第七章 预处理和固液分离技术

1、 预处理及固预处理及固- -液液 分离技术分离技术第七章第七章学习目标学习目标n知识要求n 掌握去除杂蛋白和金属离子的方法和原理；掌握影响过滤速度的因素及改进过滤性能的方法；掌握常用细胞破碎的方法，各种方法的优缺点和适用范围。n 了解预处理的目的和方法，了解发酵液过滤特性。n能力要求n 熟练掌握去除发酵液中杂蛋白和金属离子的操作技能。n 学会包涵体的破碎技术。第一节第一节 发酵液过滤特性的改变发酵液过滤特性的改变，发酵液预处理和固发酵液预处理和固- -液分离液分离下游技术下游技术生物分离过程的一般流程生物分离过程的一般流程预处理和固液分离内容预处理和固液分离内容固液分离固液分离发酵液发酵液胞外

2、胞外上清液上清液/滤液滤液预处理预处理提取生化物质的第一步，分两部分：提取生化物质的第一步，分两部分：胞内胞内富集细胞富集细胞第一节第一节 发酵液过滤特性的改变发酵液过滤特性的改变，发酵液预处理和固发酵液预处理和固- -液分离液分离n 发酵液成分很复杂，包含菌（细胞）体，胞内发酵液成分很复杂，包含菌（细胞）体，胞内外代谢产物，及剩余的培养基残分等。外代谢产物，及剩余的培养基残分等。n 目标物质浓度通常很低，杂质较多，生物物质目标物质浓度通常很低，杂质较多，生物物质一般又极不稳定。一般又极不稳定。一、发酵液过滤特性的改变一、发酵液过滤特性的改变n发酵产物浓度较低，大多为发酵产物浓度较低，大多为1

3、-10%1-10%n悬浮物颗粒小，细胞的相对密度与培养液相似悬浮物颗粒小，细胞的相对密度与培养液相似n可压缩性可压缩性n液相粘度大，大多为非牛顿型流体液相粘度大，大多为非牛顿型流体n性质不稳定，易受空气氧化、微生物污染、蛋白性质不稳定，易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用影响酶水解等作用影响n悬浮状态稳定：双电层、水化膜、布朗运动悬浮状态稳定：双电层、水化膜、布朗运动二、发酵液的预处理二、发酵液的预处理目的：目的：n 改变发酵液的物理性质，促进从悬浮改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离液中分离固形物的速度，提高固液分离效率；效率；n 分离菌体和其它悬浮颗粒，

4、除去部分分离菌体和其它悬浮颗粒，除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于提取和精制后继各工序的顺利进行。提取和精制后继各工序的顺利进行。二、发酵液的预处理二、发酵液的预处理（一）改变发酵液的过滤特性（一）改变发酵液的过滤特性()LmCdQA pdtRRA-过滤面积，过滤面积，p-操作压力，操作压力，L-滤液粘度，滤液粘度，Rm-介质阻介质阻力，力，RC-滤饼阻力。滤饼阻力。二、发酵液的预处理二、发酵液的预处理（一）改变发酵液的过滤特性（一）改变发酵液的过滤特性1.降低液体粘度降低液体粘度 加水稀释法加水稀释法 升高温度升高温度 加热加热2 2）加热使蛋白质变

5、性凝固）加热使蛋白质变性凝固 变性蛋白质的溶解度小变性蛋白质的溶解度小。如柠檬酸发酵液加热至。如柠檬酸发酵液加热至8080以上，可使蛋白质变性以上，可使蛋白质变性凝固，过滤速度加快。凝固，过滤速度加快。 只适用于只适用于对热较稳定对热较稳定的的液体。注意加热温度与时间液体。注意加热温度与时间，不影响产物活性和细胞的，不影响产物活性和细胞的完整性。完整性。加热是发酵液预处理最简单最常用的方法。加加热是发酵液预处理最简单最常用的方法。加热能改善发酵液的操作特性。热能改善发酵液的操作特性。麦芽汁的黏度麦芽汁的黏度-温度曲线。温度曲线。（一）改变发酵液的过滤特性（一）改变发酵液的过滤特性2.调节调节p

6、H pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节当调节pH值可改善其过滤特性。值可改善其过滤特性。u细胞细胞( (碎片碎片) )及某些胶体物质在某个及某些胶体物质在某个pHpH值下也可能趋于絮凝值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。u调节发酵液的调节发酵液的pHpH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法。大幅度改变法。大幅度改变pHpH还能使蛋白质变性凝固。还能使蛋白质变性凝固。u通过调整通过调整pHpH值改变膜过滤中易吸附分子的电荷性质，可减值改变

