液相色谱分析最新课件

1、液相色谱分析最新1第三章第三章 高效液相色谱分析高效液相色谱分析Chapter Three High Performance Liquid Chromatography （HPLC）液相色谱分析最新2 3 31 1 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 一、一、高效液相色谱法高效液相色谱法概述概述 高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLCHPLC）在在经典液相色谱经典液相色谱基础基础上，采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测上，采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的自动化的特点，特点，因此得到迅猛的发

2、展。因此得到迅猛的发展。目前已成目前已成为应用极为广泛的化学分离分析重要手段。为应用极为广泛的化学分离分析重要手段。液相色谱分析最新3 1 1高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较 高速：高速：在分析速度上比经典液相色谱法在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍快数百倍。由由于经典色谱是于经典色谱是重力加料重力加料，流出速度极慢；而高效液相，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了色谱配备了高压输液高压输液设备，流速最高可达设备，流速最高可达 10103 3cmmincmmin-1-1. . 例如例如分离氨基酸，用经典色谱法，柱分离氨基酸，用经典色谱法，柱长约长约170

3、cm170cm，柱径，柱径0.9cm0.9cm，流动相速度为，流动相速度为30cm30cm3 3hh-1-1，需用需用2020多小时才能分离出多小时才能分离出2020种氨基酸；而用高效液相种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需色谱法，只需lhlh之内即可完成；之内即可完成；高效：高效：其柱效可达其柱效可达3 3万塔板万塔板/ /米以上（气相色谱约米以上（气相色谱约2000 2000 塔板塔板/ /米），分离效率大大提高了。米），分离效率大大提高了。液相色谱分析最新42 2高效液相色谱法与气相色谱法的比较高效液相色谱法与气相色谱法的比较 （l l）气相色谱法气相色谱法分析对象只限于气体和沸点较低分析

4、对象只限于气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的的化合物，它们仅占有机物总数的2020。对于占有机。对于占有机物总数近物总数近8080的那些高沸点、热稳定性差、离子型化的那些高沸点、热稳定性差、离子型化合物及摩尔质量大的物质，目前主要采用合物及摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色高效液相色谱法谱法进行分离和分析；进行分离和分析； 液相色谱分析最新5 (2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它与组分不产生气相色谱采用流动相是惰性气体，它与组分不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分动相对

5、组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争，流动相对分离起很大作用，因此，作用的剧烈竞争，流动相对分离起很大作用，因此，可选用不同极性的液体，选择余地大，相当于增加了可选用不同极性的液体，选择余地大，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便；条件提供了极大方便； （3）气相色谱一般都在）气相色谱一般都在较高温度较高温度下进行的，而高效液下进行的，而高效液相色谱法则经常可在相色谱法则经常可在室温条件室温条件下工作；下工作； 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操

6、作严格，这是它的主要这是它的主要缺点缺点。 液相色谱分析最新6 3 32 2 影响液相色谱分离的因素影响液相色谱分离的因素 气相色谱所讨论的气相色谱所讨论的基本概念及基本理论基本概念及基本理论，如：保留，如：保留值，分配系数，分配比，分离度，塔板理论，速率理值，分配系数，分配比，分离度，塔板理论，速率理论等论等与液相色谱一致与液相色谱一致，但液相色谱流动相为液体，其，但液相色谱流动相为液体，其扩散系数，粘度，密度等与气体均有很大的扩散系数，粘度，密度等与气体均有很大的差别差别，都，都将对色谱分析过程产生影响。将对色谱分析过程产生影响。 液相色谱分析最新7 该式与气液色谱速率方程的形式基本一致，

7、该式与气液色谱速率方程的形式基本一致，主要主要区别区别在在液液色谱液液色谱中组分的中组分的纵向扩散项可纵向扩散项可忽略忽略不计不计，影响柱效的，影响柱效的主要因素主要因素是是传质阻力项传质阻力项。 uDdCDdCDdCuDCdHsfsmpsmmpmmdp)(2222液相色谱分析最新82 2、液相色谱传质阻力：、液相色谱传质阻力：SfSDdC2（1）固定相传质阻力项）固定相传质阻力项 与气液色谱中的液相传质基本一致，改善方与气液色谱中的液相传质基本一致，改善方法：采用薄的液膜、小颗粒的填料、使用扩散系法：采用薄的液膜、小颗粒的填料、使用扩散系数大的固定液和低流速。数大的固定液和低流速。液相色谱分

