毕业设计有机废水中微生物絮凝剂产生菌的选育

1、唐 山 学 院毕 业 设 计设计题目：有机废水中微生物絮凝剂产生菌的选育 系 别： 环境与化学工程系 班 级： 09石油（2）班 姓 名： 郭伟杰 指 导 教 师： 程 磊 2012年6月1 日 有机废水中微生物絮凝剂产生菌的选育摘 要用平板划线纯化法，从有机废水中分离出5支菌株，以各菌株发酵液对高岭土悬浮液絮凝效果为指标，筛选出1株微生物絮凝剂产生菌。经过形态学特征、生理生化反应初步鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。通过试验对其培养条件进行研究确定了其培养条件的优化组合，即培养时间24h、ph 7.3、温度30，并在该条件下培养后测其发酵液的絮凝率。结果显示絮凝率由优化之前的85%提高到了条件优化后

2、的90.4%。关键词：培养条件 絮凝效果 絮凝率 breeding of flocculant producing microorganism from organic wastewaterabstract five strains were isolated from the sample of organic wastewater collected from pond and artificial environment using the pure culture law. through investigating the flocculating abilities for kao

3、lin clay of culture broth.we found one strain,which had flocculating activity,was finally picked out among them.the strain was identified as bacillu ssubtilus according to its morphological,physiological and biochemical characters. then we did orthogonal experiment to study its culture conditions an

4、d determine the optimum culture conditions,which is culture time 1d, ph 7.5, temperature 30.cultured in this condition and measured its rate of fermentation broth of flocculation.the result showed that the flocculation rate improved from 85% to 90.4% after optimization. key words: culture conditions

5、; flocculation; flocculation rate目 录1 引言11.1 微生物絮凝剂11.2 微生物絮凝剂的絮凝机理31.3 微生物絮凝剂在水处理中的应用42 试验92.1试验所用仪器及材料92.1.1 试验所用仪器92.1.2 试验所用药品92.2试验方法92.2.1 采集有机废水样品92.2.2 分离纯化92.2.3 发酵培养102.2.4 温度对絮凝剂絮凝率的影响102.2.5 培养基初始ph值对絮凝剂产生速率的影响102.2.6 细菌生长周期的测定112.2.7 不同接种量对菌体产絮凝剂的影响112.3 正交试验分析112.3.1 菌种的鉴定133 结论14谢辞15参

6、考文献16外文资料17唐 山 学 院 毕 业 设 计1 引言1.1 微生物絮凝剂絮凝剂又称沉降剂，是一类可使液体中不易沉淀的固体悬浮颗粒（粒径10-310-7cm）凝聚、沉淀的物质1。目前实际使用的絮凝剂，以无机的聚合氯化铝和有机合成的聚丙烯酰胺最为广泛。我国从20世纪60年代开始研制和应用无机和有机合成高分子絮凝剂，但其使用容易造成二次环境污染1。据有关学者研究表明，老年痴呆与现在广泛使用无机絮凝剂聚合氯化铝有关。聚丙烯酰胺的单体（丙烯酰胺）具有强烈的神经毒性，其在聚合过程中的残留，是一个令人十分担忧的问题。因此，微生物絮凝剂的安全、可生物降解、对人类健康无害、且对环境无二次污染的特点，引起

7、人们极大的兴趣。微生物絮凝剂是指微生物自身产生的具有絮凝活性的次生代谢产物1。絮凝性微生物能使离散微粒（包括菌体细胞自身）之间互相粘附，并能使胶体脱稳，形成絮状沉淀而从反应体系中分离出去。此问题的研究在酵母酿酒工业中已有100多年的历史，高絮凝性微生物可用于处理废水。以这类微生物制成的生物絮凝剂已经上市并有多种牌号，日本在这方面成果卓著。经过驯化筛选或构建出的菌株，自身就可利用废物进行繁殖，在反应体系中发挥作用，在废水脱色方面的优势，比普通絮凝剂更具吸引力2。微生物絮凝剂主要包括利用微生物细胞壁提取物的絮凝剂，利用微生物细胞壁代谢产物的絮凝剂、直接利用微生物细胞的絮凝剂和克隆技术所获得的絮凝剂

8、。从分离纯化得出的微生物菌种中，筛选出高效的生物絮凝剂产生菌，学会利用高岭土悬浮液对所产微生物絮凝剂进行絮凝活性测定，查找影响絮凝剂产生和絮凝活性的几个因素，找出微生物絮凝剂产生和絮凝的最佳条件。本次实验通过从有机废水中分离和筛选出产絮凝剂的细菌，通过发酵液的富集培养，使微生物大量繁殖和增强其稳定性。因为，微生物絮凝剂还可用于高岭土、泥水浆、粉煤灰等水样的处理。所以，本次实验利用细菌制备成的生物絮凝剂处理高岭土浊水，并通过测定处理后高岭土水样的吸光度来测定絮凝率。用高岭土来评价微生物絮凝剂的絮凝效果是实验室常用的方法之一。从有机废水中筛选菌种于牛肉膏蛋白胨培养基上37恒温培养箱中培养24h，在