7、膜过滤中易吸附分子的电荷性质，可减少膜堵塞和污染；少膜堵塞和污染；u影响离子型絮凝剂的电离度。影响离子型絮凝剂的电离度。0020040060061218pH4.6pH4.2pH3.8pH2.8FiltrateVolume,cm3Time,minutesFigTheeffectonfiltratevolumeofpH3.凝聚与絮凝凝聚与絮凝 凝聚凝聚: :是指在是指在电解质电解质作用下，由于胶粒之间双电层电作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，胶体粒子间因相互碰撞而排斥作用降低，电位下降，胶体粒子间因相互碰撞而产生凝集（产生凝集（1mm1mm左右）的现象。左右）的现象。絮凝絮凝:

8、:是指在某些是指在某些高分子絮凝剂高分子絮凝剂存在下，基于桥架作存在下，基于桥架作用，当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同用，当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联接时，形成粗大的絮凝团的胶粒表面上，产生桥架联接时，形成粗大的絮凝团（10mm10mm）的过程，是一种以物理的集合为主的过程。）的过程，是一种以物理的集合为主的过程。 （一）改变发酵液的过滤特性（一）改变发酵液的过滤特性凝聚：胶体粒子在中性盐促进下脱稳相互聚集成凝聚：胶体粒子在中性盐促进下脱稳相互聚集成大粒子（大粒子（1mm1mm）机理：机理：1）中和粒子表面电荷中和粒子表面电荷 2 2）消除双电层

9、结构）消除双电层结构3 3）破坏水化膜）破坏水化膜凝凝 聚聚 Coagulation因合并而沉降因合并而沉降n 发酵液中菌体表面带有负发酵液中菌体表面带有负电荷，由于静电引力使溶电荷，由于静电引力使溶液中反离子被吸附在其周液中反离子被吸附在其周围，在界面上形成了双电围，在界面上形成了双电层。层。n 正离子同时受到使它们均正离子同时受到使它们均匀分布的热运动影响，具匀分布的热运动影响，具有离开胶粒表面的趋势。有离开胶粒表面的趋势。胶体双电层结构两种相反作用力下，双电层分裂成两部：两种相反作用力下，双电层分裂成两部：n1 1）吸附层或）吸附层或sternstern层；层；2 2）扩散层。）扩散层。

10、形成了扩散双电层的结构模型形成了扩散双电层的结构模型( (Gouy-Chapman-Stern model) )。胶体双电层结构胶体双电层结构n常用的凝聚剂电解质有：常用的凝聚剂电解质有：硫酸铝硫酸铝 Al2(SO4)318H2O（明矾）；（明矾）；氯化铝氯化铝 AlCl36H2O;三氯化铁三氯化铁 FeCl3;硫酸亚铁硫酸亚铁 FeSO47H2O ；石灰；石灰；ZnSO4；MgCO3Al3+ Fe3+ H+ Ca2+ Mg2+ K+ Na+ Li+（一）改变发酵液的过滤特性（一）改变发酵液的过滤特性n 絮凝絮凝：大分子聚电解质将胶体粒子交联成大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状，形成絮凝团的过

11、程网状，形成絮凝团的过程机理机理：架桥作用：架桥作用n 采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。液较易分离。絮絮 凝凝 flocculation高分子絮凝剂的吸附架桥作用高分子絮凝剂的吸附架桥作用 聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点l 用量少，一般以用量少，一般以mg/L计量；计量；l 絮凝体粗大，分离效果好；絮凝体粗大，分离效果好；l 絮凝速度快；絮凝速度快；l 种类多，适用范围广种类多，适用范围广。聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点：聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点：存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺

12、，用于食品和医药工业时应谨慎。于食品和医药工业时应谨慎。目前最常见：目前最常见：聚丙烯酰胺类聚丙烯酰胺类絮凝剂絮凝剂n对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理，单独使用可达到较好产生吸附桥架的双重机理，单独使用可达到较好絮凝效果；絮凝效果；n对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果。凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果。n这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。这种包括凝