8、析最新9（2）流动相传质阻力项）流动相传质阻力项mpmDdC2A 流动的流动的流动相传质阻力项流动相传质阻力项 分离柱内流动相流速并不均匀，靠近固定相流分离柱内流动相流速并不均匀，靠近固定相流动慢。常数动慢。常数Cm和柱直径、形状和填料结构有关。和柱直径、形状和填料结构有关。液相色谱分析最新10B滞留的滞留的流动相传质阻力项流动相传质阻力项mpsmDdC2 流动相会部分滞留在固定相的孔穴中，组分流动相会部分滞留在固定相的孔穴中，组分要在固定相中保留，先要扩散到滞留区。固定要在固定相中保留，先要扩散到滞留区。固定相粒度小，微孔孔径越大而浅，有利于传质，相粒度小，微孔孔径越大而浅，有利于传质，柱效

9、较高。柱效较高。液相色谱分析最新11 要提高液相色谱的分离效率，装柱的均匀要提高液相色谱的分离效率，装柱的均匀性和减小固定相（目前常用性和减小固定相（目前常用5 m）的粒径是）的粒径是关键。另外，降低流动相的黏度也可加快传质，关键。另外，降低流动相的黏度也可加快传质，提高柱效，流速对板高的影响和气相色谱一样提高柱效，流速对板高的影响和气相色谱一样存在最佳流速。存在最佳流速。 HPLC的最小板高比的最小板高比GC的板高小一个数量的板高小一个数量级，说明其有大得多的柱效。级，说明其有大得多的柱效。液相色谱分析最新12 HPLC中还存在中还存在柱前柱前和和柱后柱后展宽，柱前展宽展宽，柱前展宽和进样有

10、关，要想办法减小柱前样品的扩散。和进样有关，要想办法减小柱前样品的扩散。 柱后展宽和色谱柱和检测器连接管和检测器柱后展宽和色谱柱和检测器连接管和检测器的死体积密切相关，要尽可能减小。的死体积密切相关，要尽可能减小。液相色谱分析最新13一、液液分配色谱法及化学键合相色谱一、液液分配色谱法及化学键合相色谱1 1分离原理分离原理 分离原理基本与分离原理基本与液液萃取液液萃取相同相同，都是根据物质在都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。分配系数。33 高效液相色谱的主要类型液相色谱分析最新14和和气液色谱气液色谱的比较的比较相同

11、点：固定液相同点：固定液是是涂渍涂渍在担体表面；在担体表面；不同点：不同点：流动相种类对分配系数有较大的影响。流动相种类对分配系数有较大的影响。液相色谱分析最新15 2 2、正相分配色谱和反相分配色谱、正相分配色谱和反相分配色谱 为了避免固定液的流失。要求流动相尽可能不与固定为了避免固定液的流失。要求流动相尽可能不与固定相互溶，而且两相的极性差别越显著越好。根据所用流相互溶，而且两相的极性差别越显著越好。根据所用流动相和固定相的极性程度，将其分为动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱正相分配色谱和和反反相分配色谱相分配色谱； 正相分配色谱：正相分配色谱：流动相的极性小于固定相的极性。流动

12、相的极性小于固定相的极性。它它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是按极性顺序流适用于极性化合物的分离。其流出顺序是按极性顺序流出；出； 反相分配色谱：反相分配色谱：流动相的极性大于固定相的极性。流动相的极性大于固定相的极性。它它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。好相反。 液相色谱分析最新163 3、化学键合相色谱、化学键合相色谱 为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。它是将各种不同了化学键合固定相。它是将各种不同有机基团通过有机基团通过化学反应键合到载体表面化学反应

13、键合到载体表面的一种方法，代替了固定的一种方法，代替了固定液的机械涂布，它的液的机械涂布，它的分离机理：分离机理：一般认为一般认为分配和吸分配和吸附附两种作用兼有；两种作用兼有； 可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破，对液相色谱的迅速发展起着重大作用破，对液相色谱的迅速发展起着重大作用 。它是目它是目前应用最广泛的一种固定相。而单纯地液液分配色前应用最广泛的一种固定相。而单纯地液液分配色谱已很少采用。谱已很少采用。液相色谱分析最新17二、液二、液- -固吸附色谱（固吸附色谱（liquid-solid liquid-solid adsorptiona