9、平板上挑取生长旺盛、较有粘性的单个细菌菌落，接种到相应新鲜培养基平板上并将平板倒置于37恒温培养箱中培养，然后摇床发酵将温度设定为30，摇床速度为130 r/min，恒温振荡培养24 、48、72h，得到细菌的预发酵培养液最后筛选出絮凝最高的菌种并进行菌种鉴定。微生物絮凝剂是利用生物技术，从微生物体或其分泌物提取、纯化而获得的一种安全、高效，且能自然降解的新型水处理剂。由于微生物絮凝剂可以克服无机高分子和合成有机高分子絮凝剂本身固有的缺陷，最终实现无污染排放，因此微生物絮凝剂的研究正成为当今世界絮凝剂方面研究的重要课题。在这之中筛选絮凝剂产生菌并提高其絮凝剂产量变得尤为重要，同时也是开发和系统

10、研究微生物絮凝剂关键的第一步。本实验采用常规细菌分离纯化方法，从荷塘污泥中筛选出一株絮凝剂产生菌，通过形态学特征、生理生化反应对该菌株进行鉴定，并对该菌株产絮凝剂的最佳培养条件进行了研究。对产絮凝性物质微生物的研究，最早见诸报道的是1953年，butterfield从活性污泥中分离出1株细菌，该菌的培养液具有一定絮凝能力3。1971年zajic和knetting从煤油中分离出1株棒状杆菌，该菌可分泌对泥水具有絮凝作用的多聚物。1975年，junji nakamura等对214株微生物进行了分离筛选，最终得到19株产絮凝剂的微生物，包括细菌5株、放线菌5株、霉菌8株、酵母菌1株。1985年，hi

11、ronki takagi等对他们分离出的peacilomyces sp.i-1产生的絮凝剂的研究表明，对各种微生物细胞均有絮凝沉淀作用，并且可以除去溶液中几乎所有的悬浮颗粒，如血红细胞、碳粉、纤维素、硅藻土等4。1986年，ryuichiro kurane等发现红平球菌s1(r.erythropolis s1)菌株产生的絮凝剂noc1，能很有效地去除畜禽废水如猪尿和粪便等5。 我国对微生物絮凝剂的研究始于20世纪90年代初期。1994年王镇等筛选到83株絮凝剂产生菌，其中絮凝活性最高的4株分属于 芽胞杆菌属、节细菌属、假单胞菌属、气单胞菌属 6。4株菌在生长过程中均可产生胞外絮凝物质，在最适培

12、养条件下的絮凝剂产量为0.50.9g/l。1998年孟琴等利用其实验室废弃微生物制备出一种生物絮凝剂，分别以bsa溶液、果汁溶液、泥土混浊液为研究对象，其絮凝效果优于作为对照的其它4种常用絮凝剂7。1999年黄民生等用gci培养基从底泥中分离出3株产生高絮凝活性的微生物，所研制出的微生物絮凝剂对高岭土及土壤悬浊液和碱性染料废水均有良好的净化效果。邓述波等从土壤中分离、筛选得到了高效絮凝剂产生菌a9。实验结果表明，a9所产絮凝剂（培养液）的絮凝率随粘性的增加而提高，处理效果明显优于目前常用的聚合铝、聚丙烯酰胺等化学絮凝剂。程金平等经实验得出，培养液中絮凝活性分布及活性菌产生絮凝剂时的最佳条件，并

13、指出微生物絮凝剂是由菌产生的而不是培养液具有絮凝作用。尹华等的实验证明，絮凝剂gs7的絮凝活性与菌生长量有一定的相关性。由此推测，gs7絮凝剂是由菌生物合成的，而不是由菌细胞自溶产生的，这与程金平等的结论一致。他们认为，在废水中加入一定量的二价金属阳离子有利于提高gs7的絮凝效率，显示离子参与了絮凝过程中的凝聚和絮凝作用。柴晓利等从废水、土壤、活性污泥中筛选到2株絮凝剂产生菌。初步确定均属氮单胞菌属。废水絮凝实验表明，该菌种所产絮凝剂可絮凝各种水溶液中的悬浮物质。2001年刘紫娟等从活性污泥中分离筛选到一株产絮凝剂的细菌a25，鉴定为巨大芽胞杆菌bacillus megaterium。絮凝剂的

14、形成与菌体生长同步，均在10h达到最高值。该絮凝剂主要分布在发酵液中，另外还有一部分存在于菌体上。所产絮凝剂对供试的各种悬浮液和菌悬液都具有良好的絮凝效果。胡筱敏等从土壤中分离筛选得到一株能产生高效微生物絮凝剂（mbf）的芽孢杆菌a-9，其有效成份为高分子多糖。絮凝实验结果表明，用mbfa-9处理高岭土悬浮液，效果明显优于其他种类mbf，且不需添加ca2+及al3+等助凝剂，用量也仅为一般mbf用量的0.10.01，处理含泥河水、硫化染料废水、淀粉厂黄浆废水等的去除率，明显高于聚丙烯酰胺等传统的化学絮凝剂8。陶涛等用黑酵母以淀粉水解或葡萄糖为原料发酵产生的水溶性无定型多糖大分子物质普鲁兰（短梗