13、聚和絮凝机理的过程，称为混凝。 混混 凝凝絮凝的影响因素絮凝的影响因素n 发酵液的性质（细胞浓度，表面电荷）；发酵液的性质（细胞浓度，表面电荷）；n 絮凝剂的浓度，最佳用量为粒子表面积约有一絮凝剂的浓度，最佳用量为粒子表面积约有一 半被聚合物覆盖；半被聚合物覆盖；n 絮凝剂的分子量；絮凝剂的分子量；n pH pH 控制；控制；n 搅拌速度。搅拌速度。n 常用的凝聚剂电解质有：常用的凝聚剂电解质有：硫酸铝硫酸铝 Al2(SO4)318H2O（明矾）；（明矾）；氯化铝氯化铝 AlCl36H2O;三氯化铁三氯化铁 FeCl3;硫酸亚铁硫酸亚铁 FeSO47H2O ；石灰；石灰；ZnSO4；MgCO3

14、（一）改变发酵液的过滤特性（一）改变发酵液的过滤特性4.加入助滤剂（filteraids） n 一种不可压缩的多孔微粒，一种不可压缩的多孔微粒，n 在发酵液中加入固体助滤剂在发酵液中加入固体助滤剂，则菌体可吸附于助滤剂微，则菌体可吸附于助滤剂微粒上，助滤剂就作为胶体粒粒上，助滤剂就作为胶体粒子的载体，均匀地分布于滤子的载体，均匀地分布于滤饼层中，降低了滤饼的可压饼层中，降低了滤饼的可压缩性，减小了过滤阻力。缩性，减小了过滤阻力。n 常用的助滤剂是硅藻土，其常用的助滤剂是硅藻土，其次是珍珠岩粉、活性炭、石次是珍珠岩粉、活性炭、石英砂、石棉粉、纤维素、白英砂、石棉粉、纤维素、白土等。土等。（一）改

15、变发酵液的过滤特性（一）改变发酵液的过滤特性u1 1）加入反应剂与某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀）加入反应剂与某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀, ,生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，又能生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，又能使蛋白质凝固，过滤性能上升，沉淀本身可作为助滤剂使蛋白质凝固，过滤性能上升，沉淀本身可作为助滤剂. .如在如在新生霉素发酵液中加入新生霉素发酵液中加入CaClCaCl2 2和和NaNa3 3POPO4 4，生成，生成CaCa3 3(PO(PO4 4) )2 2沉淀。沉淀。u发酵液中含有不溶性多糖物质时，用酶将其转化为单糖，以发酵液中含有

16、不溶性多糖物质时，用酶将其转化为单糖，以提高过滤速率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前提高过滤速率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入加入0.025%0.025%的淀粉酶，搅拌的淀粉酶，搅拌30min30min后，再加后，再加2.5%2.5%硅藻土助滤剂，硅藻土助滤剂，可提高过滤效率可提高过滤效率5 5倍。倍。（一）改变发酵液的过滤特性（一）改变发酵液的过滤特性发酵液中的杂质发酵液中的杂质高价无机离子（高价无机离子（CaCa2+2+、MgMg2+2+、FeFe2+2+）杂蛋白杂蛋白u常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞，影响过滤效率。常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞，影响过滤

17、效率。u采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，u有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化，使两相分离不清。有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化，使两相分离不清。因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。（二）发酵液的相对纯化（二）发酵液的相对纯化u 在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。高价无机离子的去除方法高价无机离子的去除方法 Ca2+ 草酸、草酸钠，草酸、草酸钠，形成草酸钙沉淀形成草酸钙沉淀（注（注意回收草酸）意回收草酸）

18、 ； Mg2+三聚磷酸钠，三聚磷酸钠，形成三聚磷酸钠镁可形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；溶性络合物； Fe2+ 黄血盐，黄血盐，普鲁士兰沉淀普鲁士兰沉淀杂蛋白的去除方法杂蛋白的去除方法沉淀法吸附法变性法杂蛋白去除杂蛋白去除-沉淀法沉淀法 precipitationA 等电点沉淀法等电点沉淀法 （isoelectric precipitation ）蛋白质的等电点大都在酸性范围内蛋白质的等电点大都在酸性范围内(pH4.0(pH4.05.5)5.5)，调节发，调节发酵液的酵液的pHpH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法。到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法。B. 酸碱调节，使蛋白质与离子形成沉