14、dsorption chromatographychromatography）固定相固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是用的是510m的硅胶吸附剂。的硅胶吸附剂。流动相流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。官能团的化合物和异构体有较高选择性。缺点缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。：非线形等温

15、吸附常引起峰的拖尾。液相色谱分析最新18三、离子对色谱（三、离子对色谱（ion pair ion pair chromatographychromatography）原理：原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水结合形成疏水 性离子对化合物，使其能够在两相之性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；间进行分配；阴离子分离阴离子分离常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十氧化十 六烷基三甲铵作为对离子；六烷基三甲

16、铵作为对离子；阳离子分离阳离子分离常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；离子；液相色谱分析最新19反相离子对色谱反相离子对色谱：非极性的疏水固定相非极性的疏水固定相(C-18柱柱)，含有对，含有对离子离子Y+的甲醇的甲醇-水或乙腈水或乙腈-水作为流动相，试样离子水作为流动相，试样离子X-进进入流动相后，生成疏水性离子对入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配后；在两相间分配。液相色谱分析最新20XYXYXYXY + Y =YYKYYKYKYKY(1)1XXRRMMMRMXXXXXDXDtttkttLttku水相水相有机有机水相水相有机水相水相

17、水相水相（） Kxy取决于对离子和有机相的性质；对离子取决于对离子和有机相的性质；对离子Y-的浓的浓度可控制组分的保留值，可在较大范围内改变分离的选度可控制组分的保留值，可在较大范围内改变分离的选择性。择性。液相色谱分析最新21 注意：注意： 离子对色谱特别是离子对色谱特别是反相离子对色谱反相离子对色谱解决了强解决了强极性有机酸、有机碱的难以分离的问题，特别适合一些极性有机酸、有机碱的难以分离的问题，特别适合一些生化试样如核酸、核苷、生物碱等的分离，另外借助离生化试样如核酸、核苷、生物碱等的分离，另外借助离子对的生成还可引入紫外吸收或荧光基团，可提高灵敏子对的生成还可引入紫外吸收或荧光基团，可

18、提高灵敏度。度。液相色谱分析最新22四、离子交换色谱（四、离子交换色谱（ion-exchange ion-exchange chromatographychromatography）固固 定定 相相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；树脂；流流 动动 相相：盐类的缓冲溶液。通过改变流动相的：盐类的缓冲溶液。通过改变流动相的pH、缓冲剂（平衡离子）的类型、离子强度以及加入有缓冲剂（平衡离子）的类型、离子强度以及加入有机溶剂、配位剂等都会改变交换剂的选择性，影响机溶剂、配位剂等都会改变交换剂的选择性，影响样品的分离。样品的分离。 液相色谱分析最新23 流动

19、相流动相离子强度离子强度的变化对保留值的影响比的变化对保留值的影响比pH更显著。更显著。组分的保留值受流动相中盐类的总浓度控制。增加外加组分的保留值受流动相中盐类的总浓度控制。增加外加阴离子或阳离子总数，会增强它们对阴离子或阳离子总数，会增强它们对R+或或R-的竞争能的竞争能力，使组分离子的保留值减小。通过加入不同性质的外力，使组分离子的保留值减小。通过加入不同性质的外加盐类，可以影响柱的选择性，因为不同外加离子对交加盐类，可以影响柱的选择性，因为不同外加离子对交换剂的固定基团的亲和力大小不同。换剂的固定基团的亲和力大小不同。 流动相的流动相的pH值值会影响酸或碱的离解平衡，若组分以会影响酸或

20、碱的离解平衡，若组分以分子形式存在，则不被固定相保留。离子形式所占分子形式存在，则不被固定相保留。离子形式所占的分数越大，保留值也越大；反之，保留值越小。的分数越大，保留值也越大；反之，保留值越小。常用的缓冲剂有磷酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乙酸常用的缓冲剂有磷酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乙酸盐、氨水等。盐、氨水等。液相色谱分析最新24 阳离子交换：阳离子交换：RSO3Na+M+=RSO3M+Na+ 阴离子交换：阴离子交换：RNR4Cl+X-=RNR4X+Cl-应应 用用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。4444XXXRNR XClKRNR ClXRNR