15、霉多糖），具有较强的絮凝效果。随着水处理技术的发展,絮凝剂的研究和应用越来越受到重视。微生物絮凝剂是某些微生物在特定的培养条件下，生长到一定阶段而产生的有絮凝活性的次生代谢物质，可作为一种新型水处理剂，具有安全、高效、易生物降解等特性。微生物絮凝剂多数相对分子质量较大(104-106)，分离纯化的微生物絮凝剂主要有多聚糖、糖蛋白、糖脂、脂蛋白、dna、rna、纤维素等，其中以多聚糖和糖蛋白类物质占绝大多数。1.2 微生物絮凝剂的絮凝机理微生物絮凝剂在液体介质中主要通过其电荷性质和高分子特性使胶体脱稳、絮凝沉淀、固液分离。研究工作者已经提出多种絮凝机理，其中以“桥联作用”机理最为人们所接受。该学

16、说认为微生物絮凝剂大分子借助离子键、氢键和范德华力，同时吸附多个胶体颗粒,在颗粒间产生“架桥”现象，并形成一种网状的三维结构而沉淀下来。lee等以吸附等温线和电位测定表明，环圈项圈藻pcc-6720所产生的絮凝剂对膨润土絮凝过程是以“桥联作用”机理为基础的。电镜照片显示细菌之间有胞外聚合物搭桥相连，正是这些桥使细胞丧失了胶体的稳定性而紧密聚合并在液体中沉淀下来9。胶体粒子的表面一般带有负电荷，当带有一定正电荷的链状生物大分子或水解产物靠近胶粒表面时，将会中和胶粒表面的一部分负电荷，减少静电斥力，从而使胶粒间因发生碰撞而凝聚。当微生物絮凝剂投加到一定量且可形成小粒聚体时，可以在重力作用下迅速网捕

17、,卷扫水中胶粒而产生沉淀分离，称为“卷扫作用”或“网捕作用”。“卷扫作用”基本上是一种机械作用。此外，还有其它的一些絮凝机理，如粘质学说、酯合学说、荚膜学说等也可解释部分絮凝现象。絮凝的形成是一个复杂的过程，单一的某种机理并不能解释所有的现象，絮凝作用是多种作用的共同结果。絮凝剂分子量大小对其絮凝效果的影响很大，分子量越大，絮凝活性越高。当絮凝剂的蛋白质成分降解后，分子量减小，絮凝活性明显下降。一般线性结构的大分子絮凝剂的絮凝效果较好，如果分子结构是交链或支链结构，其絮凝效果就差。适当提高温度可提高絮凝效率。絮凝物质结构上含有蛋白质或肽链的絮凝剂一般都是热不稳定的，高温可使这些高分子物质空间结

18、构改变，导致变性，从而使絮凝活性下降。而由糖类构成的絮凝剂则是热稳定的，它们对温度不敏感，絮凝剂活性不随温度的改变而改变，或者改变较少。例如r.erythropolis产生的絮凝剂在100的水中加热15min后，其絮凝活性下降50%。微生物絮凝剂的活性随ph值的变化而变化，因为酸碱度的变化影响微生物絮凝剂及其被絮凝物表面电荷、带电状态及中和电荷的能力。在一定的ph值范围内，微生物絮凝剂表现出良好的絮凝活性。不同的絮凝剂对ph值变化所表现的效果也不一样，同种絮凝剂对不同的被絮凝物具有不同的ph初始值要求10。金属离子的种类和浓度对微生物絮凝剂的影响较大。适当浓度的金属离子可以促进微生物絮凝剂分子

19、与悬浮颗粒以离子键结合，从而提高絮凝活性，这对于提高微生物絮凝剂的絮凝活性有重要意义。但是，金属离子的浓度不能过高，否则，由于大量离子占据了絮凝剂分子的活性位置，把絮凝剂分子与悬浮颗粒隔开而抑制絮凝。而不同的絮凝剂，其适合的离子种类有所差异，目前研究较多的有二价离子中的ca2+、mg2+、mn2+等，以及三价离子中的al3+、fe3+等11。1.3 微生物絮凝剂在水处理中的应用杨开等采用微生物絮凝剂普鲁兰和聚合氯化铝复合絮凝的方法，对我国南方低浓度城市污水进行了强化一级处理试验研究。结果表明，在最佳复配比和最佳絮凝动力学条件下，复合絮凝剂对污水浊度、cod、tp、nh3n等指标的去除率分别达到

