时的显着的反弹表达之间急剧下调，随后在96小时和反弹8倍下降expression传送在再次144

47、小时。这个有趣的基因表达式图案平行的两个阶段毛细胞生产的，并表明，这FGF可能是功能性跟进一个有趣的候选人。在图7F所示的最终成分是FGFR1和FGFR3。 FGFR1没有通过我们的过滤器，但只能勉强。它是10倍的转录丰度比FGFR3高，显示的表达模式是差不多的倒数 FGF信号FGF家族和它们的受体是在内耳（Schimmang，2007）发展的关键性调节剂。在FGF基因家族的十二名可检测表达我们的数据。其中，六（FGF3，FGF12，FGF14，FGF16，FGF19和FGF20）是差异表达。 FGF3和FGF20小鼠基因敲除切口导致内耳畸形（Alvarez等，2003;。Hayas

48、hi等，2008年），但FGF12，FGF14，FGF16，FGF19和尚未在毛细胞发育或regenera-调查化。五个描述的FGF受体，我们可以检测4（FGFR1，FGFR2，FGFR3，和FGFRL1）在高于阈值的水平，但仅FGFR3通过我们的过滤器。在图7中，6的FGFs，显示大的变化的基因表达按照其已知的作用模式（伊藤和Ornitz，2008）所示。两（FGF12和FGF14）是指表面上细胞内操作信号分子的胞的FGFs。它们可能有一些功能冗余，但在这种情况下，它们的基因表达模式有很大的不同。 FGF12最初下调（图7D），并恢复了168小时。更戏剧性的格局被视作FGF14，它最初由4倍

49、上调。它减少的丰度，其余下调整个剩余 FGFR3，开始2倍比对照和结束略低高，而FGFR3开始2倍下，结束时间比对照组当然高2倍。虽然复杂，的FGFs的表达模式和这里描述的FGFR建议为FGF信号传输受到在椭圆囊再生的功能性作用。先前的研究已经表明，FGF20与FGFR3（伊藤和Ornitz，2011）优先相互作用。我们的数据表明，这两个FGF20和FGFR3转录脚本是低耳毒性损伤（当prolifera-化水平高）后不久，但是，当再生增殖停止，毛细胞分化发生再后来增加。这些研究结果的一种解释是，FGF20信令可以抑制（而不是促进）支持细胞增殖。为了验证这一点，我们的耳毒性损伤后立即处

50、理培养的椭圆囊（N = 11）与外源性FGF20。培养物保持48小时和增殖指数通过BrdU掺入测定。对照培养没有得到FGF20。结果表明，FGF20显著降低支持细胞增殖（32.5±9.9 BrdU标记细胞/ 10,000微米2中对照样品VS 12.3±9.6标记细胞/ 10,000微米2中FGF20处理的标本，P <0.0001）。差异表达的转录因子的图8.基因表达谱通过的SOM聚为16质心。在212个差异表达的转录因子通过根据他们的表达模式的SOM（百特科）进行分组。每个组的X轴表示个人的时间点。 y轴示出了一个log2对数值的归一化的倍数变化。质心是那么手动分组，

51、根据他们共同的整体表达模式。见差异表达的转录因子基因的结果的图案-J的说明。与此相反，治疗与FGF受体（SU5402）的抑制剂48小时对增殖无显著的影响（33.7±13.2标记的细胞/ 10,000微米2 SU5402处理的培养VS 26.8±6.7标记细胞/ 10,000微米2的控制文化，P = 0.21 ）。值得注意的是，FGF2的AP-折叠术（表达水平，其中没有显示出在再生囊显著的变化）也可以抑制支承细胞增殖（斯蒂芬欧斯特博士等人，2000）。总之，这些数据表明，FGF信号（具体FGF20）可以是再生增殖禽流囊的负调节。差异表达的转录因子的基因之间的差异表达的基因，我

52、们感兴趣的识别是再生节目的潜在关键调节那些编码转录因子。我们已编译的转录因子非冗余列表从三个数据库和最近的出版物（Thomas等，2003;墨西等人，2004，;富尔顿等人，2009; Vaquerizas等人，2009; Ravasi等人，2010; Zhang等人，2012），并进行比较，以我们的差分方式表达的基因列表。以这种方式，我们确定212个差异表达的转录因子（其几的表2中被突出显示）。这些绝大多数从未investi-门控在毛细胞再生或在内耳的发展。 我们接下来衍生自这些基因表达谱16的SOM，以确定不同的表达模式。这些示于图8和落入9的图案，以四个“复杂”的质心（图8J）

53、一种另外的基团。图8A示出富含毛细胞特异性转录因子的重心。这些包括21个基因，并且包括已知的毛细胞特异性转录因子基因（POU4F3，GFI1，和LHX3）等人在本研究中（ANKRD5，DPF3，NFATC1，和SKOR1）鉴定。我们在上面施加于总的基因组中的毛细胞表达的过滤器是相当保守的。因此，在这一组内的附加15转录因子可以表示附加的毛细胞特异性转录因子。图8C富集了基因的平行的基因表达的HES5和HES7型态与具有表2 Partic-此集群ularly有趣列出的表型转化一致变化的表达是BTG1基因，这似乎具有抗增殖和prodifferentiation功能（鲁奥等人，1992;罗迪尔等，1