19、淀酸碱调节，使蛋白质与离子形成沉淀l在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子形成沉淀，如三氯乙在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子形成沉淀，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、苦味酸盐等；酸盐、水杨酸盐、苦味酸盐等；l在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子形成沉淀，如在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子形成沉淀，如Ag+Ag+、CuCu2+2+、ZnZn2+2+、Fe Fe 3+3+等。等。杂蛋白去除杂蛋白去除- 吸附法吸附法 adsorption。n 四环类抗生素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的协四环类抗生素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾同作用生成亚铁氰化锌钾K K2 2ZnZn3 3Fe(CN)Fe(CN

20、)5 5 2 2的胶状的胶状沉淀来吸附蛋白质，利用此法除蛋白质已取得很沉淀来吸附蛋白质，利用此法除蛋白质已取得很好的效果。好的效果。n 在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢二在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢二钠，这两者本身生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌钠，这两者本身生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，体及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，从而加快了过滤速度。从而加快了过滤速度。杂蛋白去除杂蛋白去除-变性变性 Denaturation 蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变性。变性蛋白质溶解度较

21、小。性。变性蛋白质溶解度较小。l 加热，加热，l 大幅度调节大幅度调节pHpH值，值，l 加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。不足之处：不足之处：加热法只适合于对热较稳定的目的产物；加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端极端pHpH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；a.a. 有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。 三、固三、固- -液分离液分离n （一）离心分离（一）离心分离n 离心分离是利用转鼓高速转动所产生的离心力，使悬浮液、乳浊

22、液离心分离是利用转鼓高速转动所产生的离心力，使悬浮液、乳浊液分离或浓缩的分离的过程。它具有分离速率快、分离效率高、液相分离或浓缩的分离的过程。它具有分离速率快、分离效率高、液相澄清度好等优点。但离心设备投资大、能耗高，连续排料时，固相澄清度好等优点。但离心设备投资大、能耗高，连续排料时，固相干度不如过滤设备。干度不如过滤设备。n （二）过滤（二）过滤n 过滤是指借助于一种能将固体物截留而让流体通过的多孔介质，将过滤是指借助于一种能将固体物截留而让流体通过的多孔介质，将固体物与液体分离的单元操作。过滤技术可除去发酵液中的固体杂固体物与液体分离的单元操作。过滤技术可除去发酵液中的固体杂质（如细菌菌

23、丝）达到固液分离，为进一步分离纯化操作提供较澄质（如细菌菌丝）达到固液分离，为进一步分离纯化操作提供较澄清的溶液。清的溶液。n （三）固液分离的其它方法（三）固液分离的其它方法n 双水相萃取、吸附法、膜处理、絮凝等均可达到固液分离的目的。双水相萃取、吸附法、膜处理、絮凝等均可达到固液分离的目的。以上方法各有特点，通常是几种方法综合使用，以提高发酵液预处以上方法各有特点，通常是几种方法综合使用，以提高发酵液预处理效率。理效率。 生物分离过程的一般流程生物分离过程的一般流程第二节第二节 细胞破碎技术细胞破碎技术 细胞破碎技术是利用外力破坏细胞膜和细胞细胞破碎技术是利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞

24、内容物包括目标产物释放出来。壁，使细胞内容物包括目标产物释放出来。微生微生物物革兰氏革兰氏阳性细菌阳性细菌革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌酵母菌酵母菌真菌真菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要主要组成组成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(3

25、0-40%)(30-40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%)脂类脂类(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂类脂类蛋白质蛋白质细胞壁的组成和结构细胞壁的组成和结构一、细胞破碎方法分类一、细胞破碎方法分类机械破碎机械破碎捣碎法研磨法匀浆法超声法 物理破碎物理破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎化学破碎有机溶剂：表面活性剂：酸碱酶促破碎酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的

26、外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理( (一一) )机械法机械法机械破碎法又可分为机械破碎法又可分为n1.组织匀浆器组织匀浆器 n2.研磨研磨 n3.高速组织捣碎机高速组织捣碎机 n4.高压匀浆器高压匀浆器 n5.高速珠磨机高速珠磨机 n6.超声波震荡法超声波震荡法 1. 1.

27、组织匀浆器组织匀浆器 组织匀浆器由一内壁磨砂的玻璃管和一根一端为球状（表组织匀浆器由一内壁磨砂的玻璃管和一根一端为球状（表面磨砂）的杆组成。面磨砂）的杆组成。 匀浆器的内杆球体与管壁之间只有匀浆器的内杆球体与管壁之间只有十分之毫米，组织破碎程度高，机械切力对生物大分子破十分之毫米，组织破碎程度高，机械切力对生物大分子破坏较少。制造匀浆器的材料除玻璃外，也可用不锈钢、硬坏较少。制造匀浆器的材料除玻璃外，也可用不锈钢、硬质塑料等。大多数情况下，用这种方法可切碎较薄的动物质塑料等。大多数情况下，用这种方法可切碎较薄的动物组织膜，但不易打碎植物和细菌的细胞。组织膜，但不易打碎植物和细菌的细胞。2.2.