20、了95%、58%、91%、15%以上，且具有污泥沉降与脱水性能良好、处理费用低等特点。尹华等筛选出的菌株gs7，处理城市污水等实际废水时具有用量少、澄清速度快等特点，浊度去除率达93.5%。现今用活性污泥法去除废水中的cod并非难事，但对于脱色还缺乏比较有效的办法，特别是可溶性色素很难处理。采用微生物絮凝剂noc-1，对墨水、糖蜜废水、造纸黑液、颜料废水等进行的试验表明，处理后上清液呈无色透明。李智良等用p.alcaligenes 8724菌株产生的絮凝剂，在实验室对纸浆黑液和氯霉素等色素较深的废水进行脱色处理，脱色率分别达95%和98%以上。庄源益等用生物絮凝剂对水中染料的脱色进行的大量试验

21、表明，在含有钙离子的条件下，对直接黑染料生产废水稀释液的脱色率达60%左右12。畜禽废水的bod较高，是属于较难处理的一类高浓度有机废水。如猪粪尿废水，采用合成高分子絮凝剂处理效果不好，而采用noc-1微生物絮凝剂加ca2+处理,则效果十分显著，处理后10min废水的上清液变成几乎透明的液体。废水的toc由处理前的8200mg/l变为2980mg/l，去除率达63.7%，浊度由处理前的15.7变为86%，去除率达94.5%。r.erythropoli培养物与一定浓度的钙离子溶液混合后，对该种废水的toc去除率将会更高，同时对总氮也有显著的去除作用12。由于微生物絮凝剂具有安全、无毒的特性，逐渐

22、在食品废水处理中被采用,并达到了满意的效果。如用微生物絮凝剂普鲁兰处理味精废水，其cod和ss的去除率可达到40%左右，其浊度去除率可达99%。邓述波等用mbfa9处理淀粉厂的黄浆废水，无论是悬浮物还是cod的去除率均高于传统的化学絮凝剂pam，且可回收蛋白质成分作饲料。 在鞣革工业废水中加入c-62菌株产生的絮凝剂，浊度去除率可达96%。柴晓利等筛选到的azomonassp.的发酵液对皮革废水的脱色效果也非常明显。在塑料工业中，酞酸醋作为一种增塑剂被广泛应用，所产生的废水中含量较高，因此比较难处理。许多微生物不仅能产生絮凝剂,还能降解有机物，如rhodoccocusn erythropoli

23、s能在以酞酸酣为炭源的培养基上生长，并合成一种酶。该酶将具有不同支链的邻苯二甲酸醋分解成邻苯二甲酸及乙醇，同时产生絮凝剂,达到双重处理效果。电镀废水中的铬，属于重金属，对环境及人体危害较大。田小光等以硫酸盐还原菌培养液为净化剂，可使水中的cr6+含量由44.11mg /l下降为5.365ug/l。水源水中往往含有颗粒物、少量有毒有机物及水中滋生的病原菌等。微生物絮凝剂在给水中去除浊度、病原菌等方面的效率，高于传统的无机及有机絮凝剂，而且用量少，应用范围广，沉淀物滤过性好，饮用后对人体无毒副作用。 aguilaw等在乳化液中加入特定的絮凝剂，在一定程度上可使油水分离。如用alcaligenes

24、latus培养物可以很容易地将棕搁酸从其乳化液中分离出来。试验表明，向100ml的0.25%乳化液中加入10mlalcaligenes latus培养液和1ml聚合氨基葡聚糖，乳化液中形成明显可见的油滴并浮于表面，下层清液的cod值从原来的450mg/l下降为235mg/l，下清液的cod去除率为48%，远好于无机絮凝剂和人工合成的高分子絮凝剂。活性污泥法处理过程中容易发生污泥膨胀，从而影响处理效率。微生物絮凝剂还能迅速消除污泥膨胀，取得良好效果。如甘草制药废水生化处理过程中形成的膨胀性污泥，当在其中添加由红平红球菌制得的微生物絮凝剂noc-1后，污泥的svi很快从290下降到50，消除了污泥

25、的膨胀，恢复了活性污泥的沉降能力。微生物絮凝剂还可以改善污泥的沉降性能。活性污泥处理系统的效率常因污泥沉降性能变差而降低。某些微生物絮凝剂能有效防止污泥解絮，提高处理系统效率，而不会降低有机物去除率。利用絮凝剂对细胞具有优良的沉降性能来去除发酵液中的菌体，可大大减少能耗、降低成本，且操作简单、管理方便。如在酿酒工业中，有絮凝性能的酵母替代没有絮凝性能的酵母可以酿出质量更好的啤酒；另外，在生物乙醇和面包发酵酵母的生产中也应用了这种絮凝剂。用絮凝方法可以提高去除固体物的效率，减少处理时间，有助于降解不稳定生物物质以及节省成本。目前实验室阶段的研究多采用价格昂贵的培养基，例如在noc1的培养基中，作