54、999），干扰素监管托里因子4（IRF4）基因（格罗斯曼等人，1996），和CBP / p300的相互作用反式激活（CITED4;Braganc¸一个等人，2002年），其中没有一个先前已研究或牵连感觉上皮再生。图8I示出了八个基因表现出在时间过程的54 -72 H窗表达的峰。这些是有吸引力的候选人中扮演的角色  表型转换处理。其中最高度EX-在这个类按压两个涉及Notch途径：MAMLD1（主脑状，在Notch信号共活化剂）和RBPJL（类似于RBPJ基因中Notch信号;表2）。图8G示出了群集共享一个明显的下降，在120小时重合细胞周期停止。七这些25个基因

55、，包括NOTCH1，显示证据网络交互和绑在一起的预测138基因是可检测的，在时间过程（图6B）的网络。该网络提供了强有力的CON- firmatory的证据表明，这些基因在功能上连接，并提供了见解它们可能的下游效应。在图8G中所示的基因也是特别值得注意的，因为它们含有七螺旋20环螺旋（HLH）或碱性螺旋环螺旋（bHLH结构）家族的基因存在于差分方式表达的转录因子的列表组成。这些中，五（ATOH1，HEYL，ID4，ID2，和ID1）是高度相关的，并且particu- larly有趣。该ID基因家族由四个HLH paral- OGS（ID1-ID4）。它们编码的bHLH基因的显性失活抑制剂如AT

56、OH1。 ID1，ID4和ID2都显示出与ATOH1表达在囊森索里上皮细胞的再生很强的正相关性。这些基因的启动子附近的区域的初步计算analy-虫病没有发现任何共享DNA序列基序（数据未显示）。尽管如此，协调监管，通过更远端调控元件不可小视。编号基因是最高度EX-压制转录因子基因在再生感觉上皮。这些观察表明，编号蛋白质存在以非常高的水平，并可能在广阔的过量的许多它们的靶标（活化的bHLH蛋白）比较。很显然，ATOH1在再生禽流囊感觉上皮的图案和ID基因表达的高度相关，因此从为鼠标听觉感官EP- ithelia描述非常不同的（Jones等人，2006），其中这些基因似乎表明表达的往复模式。这些观

57、察表明，不同的监管电路可以工作在听觉和ves- tibular上皮调节ATOH1和额外的bHLH基因的活性。讨论这里，我们已经得出的最全面的描述与mRNA转录的日期期间毛细胞再生。我们以前这个过程的研究（Hawkins等，2007）只注重再生的第一个48小时，并仅根据转录因子基因（其中许多在当时并没有明确的鸡同源物）。总共在这些早期的表达谱确定87转录因子基因重叠本研究。显然，我们的新的数据集表示极大的扩展，更完整，准确，高度复杂的遗传工具箱感官再生调查，以及与非再生哺乳动物内耳比较。特别是，在本研究中，我们强调的图案和良好的相关性与regen- erative感觉上皮的三种表型的基因表达的途

58、径; DNA复制/细胞周期控制，phe- notypic转换，和再生增殖。我们还确定了我们预测富集用于影响诸如细胞凋亡，RNA加工，和毛细胞转录（图1）的部件的操作过程的基因的其他图案。在后一种情况下，我们通过测定在此子集由不组化三个随机选择的基因的毛细胞特异性测试了我们的直接预测。正如预测的那样，所有这些表明毛细胞的特异性。从我们的数据令人惊讶的发现是对面这个时间过程中发生的事件的高度punc- tuated性质。 DNA复制和细胞周期组分中的表达出现相当同步，并提供对基因表达式是高度诊断模式。同样，pheno- typic转换过程似乎发生在48 -72小时的加速时间周期，并有可能

59、反映在表达的许多基因在这个时间窗口，特别是许多的Notch信号的已知部件高度动态的模式。高水平prolif-关合作的椭圆囊观察表明，大多数新毛细胞通过细胞分裂产生，而不是通过表型转换。因此，完全特定于新毛细胞群在这个时间窗口信号出现轻微若这二lution效果没有考虑。考虑到这一点，如果从60小时至72小时整体增加2倍于ATOH1表达是特定毛细胞，那么这将反映这种转录因子的一个非常大的电感和灰。在同一方面，在HES5的变化（认为是一种支持细胞标记物），如果它们发生在所有支持细胞在这同一时间帧，与ATOH1相比会相对较小。这还有待观察额外的动态表达的基因，这个时间间隔商标是否支持细胞，新的毛细胞或细胞亚群。我们预计，这些资源将被证明立即有用成分的来源被敲减或过表达分析系统测试（阿尔瓦拉多等，2