28、 研磨研磨用研钵和研杵进行，对细菌及植物材料应用较多，它适用于用研钵和研杵进行，对细菌及植物材料应用较多，它适用于细胞器的制备，如线粒体、溶酶体、微粒体等。一些难以细胞器的制备，如线粒体、溶酶体、微粒体等。一些难以破碎的细胞或微生物菌体则可加一些研磨剂，如玻璃粉、破碎的细胞或微生物菌体则可加一些研磨剂，如玻璃粉、石英砂、氧化铝、硅藻土等，破壁效果更好。石英砂、氧化铝、硅藻土等，破壁效果更好。3.3.高速组织捣碎机高速组织捣碎机 捣碎机由调速器、支架、马达、旋转捣碎机由调速器、支架、马达、旋转刀叶、有机玻璃筒等部分组成。操作刀叶、有机玻璃筒等部分组成。操作时，先将材料配成稀糊状液，置于筒时，先将

29、材料配成稀糊状液，置于筒体中约占体中约占1/3体积，盖上盖子。开动体积，盖上盖子。开动马达后，逐步加速至所需速度，转速马达后，逐步加速至所需速度，转速最高可达最高可达10000r/min。操作时温度。操作时温度会迅速升高，需在圆筒周围放冰冷却会迅速升高，需在圆筒周围放冰冷却。高速组织捣碎机适宜于动物内脏组。高速组织捣碎机适宜于动物内脏组织、植物肉质组织、柔嫩的叶和芽等织、植物肉质组织、柔嫩的叶和芽等材料的破碎。材料的破碎。 4.4.高压匀浆器高压匀浆器高压匀浆器由高压泵和匀浆阀组成。高压匀浆器由高压泵和匀浆阀组成。细胞悬浮液自高压室针细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度形阀喷出时，每秒速度

30、高达几百米，高速喷出高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程这一系列高速运动过程中经历了高速剪切、碰中经历了高速剪切、碰撞及压力骤降，造成细撞及压力骤降，造成细胞破碎。胞破碎。l升高压力有利于破碎升高压力有利于破碎减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。但但p p大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明大到一定值时对匀浆器的磨损增

31、加，也有实验表明p p超生一定值时，超生一定值时，R R增加但很慢。增加但很慢。在工业生产中，通常采用的压力为在工业生产中，通常采用的压力为555570Mpa70Mpa。l破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。上容易破碎。影响高压匀浆器细胞破碎因素影响高压匀浆器细胞破碎因素高压匀浆法适用的范围高压匀浆法适用的范围大规模细胞破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法高压匀浆

32、法适用的范围：高压匀浆法适用的范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎；酵母和大多数细菌细胞的破碎；料液细胞浓度可以很高，料液细胞浓度可以很高，20%20%左右。左右。不宜使用高压匀浆法。不宜使用高压匀浆法。易造成堵塞的团状或丝状真菌，易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包涵体的基因工程菌（因包含体坚硬，易含有包涵体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）损伤匀浆阀）5.5.高速珠磨机高速珠磨机 u珠磨是常用的方法u细胞悬浮液与极细的玻璃细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于研磨剂（直径小于1mm1mm）一）一起快速搅拌

33、或研磨，研磨起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。碎，释放出内含物。u在工业规模的破碎中，常在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机采用高速珠磨机高速珠磨机工作原理高速珠磨机工作原理l 磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动；转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动；l 细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起l 在出口处，旋转园盘和出口平在出口处，旋转园盘和出口平板之间的

34、狭缝很小，可阻挡玻板之间的狭缝很小，可阻挡玻离小珠，使不被料液带出。离小珠，使不被料液带出。l 由于操作过程中会产生热量，由于操作过程中会产生热量，故磨室还装有冷却夹套，以冷故磨室还装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻离小珠。却细胞悬浮液和玻离小珠。6.6.超声波震荡法超声波震荡法 n 超声波震荡法利用超声波振荡器发射的超声波震荡法利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。的超声波探头处理细胞悬浮液。n 超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。n 超声波的细