26、为氮源的酵母膏的价格占noc1生产成本的80。因此必须寻找廉价且易得的物质(如纤维素、秸秆和有机质丰富的污水或废水等)作为微生物絮凝剂产生菌的培养底物，以降低生产成本，促进推动生物絮凝剂的工业化。目前研究重点只在微生物絮凝剂本身的开发上，并未进行复合型微生物絮凝剂的研究。对于复合型的解释为：其一，所采用的菌种不单一，多株菌共同作用产生絮凝剂，且不全是絮凝菌，有用来分解底物的分解菌。其二，底物没有完全分解，在絮凝过程中也能起到一定的促进作用。其三，在应用过程中与一定量的无机絮凝剂或有机高分子絮凝剂配合使用，达到更好的混凝效果。因此今后重点也应放在开发廉价的复合型微生物絮凝剂。mbf工业化生产应用

27、的研究和推广以及降低mbf生产成本已显得十分重要。生物絮凝剂能否得到广泛的应用关键还在于mbf的生产和使用成本的降低，只有成本降低才能从经济上保证生物絮凝剂能被广泛应用。根据不同的废水水质开发出具有针对性的高效微生物絮凝剂，这样既能提高药剂对废水的处理能力又能减少药剂的使用量，从而实现处理成本的降低。进行复配絮凝剂的开发和应用。废水处理中单靠一种絮凝剂很难获得好的处理效果，对絮凝剂进行复配开发使，能大大提高絮凝剂的处理效果，提高絮凝效率，降低处理的费用。开发石油絮凝剂生产和使用的专用设备。目前国内外对絮凝剂生产和使用中基本上都是使用现在的生产工艺设备，如生产中一般是利用工艺废弃菌种进行生产，开

28、发新的絮凝剂生产设备有助于提高絮凝剂的产量和产率，从而实现絮凝剂生产成本的降低。新的处理设备也能提高絮凝剂的处理效率和节省费用 与现在常用的各类絮凝剂相比，同等用量下，微生物絮凝剂对活性污泥的絮凝速度较快，且絮凝物更容易过滤除去。微生物絮凝剂是一类天然无毒的有机高分子化合物，对环境和人类均无毒无害，可以用于食品、医药等行业的发酵后处理。由于微生物絮凝剂主要成分为糖蛋白、粘多糖、蛋白质、纤维素、dna等高分子物质，具有生物优先降解性，可消除对环境造成的二次污染。微生物絮凝剂对多种颗粒以及可溶性色素物质等都具有优良的絮凝能力和脱色能力，可用来处理生活污水和工业废水。对大肠杆菌、酒精酵母等微生物及有

29、混合培养系的活性污泥具有显著的絮凝效果；对无机物如高岭土、火力发电厂的粉煤灰及粉末活性炭等具有优异的絮凝效果。试验研究结果表明，与单纯的化学絮凝沉淀处理相比，可以节省药剂20%以上。由于药剂消耗量减小和空气混合絮凝反应过程的生物氧化作用使污泥量有较明显的降低，从而使污泥固体总量减少20%以上。复配pam有助于进一步降低药剂投加量和降低污泥含水率。在采用空气混合絮凝反应的情况下，处理系统可按3种方式运行：化学絮凝沉淀强化一级处理、化学-生物联合絮凝沉淀强化一级处理、生物絮凝沉淀强化一级处理，以适用不同时期水质水量的变化，运行灵活性明显提高。化学-生物联合絮凝沉淀处理系统通过污泥回流和保持较高的反

30、应池污泥浓度，一方面提高了化学药剂的有效利用率，生成的氢氧化铝或氢氧化铁回流到反应池后可以继续与磷酸盐反应生成沉淀物，降低药剂消耗量；另一方面，污泥回流可以加快絮状物的形成，加上污泥浓度的提高，在沉淀池中迅速形成污泥层，增强网捕过滤作用，可明显改善分散性悬浮物和金属磷酸盐细微沉淀物的固液分离和沉淀去除效果，加快絮凝沉淀物在沉淀池中的沉淀。除此之外，污泥回流还可以提高污泥的密度。在空气混合絮凝反应情况下，增加污泥回流和生物絮凝作用可以明显改善絮凝反应条件，是因为混合絮凝反应的效果取决于gct值(g为速度梯度，c为反应池颗粒污泥为浓度）。化学-生物联合絮凝沉淀运行方式中，反应污泥浓度为1000-4

31、000 mg/l，是无回流絮凝沉淀的5-20倍，复合和絮凝反应得到有效保证。进水有机物浓度和磷浓度较低的情况下，按空气生物絮凝方式运行。增加污泥回流比，生物絮凝和生物氧化作用，投加化学药剂(聚铝)就可满足处理要求，要时可投加少量pam以改善生物絮体的固液分离性能12。此外，它热稳定性较强，而且用量少，使用安全、方便，对环境和人类无毒、无害，产生絮凝剂的微生物绝大多数来自与人类十分密切的土壤中，在分离这些微生物和生产微生物絮凝剂的过程中，对人类不会造成不良后果。我国对于微生物絮凝剂的研究起步较晚。国内较早开展微生物絮凝剂研究的单位有中国科学院成都生物研究所、大连理工大学、南开大学和江苏微生物研究