21、XRNR ClDKXCl基本原理基本原理：组分在固定相上发生反复的离子交换反应；组：组分在固定相上发生反复的离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。存在形式等有关。 亲和力大，保留时间长；亲和力大，保留时间长；液相色谱分析最新25五、离子色谱（五、离子色谱（ion chromatographyion chromatography）固定相：固定相：离子交换树脂离子交换树脂流动相：流动相：电解质溶液电解质溶液检测器：检测器：电导检测、电化学检测器、紫外检测器电导检测、电化学检测器、紫外检测器分析对象：分析对象：

22、水溶液中的阴、阳离子、糖类、氨基酸等水溶液中的阴、阳离子、糖类、氨基酸等离子色谱分为双柱型离子色谱法和单柱型离子色谱。离子色谱分为双柱型离子色谱法和单柱型离子色谱。双柱即在分离柱后连接一个抑制柱，如双柱即在分离柱后连接一个抑制柱，如 洗脱液是浓度很大的洗脱液是浓度很大的NaOH，离子交换下来待测，离子交换下来待测离子离子Br-进入洗脱液引起的电导变化很小，检测灵进入洗脱液引起的电导变化很小，检测灵敏度很低。敏度很低。+-+- +Na BrBr +NaROHROH 交换洗脱液相色谱分析最新26在分离柱后连接一个高容量的阳离子交换柱：在分离柱后连接一个高容量的阳离子交换柱： 这样就消除了洗脱液本底

23、电导的影响，大大提这样就消除了洗脱液本底电导的影响，大大提高了所测阴离子的检测灵敏度。高了所测阴离子的检测灵敏度。-2-RHNa OHRNaRHNaRNaH OBrH Br 单柱离子色谱即选用低电导的洗脱液，如苯甲单柱离子色谱即选用低电导的洗脱液，如苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液，分离洗脱各个阴离子，酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液，分离洗脱各个阴离子，直接进入检测器进行检测。直接进入检测器进行检测。液相色谱分析最新27六、空间排阻色谱（六、空间排阻色谱（steric exclusion steric exclusion chromatographychromatography）固定相固定相：凝胶凝

24、胶(具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布)；因此，排阻色；因此，排阻色谱又称为凝胶渗透色谱。谱又称为凝胶渗透色谱。原理：原理：按分子大小分离。按分子大小分离。 小分子可以扩散到凝胶空隙，从空隙中通过，出小分子可以扩散到凝胶空隙，从空隙中通过，出峰最慢；峰最慢； 中等分子只能部分进入凝胶空隙，中速通过；中等分子只能部分进入凝胶空隙，中速通过； 大分子被排斥在外，出峰最快；大分子被排斥在外，出峰最快； 溶剂分子最小，在最后出峰，即组分全溶剂分子最小，在最后出峰，即组分全部在死时部在死时间前出峰；在柱中停留的时间短，柱内展宽小，柱效间前出峰；在柱中停留的时间短，柱内展宽小，柱效较高。较高。液相色

25、谱分析最新28 分子量介于全排分子量介于全排斥和全渗透之间的化斥和全渗透之间的化合物，按相对分子量合物，按相对分子量降低的次序被洗脱，降低的次序被洗脱，通常将通常将V1-V4称为分级称为分级范围范围液相色谱分析最新29分析对象：分析对象：可对相对分子质量在可对相对分子质量在100-8105范围内的化范围内的化合物按质量分离。不能用来分离大小相似、相对分子量接合物按质量分离。不能用来分离大小相似、相对分子量接近的分子（相对分子量在近的分子（相对分子量在10%） 一些相对分子量变化连续的高聚物，虽不能用凝胶色一些相对分子量变化连续的高聚物，虽不能用凝胶色谱进行分离，但可测定其相对分子质量分级的情况

26、。谱进行分离，但可测定其相对分子质量分级的情况。液相色谱分析最新30一、液液色谱、键合相色谱法及离子对色谱法一、液液色谱、键合相色谱法及离子对色谱法固定相固定相1. 固定相分类固定相分类 （1）全多孔型担体）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用不佳已不多见；现采用10m以下的小颗粒，化学键以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；合制备柱填料；34 液相色谱法固定相液相色谱分析最新31（2）表面多孔型担体）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体

27、）（薄壳型微珠担体）3040m的玻璃微球，的玻璃微球，表面附着一层厚度为表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。表面的多孔硅胶。表面积小，柱容量低。积小，柱容量低。 将固定相涂在单体上最大的问题是固定液的将固定相涂在单体上最大的问题是固定液的流失。流失。20世纪世纪60年代后期发展了新型固定相年代后期发展了新型固定相化学键合固定相化学键合固定相液相色谱分析最新323） 化学键合固定相化学键合固定相 化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型：硅氧碳键型： SiOC b. 硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、