35、胞破碎效率与细胞种类、浓度和超超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。声波的声频、声能有关。超声波破碎的机理超声波破碎的机理JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机(一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation),cavitation),(液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。而使细胞破碎。(操

36、作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。外部冷却的容器中进行。(间歇操作。间歇操作。超声波破碎的适用范围超声波破碎的适用范围 超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。的破碎。 一般杆菌比球菌易破碎，一般杆菌比球菌易破碎，G-G-细菌比细菌比G+G+细菌易破碎，对细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。酵母菌的效果较差。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。质失活。 超声波破碎的有效能量利用率极低超声波破碎的有效能量利用率

37、极低 由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但。（二）非机械破碎方法（二）非机械破碎方法1 .1 .物理法物理法 反复冻融反复冻融 冷热交替冷热交替 渗透压冲击渗透压冲击 干燥法干燥法2.2.化学法溶胞化学法溶胞3.3.酶解酶解 自溶法自溶法 外加酶法外加酶法其中酶法和化学法溶胞应用最广其中酶法和化学法溶胞应用最广。反复冻融法反复冻融法 将细胞放在低温下冷冻（约将细胞放在低温下冷冻（约-15-15），然后在），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。室温中融化，反复多次而达到破壁作用。一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增一方面能使细胞膜的疏水键

38、结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。蛋白质变性。 冷热交替法冷热交替法将细胞投入到沸水中，将细胞投入到沸水中，90左右维持数分钟，左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，可破碎绝大部立即置于冰浴中使之迅速冷却，可破碎绝大部分细胞。从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时分细胞。从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可

39、使用这种方法。可使用这种方法。渗透压冲击法渗透压冲击法 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，n将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 n仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞

40、壁预先用仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。对革兰氏阳性菌、真菌、植物细胞不适用。对革兰氏阳性菌、真菌、植物细胞不适用。使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。提出来。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-3025-30的气流中

41、吹干；的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。真空干燥多用于细菌。冷冻干燥适用于不稳定的生化物质冷冻干燥适用于不稳定的生化物质缺点是条件变化较剧烈，容易引起蛋白质或其它组织变性。缺点是条件变化较剧烈，容易引起蛋白质或其它组织变性。干燥法干燥法气流干燥气流干燥真空干燥真空干燥喷雾干燥喷雾干燥冷冻干燥冷冻干燥某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。化学法化学法该法取决于化

42、学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。 有机溶剂有机溶剂 能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。内物质被释放出来。有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 细胞破碎常用的表面活性剂：细胞破碎常用的表面活性剂：十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS，阴离子型）；。，阴离子型）；。非离子型如非离子型如Triton X-100Triton X-100和吐温（和吐温（TweenTween）等）等对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂

43、，破坏对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。表面活性剂表面活性剂无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解透性增加或溶解EDTAEDTA螯合剂螯合剂处理处理G-G-细菌，对细胞壁外层有破坏作用。细菌，对细胞壁外层有破坏作用。G-G-细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子细菌的壁外

44、层结构通常靠二价阳离子CaCa2+2+或或MgMg2+2+结合脂多糖结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦和蛋白质来维持，一旦EDTAEDTA将将CaCa2+2+或或MgMg2+2+螯合，大量的脂多糖螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。酸、碱处理法酸、碱处理法n 酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl6mol/L HCl。n 碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来成本低，反应激烈，不具选择性。成本低，反应激烈，不具选择性。

45、 酶解法酶解法 酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。分为：自溶法、外加酶法优点：u专一性强，能选择性地释放产物u发生酶解的条件温和u收率高，细胞外形较完整缺点：缺点：溶酶价格高，溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶) )产物抑制的存在。产物抑制的存在。 只适用于小规模实验室研究只适用于小规模实验室研究 酶解酶解- -自溶法自溶法l 自溶作用是自溶作用是利用生物体自身产生的酶来溶胞，而利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶不需外加其他的酶。l在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种

46、能水在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。l自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。它的自溶酶，以达到自溶目的。l缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。悬浮液粘度增大，过滤速度下降。l自溶法不适用于制备具有活性的核酸或活性蛋白质。自溶法不适用于制备具有活性的核酸或活性蛋白质。 外加酶法外加

47、酶法n 溶菌酶（溶菌酶（lysozyme)lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的聚糖分子的-1,4-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTAEDTA一一起使用。起使用。l放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶，