32、所等，他们是在1993年才开始这方面的研究。最近邓述波等人从土壤中分离筛选得到硅酸盐芽孢杆菌新变种，该菌产生的絮凝剂mbfa9，取得了良好的处理效果12。纵观絮凝剂的现状可以看出，絮凝剂的品种繁多，从低分子到高分子，从单一型到复合型，总的趋势是向廉价实用、无毒高效的方向发展。无机絮凝剂价格便宜，但对人类健康和生态环境会产生不利影响；有机高分子絮凝剂虽然用量少，浮渣产量少，絮凝能力强，絮体容易分离，除油及除悬浮物效果好，但这类高聚物的残余单体具有“三致”效应(致畸、致癌、致突变)，因而使其应用范围受到限制；微生物絮凝剂因不存在二次污染，使用方便，应用前景诱人。微生物絮凝剂将可能在未来取代或部分取

33、代传统的无机高分子和合成有机高分子絮凝剂。微生物絮凝剂的研制和应用方兴未艾，其特性和优势为水处理技术的发展展示了一个广阔的前景。发酵废液或其他废液处理的目的就是减少或消除污染物。微生物絮凝剂无毒无害无二次污染的特性，使其应用前景明显优于普通絮凝剂。如何把微生物絮凝剂提取出来一直是人们的研究方向，但目前微生物絮凝剂的应用还大多处于菌种的筛选阶段，且存在成本较高的缺点，无法适应工业化生产的需要。今后的工作主要集中于高产菌株的筛选、培养条件的优化、微生物絮凝剂的化学组成和理化性质、絮凝剂的基因控制与表达、克隆技术等的研究。发展趋势是降低生物絮凝剂的生产成本。美国已有多种牌号的生物活液销售，用以快速清

34、除下水道淤塞、水体富营养化和污泥膨胀等。这种以高浓度有机无毒废水生产生物絮凝剂，是以废治废、综合利用资源的发展方向12。2 试验2.1试验所用仪器及材料2.1.1 试验所用仪器试验所用主要仪器见表2-1。表2-1 试验所用主要仪器仪器名称规格型号生产厂家高压蒸汽灭菌锅yxq-ls-50<>上海博迅实业有限公司医疗设备厂分光光度计vis-7220北京第二化学仪器厂恒温培养箱zdp-250型上海精宏实验设备有限公司恒温振荡摇床shp-205型上海精宏实验设备有限公司磁力搅拌器85-2a江苏金坛市荣华仪器制造公司电子天平li202b常熟市天兴仪器有限公司超净工作台sw-cj-2p江苏净化

35、型设备有限公司2.1.2 试验所用药品 试验所用药品见表2-2。表2-2 试验所用主要药品药品名称规格生产厂家牛肉膏化学试剂天津市北方医化学试剂厂蛋白胨化学试剂北京奥博星生物技术有限公司氯化钠分析纯唐山市盐业专营有限公司高岭土分析纯天津市光复精细化工研究所琼脂分析纯北京奥博星生物技术有限公司2.2试验方法2.2.1 采集有机废水样品 菌种来源：学校花园水池里有机废水中选取。选定地点后，用锥形瓶采集水样，并记录取样地点、环境及日期。2.2.2 分离纯化从已经采样回来的水样中，量取5ml，在火焰旁放入装有45 ml无菌水的锥形瓶中，振荡，使水中的菌体、芽胞或孢子分散，制成稀释度为10-1的水溶液。

36、另取4支装有9 ml无菌水试管，分别用笔标上：10-2 、10-3、10-4、10-5、10-6，放在试管架上。让制好的10-1溶液静止1 min，取一支1 ml无菌移液管，吸取1 ml悬液注入编号为10-2无菌水试管，并在试管内反复吸取2次，使充分混匀，制成10-2稀释液，取出移液管，插回棉塞以免污染。接着用另外一支无菌移液管，按照前面方法从编号为10-2的试管中吸取1ml稀释液，加入编号为10-3无菌水试管中，混匀后制成10-3稀释液，按上述操作依次制成10-4、10-5、10-6稀释液。 用移液管取稀释度为10-4、10-5、10-6的稀释液各1ml，然后分别加入到制备好的牛肉膏蛋白胨培

37、养平板上，用涂布玻棒把稀释液均匀涂布在平板上，做3个平行样。将平板倒置于37恒温培养箱中培养24h。恒温培养长出细菌菌落后，挑选出生长密度适中、无杂菌污染的培养平板，用接种环挑取一环菌落在细菌的平板培养基表面作连续划线，切勿划破培养基。将培养平板倒置于37恒温培养箱中培养，细菌需培养24h。在平板上挑取生长旺盛、较有粘性的单个细菌菌落，选取5种单菌落分别接种到相应新鲜培养基平板上，并将平板倒置于37恒温培养箱中培养，观察菌落的纯化情况。2.2.3 发酵培养经过纯化后获得细菌菌落，在超净工作台上，选择表面光滑且带粘性的单菌落作为纯种，然后用接种环将各单一菌种接种于装有100 ml牛肉膏蛋白胨液体