28、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型：硅碳键型： SiC d. 硅氮键型：硅氮键型： SiN液相色谱分析最新33液相色谱分析最新34化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点1）传质快传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；2）寿命长寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； 4）选择性好选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；，可键合不同官能团，提高选择性；5）有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱； 存在着存在着双重分离机制双重分离机制：(键合

29、基团的覆盖率决定分离机理键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；低覆盖率：吸附为主；液相色谱分析最新352、液、液-固吸附分离固定相固吸附分离固定相种类：种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：结构类型：全多孔型和薄壳型；全多孔型和薄壳型；粒度：粒度：510 m。液相色谱分析最新363.离子交换色谱分离固定相离子交换色谱分离固定相结构类别：结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面涂约薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相

30、）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团） 树脂类别：树脂类别：（1） 阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2） 阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）液相色谱分析最新37液相色谱分析最新384. 空间排阻分离固定相空间排阻分离固定相（1）软质凝胶）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构； 水为流动相。适用于常压排阻分离。水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶）半硬质凝胶 苯乙烯苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机

31、凝胶；二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂性溶剂（3）硬质凝胶）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小质影响小, 可在较高流速下使用。可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。液相色谱分析最新39一、流动相类别一、流动相类别按流动相组成分按流动相组成分：单组分和多组分；单组分和多组分；按极性分按极性分：极性、弱极性、非极性；

32、极性、弱极性、非极性；按使用方式分按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。35 液相色谱法流动相相液相色谱分析最新40二、选择流动相时应注意的几个二、选择流动相时应注意的几个问题问题v1 纯度要高纯度要高 溶剂的纯度极大地影响色谱系统的正常操溶剂的纯度极大地影响色谱系统

33、的正常操作和色谱分离效果。溶剂中若存在杂质会污染柱子，作和色谱分离效果。溶剂中若存在杂质会污染柱子，存在固体颗粒会损害高压泵或输液通道，使压力升高，存在固体颗粒会损害高压泵或输液通道，使压力升高，基线漂移。基线漂移。v2 粘度要低粘度要低 高效液相色谱中为获得一定流速必须使用高效液相色谱中为获得一定流速必须使用高压，若溶剂粘度较高，操作压力也更大。高的压力高压，若溶剂粘度较高，操作压力也更大。高的压力会使色谱柱性能降低，而且泵也容易损坏。会使色谱柱性能降低，而且泵也容易损坏。v3 化学稳定性好化学稳定性好 流动相不能与固定相或组分发生任何流动相不能与固定相或组分发生任何化学反应。化学反应。v4

34、 溶剂沸点要高于溶剂沸点要高于55 低沸点溶剂挥发度大，容易使低沸点溶剂挥发度大，容易使流动相浓度或组成发生变化，也容易产生气泡。流动相浓度或组成发生变化，也容易产生气泡。液相色谱分析最新41v5 溶剂要能完全浸润固定相溶剂要能完全浸润固定相 溶剂对所测定的组分要有溶剂对所测定的组分要有合适的极性，最好选择样品的溶剂作流动相，否则发合适的极性，最好选择样品的溶剂作流动相，否则发生溶剂与流动相不相混溶的情况，使分离变坏。生溶剂与流动相不相混溶的情况，使分离变坏。v6 溶剂要与检测器匹配溶剂要与检测器匹配 溶剂要适合于检测器，例如采溶剂要适合于检测器，例如采用示差折光率检测器，必须选择折光率与样品

35、有较大用示差折光率检测器，必须选择折光率与样品有较大差别的溶剂作流动相；若采用紫外吸收检测器，所选差别的溶剂作流动相；若采用紫外吸收检测器，所选择的溶剂在检测器的工作波长下不能有紫外吸收。择的溶剂在检测器的工作波长下不能有紫外吸收。液相色谱分析最新42三、三、 流动相选择流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用采用正相液正相液-液分配色谱分离液分配色谱分离时：首先选择中等极时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，也可先低极性溶剂，再逐渐增加其中的极性溶剂，也可先低极性