48、主要成分，所以也能采用溶菌酶，l酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。l植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。纤维素酶和半纤维素酶裂解。（三）包涵体的破碎（三）包涵体的破碎n 包涵体是指异源的重组蛋白在宿主细胞（如原核细胞、酵母或真核系统）中高水平表达，生成的无定形的蛋白质聚集体。n 不具生物活性，但一级结构正确。与可溶形式的蛋白质产物相比，包涵体蛋白具有一定的优势，包括产物浓度高（占细胞总蛋白

49、质的50%），不易被宿主的蛋白酶降解，对宿主细胞的毒性较低等。 机械破碎机械破碎( (高压匀浆、高速珠磨）高压匀浆、高速珠磨）离心提取包涵体离心提取包涵体加变性剂溶解加变性剂溶解除变性剂复性除变性剂复性包涵体制备重组蛋白的工艺路线包涵体制备重组蛋白的工艺路线 目标蛋白的变性溶解目标蛋白的变性溶解 包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。白质变性才能使其形成可溶性的形式。 常用变性剂：常用变性剂： 5-8 mol/L盐酸

50、胍和盐酸胍和6-8 mol/L尿素尿素, 作用：破坏离子间相互作用；作用：破坏离子间相互作用； 表面活性剂如表面活性剂如1-2 SDS，作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。 PH9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少。的碱溶液和有机溶剂，使用较少。影响变性因素：时间、影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和、离子强度、变性剂种类和浓度。浓度。二 非机械法二原理：原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后

51、，和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。过程称复性。复性方法：复性方法：l稀释法除变性剂稀释法除变性剂 加入大量水或缓冲液。加入大量水或缓冲液。l膜分离法除变性剂膜分离法除变性剂 透析、超滤、电渗析。透析、超滤、电渗析。l层析法：凝胶层析，层析法：凝胶层析，高效疏水层析高效疏水层析 目标蛋白的复性目标蛋白的复性 蛋白质复性影响因素：蛋白质复性影响因素：u变性剂浓度变性剂浓度u目标蛋白浓度；目标蛋白浓度；upH和离子强度；和离子强度； u氧化还原条件。氧化还原条件。 还原剂：还原剂： 二硫苏糖醇、二硫苏

52、糖醇、-巯基乙醇、巯基乙醇、还原型谷胱甘肽；还原型谷胱甘肽；氧化剂：氧化剂： 氧化型谷胱甘肽氧化型谷胱甘肽; 碱性下通空气。碱性下通空气。 复性区复性区 多聚物生成区多聚物生成区 絮凝沉淀区絮凝沉淀区盐盐酸酸胍胍浓浓度度mol/L红血球碳酐酶复性操作中变性剂红血球碳酐酶复性操作中变性剂与蛋白质浓度对复性的影响与蛋白质浓度对复性的影响蛋白质浓度蛋白质浓度 mol/L细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。使导电率上升。 直接测定法直接测定法 化合物产量测定法化合物产量测定法 导电率测定法导电率测定法采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞

53、区别开来。采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。色，而受损害的细胞呈亮红色。将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量或活性，并与或活性，并与100%100%破碎率的标准值比较，计算其破碎率。破碎率的标准值比较，计算其破碎率。（一）细胞破碎率的测定（一）细胞破碎率的测定二、破碎效果的评价二、破碎效果的评价00()100%

54、NNYN分类分类作用机理作用机理适用范围适用范围机机械械法法组织匀浆组织匀浆器器固体剪切作固体剪切作用用用于破碎较薄的动物组织膜，但不易打用于破碎较薄的动物组织膜，但不易打碎植物和细菌的细胞。碎植物和细菌的细胞。研钵研钵固体剪切作固体剪切作用用细菌及植物材料应用较多，适用于细胞细菌及植物材料应用较多，适用于细胞器的制备。器的制备。高速组织高速组织捣碎机捣碎机固体剪切作固体剪切作用用操作时温度会迅速升高，适宜于动物内操作时温度会迅速升高，适宜于动物内脏组织、植物肉质组织、柔嫩的叶和芽脏组织、植物肉质组织、柔嫩的叶和芽等材料的破碎。等材料的破碎。高压匀浆高压匀浆器器液体剪切作液体剪切作用用大规模破