38、培养基的250 ml三角瓶中，在摇床中进行发酵培养，利用絮凝率计算公式，絮凝率（）= ，进行计算。（式中：a细菌发酵培养液的吸光度，单位：abs。 b新鲜的牛肉膏蛋白胨液体培养液的吸光度。）2.2.4温度对絮凝剂絮凝率的影响培养温度对絮凝剂絮凝率的影响见表2-3。 表2-3 温度对絮凝剂絮凝率的影响温度（） 26 28 30 32 34 絮凝率% 58.3 72.6 89.7 78.0 50.9 由表2-3可知，当ph、摇床转速一定时，当温度为30 时，絮凝剂絮凝率最大为89%。2530之间时，絮凝剂絮凝率随温度升高而增大，但温度为35时，絮凝剂絮凝率迅速下降。这是因为温度过低或过高时，微生物

39、生长过慢或过快，均不利于絮凝剂的积累。因此，选择培养温度为30。2.2.5 培养基初始ph值对絮凝剂产生速率的影响初始ph值对絮凝剂絮凝率的影响见表2-4。 表2-4 初始ph值对絮凝剂絮凝率的影响ph值 6.4 6.7 7.0 7.3 7.6 7.9絮凝率% 52.1 63.2 79.2 88 56 48ph值对微生物的生长和代谢具有很大的影响。由表2-4可以看出，当温度和摇床转速一定时，ph在6.08.0的范围之间，都有较高的絮凝活性，最佳ph在7.3左右，此时絮凝率达到88%。2.2.6 细菌生长周期的测定在250ml三角瓶内装50ml发酵培养基，ph值为7.3，在30 、130 r/m

40、in 条件下摇床培养，每12h取样一次，测定发酵液絮凝活性。发酵液的絮凝率在12h之前均为负数，可能因为在培养初期，絮凝剂产生菌尚未产生絮凝剂，相反在发酵液或高岭土中某些成分使吸光度增大，导致絮凝率为负值。培养中、后期絮凝活性逐步上升，发酵24h时絮凝率达到86%，之后絮凝率又逐渐下降。 生长周期对絮凝剂絮凝率的影响见表2-5。表2-5 生长周期对絮凝剂絮凝率的影响生长周期 12h 18h 24h 30h 36h 42h絮凝率% -18.3 78.4 86 84 82.1 7.682.2.7 不同接种量对菌体产絮凝剂的影响在发酵培养基中分别以1%、2%、3%、4%、5%、6%的接种量接入种子液

41、，经摇床培养24h后，分别测定各组培养液的絮凝活性，实验结果显示，接种量为3%时，絮凝率较高为86.4%，之后随着接种量的增大，絮凝率降低。因此，接种量也是影响细菌产生絮凝剂的一个因素。由于接种量过大，培养液中细菌的初始浓度高，生长初期细菌生长繁殖则会消耗大量的营养物质，导致絮凝剂的产量下降；而接种量过小，培养液中的细菌浓度低，使得培养周期过长。不同接种量对絮凝剂絮凝率的影响见表2-6。表2-6不同接种量对絮凝剂絮凝率的影响接种量% 1 2 3 4 5 6絮凝率% 54.1 65 86.4 68.2 65.7 63.52.3 正交试验分析正交试验影响因数及其水平见表2-7。表2-7 正交试验影

42、响因数及其水平表水平 因数1温度（） 因数2ph 因数3培养时间(h)1 28 7.0 122 30 7.3 243 35 7.5 48根据三因数三水平的正交试验特点设计l9(33)见正交表2-8。表2-8 正交试验设计表实验 因数1 因数2 因数3组号 温度（） ph 培养时间(h)1 28(1) 7.0(1) 122 28(1) 7.3(2) 483 28(1) 7.5(3) 244 30(2) 7.0(1) 485 30(2) 7.3(2) 246 30(2) 7.5(3) 127 37(3) 7.0(1) 248 37(3) 7.3(2) 129 37(3) 7.5(3) 48正交试验

43、结果记录见表2-9。表2-9 正交试验结果实验 因数1 因数2 因数3 平均絮凝率组号 温度 ph 培养时间 （%）1 1 1 1 742 1 2 3 803 1 3 2 844 2 1 3 865 2 2 2 90.46 2 3 1 887 3 1 2 858 3 2 1 889 3 3 3 86正交试验结果记录见表2-10。表2-10 正交试验结果记录因数1温度 因数2ph 因数3培养时间k1 238 245 252.4k2 264 256 257k3 259 260.4 252k1 79.3 81.6 84.1k2 88 85.3 85.6k3 86.3 86.8 84r 8.7 4.9