55、碎细胞常用设备，可达较高破大规模破碎细胞常用设备，可达较高破碎率，对多种微生物细胞均适用，不适碎率，对多种微生物细胞均适用，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌。合丝状菌和革兰氏阳性菌。高速珠磨高速珠磨机机固体剪切作固体剪切作用用可达较高破碎率，可较大规模操作，大可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难。分子目的产物易失活，浆液分离困难。超声波振超声波振荡法荡法液体剪切作液体剪切作用用最适合实验室规模细胞破碎。对酵母菌最适合实验室规模细胞破碎。对酵母菌效果差，破碎过程升温剧烈，不适合大效果差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作。规模操作。分类分类作用机理作用机理适用范围适用范围

56、非机械法反复冻融法反复冻融法反复冻结反复冻结-融化融化破碎率较低，适用于细胞壁较脆弱的新鲜细破碎率较低，适用于细胞壁较脆弱的新鲜细胞。不适合对冷冻敏感的目的产物，蛋白释胞。不适合对冷冻敏感的目的产物，蛋白释放量不足。放量不足。冷热交替法冷热交替法温度剧烈变化温度剧烈变化适用于从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸。适用于从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸。渗透压冲击渗透压冲击法法渗透压剧烈改渗透压剧烈改变变破碎率较低，常与其它方法结合使用。主要破碎率较低，常与其它方法结合使用。主要适用于不具有细胞壁、细胞壁较脆弱、细胞适用于不具有细胞壁、细胞壁较脆弱、细胞壁预先用酶处理或细胞壁合成受到抑制的细壁预先用酶处

57、理或细胞壁合成受到抑制的细胞的破碎。对革兰氏阳性菌、真菌、植物细胞的破碎。对革兰氏阳性菌、真菌、植物细胞不适用。胞不适用。干燥法干燥法改变细胞膜渗改变细胞膜渗透性透性条件变化剧烈，易引起蛋白质或其它组织变条件变化剧烈，易引起蛋白质或其它组织变性。空气干燥适用于酵母菌，真空干燥适用性。空气干燥适用于酵母菌，真空干燥适用于细菌，而冷冻干燥适用于较不稳定的生化于细菌，而冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质。物质。化学法化学法改变细胞膜渗改变细胞膜渗透性透性有一定选择性，浆液易分离，但释放率较低有一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差。，通用性差。酶溶法酶溶法酶分解作用酶分解作用专一性强，酶解条件

58、温和，浆液易分离，收专一性强，酶解条件温和，浆液易分离，收率高，产品破坏少，不残留细胞碎片。费用率高，产品破坏少，不残留细胞碎片。费用较高，通用性差。常用于实验室研究。较高，通用性差。常用于实验室研究。（三）细胞破碎方法的选择（三）细胞破碎方法的选择 细胞破碎的一般原则：提取的物质在细胞质内，采细胞破碎的一般原则：提取的物质在细胞质内，采用机械方法；在细胞膜附近采用非机械法；提取产用机械方法；在细胞膜附近采用非机械法；提取产物若与细胞膜或细胞壁结合时，采用机械法和化学物若与细胞膜或细胞壁结合时，采用机械法和化学法相结合的方法。适宜的细胞破碎条件应该从高的法相结合的方法。适宜的细胞破碎条件应该从

59、高的产物释放率、低的能耗和便于后步分离、提取这三产物释放率、低的能耗和便于后步分离、提取这三方面进行权衡。方面进行权衡。第三节第三节 沉淀分离纯化技术沉淀分离纯化技术 沉淀法是指改变条件或加入某些沉淀沉淀法是指改变条件或加入某些沉淀剂，降低溶液中溶质的溶解度，使溶质由液剂，降低溶液中溶质的溶解度，使溶质由液相变成无定形固相析出的过程。相变成无定形固相析出的过程。 第三节第三节 沉淀分离纯化技术沉淀分离纯化技术防止蛋白质凝聚沉淀的屏障防止蛋白质凝聚沉淀的屏障u蛋白质周围的水化层蛋白质周围的水化层（hydration shell)hydration shell)，使使蛋白质形成稳定的胶体溶液。蛋白

60、质形成稳定的胶体溶液。u蛋白质为蛋白质为分子间静电排斥作分子间静电排斥作用。用。（存在双电层）蛋白质粒子在水溶液中（存在双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。蛋白质表面的电荷离子或自身基团的电离。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。与溶液中反离子的电荷构成双电层。一、盐析沉淀法一、盐析沉淀法 概述：概述： “盐析盐析”意指在固体物质的水溶意指在固体物质的水溶液中加入高浓度中性盐，固体物质因溶解度液中加入高浓度中性盐，固体物质因溶解度减小而析出的过程。减小而析出的过程。1-100nm盐析法机理盐析