44、 1.6由表2-10我们可以知道极差r值由大到小排列为：8.7>4.9>1.6，而极差越大，说明该因数的水平变动时，实验指标的变动越大，即该因数对试验指标的影响最大，所以按极差大小决定因数的主次水平顺序为：温度> ph >培养时间由表2-10可知在上述的培养条件下的絮凝率为90.4%，相比较优化前平均絮凝率提高了5.4%，优化实验取得了一定的效果，即培养时间24h、ph 7.3、温度30。2.3.1 菌种的鉴定在显微镜下鉴定菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色如图2-1，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。该菌可以牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中生活，为枯草芽孢杆菌。2-1菌种在固

45、体培养基上的状态 3 结论经过实验的研究表明：通过试验对其培养条件进行研究确定了其培养条件的优化组合，即培养时间24h、ph 7.3、温度30，并在该条件下培养后测其发酵液的絮凝率。结果显示絮凝率由优化之前的85%提高到了条件优化后的90.4%。经过形态学特征、生理生化反应初步鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。谢辞时间如梭，转眼毕业在即。回想在大学求学的三年，心中充满无限感激和留恋之情。感谢母校为我们提供的良好学习环境，使我们能够在此专心学习，陶冶情操。谨向我的论文指导老师程磊老师致以最诚挚的谢意！我的毕业论文设计是在程磊老师的悉心指导下完成的，他那广博的专业知识，严谨的治学态度和精益求精的为学精神让

46、我留下了深刻的印象，使我受益匪浅。而且她脚踏实地奋斗不息的精神以及乐观积极的生活态度也熏陶着我。程老师在课题的选择、实验方法的制定、实验过程的分析、结果的讨论等方面都给我提出宝贵的建议和意见，对他的感激之情概不能以寸管形容之，谨以此文表达对她由衷的谢意！程老师不仅在学业上言传身教，而且以其高尚的品格给我以情操上的熏陶。本文的写作更是直接得益于他的悉心指点，从论文的选题到体系的安排，从观点推敲到字句斟酌，无不凝聚着他的心血。滴水之恩，当以涌泉相报，师恩重于山，师恩难报。我只有在今后的学习、工作中，以锲而不舍的精神，努力做出点成绩，以博恩师一笑。另外，我必须感谢我的父母。焉得谖草，言树之背，养育之

47、恩，无以回报。他们不仅培养了我对中国传统文化的浓厚的兴趣，让我在漫长的人生旅途中使心灵有了虔敬的归依，而且也为我能够顺利的完成毕业论文提供了巨大的支持与帮助。在未来的日子里，我会更加努力的学习和工作，不辜负父母对我的殷殷期望！我一定会好好孝敬和报答他们！作为他们的孩子，我秉承了他们朴实、坚韧的性格，也因此我有足够的信心和能力战胜前进路上的艰难险阻；也因为他们的日夜辛劳，我才有机会如愿完成自己的大学学业，进而取得进一步发展的机会在此，我特别想对在此期间给予我帮助过的老师和同学。因为是他们的无私帮助才让我较顺利的完成实验。我的毕业设计是在唐山学院生物工程实验室完成的，感谢学院给我们安排了优秀的软件

48、和硬件设施。最后，再次感谢所有给予我帮助的人和培育我的母校唐山学院！参考文献1 余俊棠，唐孝宣，李友荣等，生物工艺学(上册)，化学工业出版社m，2003,6（4）；1-2362 余俊棠，唐孝宣，李友荣等，生物工艺学(下册)，化学工业出版社m，2003,12（1）；23-983 王鹏，生物实验室常用仪器的使用，中国环境科技出版社m，2006.8（7）；3-564 罗大珍，林稚兰，现代微生物发酵及技术教程，北京大学出版社m，2006.9（9）；7-45 5 邓述波.微生物絮凝剂处理淀粉废水的研究.工业水处理m，1999，19（3）；1-2446 四川环境微生物报，西南大学资源环境学院，重庆大学j，

49、1998（2）；9-587 程金平，郑敏.微生物絮凝剂絮凝活性研究.世界地质m，2000,5（4）；29-93 8 尹华，微生物絮凝剂产生菌的筛选，城市环境于城市生态m，2000，8（4）；29-93 9 程树陪，崔益斌.高絮凝性微生物育种生物技术研究.环境科学进展j，1995，25（8）；1-9810 吕德伟.新型生物絮凝剂生物材料的絮凝效果评价.环境化学m，1998，5（9）；49-12011 龚加顺,周红杰等.云南晒青绿毛茶的微生物固态发酵，茶叶科学j,2005,2 （2）；36-5112 yang y, wang z. oilfield produced water treatment

50、 with suface-modified fiber ball media filtration. wat sci technol 2002;46(11-12):16570.13 diaz mp, boyd kg, grigson sj, burgess jg. biodegradation of crude oil across a wide range of salinities by an extremely halotoler-ant bacterial consortium mpd-m, immobilized onto polypropylene fibers. biotechnol bioeng 2002;79(2):14553.14 nadarajah n, singh a, ward op. de-emulsification of petroleum oil emulsion by a mixed bacterial culture. process biochem 2002;37:113541.外文资料microbial flocculants and application in wastewater treatmentindustrial development of wat