36、溶剂，再逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。使保留时间缩短。 反相色谱反相色谱中通常以水为流动相主体，加入不同的中通常以水为流动相主体，加入不同的有机溶剂作调节剂。有机溶剂作调节剂。 常用的有机溶剂：甲醇、乙腈、二氧六环和四氢常用的有机溶剂：甲醇、乙腈、二氧六环和四氢呋喃等呋喃等液相色谱分析最新43常用溶剂的常用溶剂的极性极性顺序顺序： 水水(最大最大) 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙丙酮酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酸乙酯乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫

37、化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小) 排阻色谱所采用的溶剂要和凝胶本身比较相似，排阻色谱所采用的溶剂要和凝胶本身比较相似，对于高分子有机化合物，常采用四氢呋喃、甲苯、对于高分子有机化合物，常采用四氢呋喃、甲苯、间甲苯酚和间甲苯酚和N，N-二甲基甲酰胺等；对于生物物质二甲基甲酰胺等；对于生物物质主要采用水、缓冲盐溶液、乙醇和丙酮等。主要采用水、缓冲盐溶液、乙醇和丙酮等。液相色谱分析最新4436 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的一般可分为高效液相色谱仪的一般可分为4 4个主要部个主要部分分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统测系统, ,另有辅助装

38、置：如梯度淋洗，自动进另有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。样及数据处理等。液相色谱分析最新45液相色谱分析最新46一高压输液系统一高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。一般备有高压输液系统。一般由储液罐、高压输液泵、由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中其中高压输液泵高压输液泵是核心部件是核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合。对于一个好的高压输液泵应符合密封密封性好，输出流

39、量恒定，压力平稳，可调范围宽，便性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。等要求。 液相色谱分析最新47往复式高压恒流泵往复式高压恒流泵液相色谱分析最新48注射泵注射泵液相色谱分析最新49二进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约530cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相高效液相色谱法中对进样技术要求较严。色谱法中对进样技术要求较严。 进样装置进样装置： 注射器进样注射

40、器进样 高压定量进样阀高压定量进样阀液相色谱分析最新50三、分离系统三、分离系统色谱柱色谱柱 色谱柱包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻色谱柱包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜，内衬光滑的聚合材料。玻璃管璃、不锈钢、铝、铜，内衬光滑的聚合材料。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。耐压有限，故金属管用得较多。 一般色谱柱长一般色谱柱长5 530cm30cm，内径为，内径为4 45mm5mm，凝胶色谱，凝胶色谱柱内径柱内径3 312mm12mm，制备柱内径较大，可达，制备柱内径较大，可达25mm 25mm 以上。以上。 一般在分离前备有一个一般在分离前备有一个前置柱前置柱，前置柱

41、内填充物，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响。 液相色谱分析最新51液相色谱分析最新52四检测系统四检测系统 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。 一类是一类是溶质型检测器溶质型检测器，它仅对被分离组分，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有有紫外、荧光、电化

42、学检测器等紫外、荧光、电化学检测器等。 另一类是另一类是总体检测器总体检测器，它对试样和洗脱液，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有的有示差折光，电导检测示差折光，电导检测器等。器等。液相色谱分析最新53 五、附属系统五、附属系统 它包括它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等收集以及数据处理等装置。其中装置。其中梯度淋洗装置梯度淋洗装置是高压是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置；液相色谱仪中尤为重要的附属装置； 梯度淋洗（梯度洗脱）：是在分离过程中逐渐改梯度淋洗（梯度洗脱）

43、：是在分离过程中逐渐改变流动相的组成，增加洗脱能力的一种方法。变流动相的组成，增加洗脱能力的一种方法。主要是主要是通过梯度装置将两种（或更多）极性不同的溶剂在分通过梯度装置将两种（或更多）极性不同的溶剂在分离过程中按一定程序连续改变流动相中溶剂的的配比离过程中按一定程序连续改变流动相中溶剂的的配比和极性。和极性。液相色谱分析最新54 优点：优点：通过改变极性来改变分离组分的分离通过改变极性来改变分离组分的分离因素，以提高分离效果，增加分辨能力，改因素，以提高分离效果，增加分辨能力，改善峰形，同时可缩短分离时间善峰形，同时可缩短分离时间。PUMPPUMPPUMP液相色谱分析最新5537高效液相色

44、谱分离类型选择 液相色谱分析最新5639液相制备色谱 制备色谱制备色谱：将分析色谱的进样量增大，同时得出大：将分析色谱的进样量增大，同时得出大量的所需物质（馏分）的过程。制备色谱的目的，量的所需物质（馏分）的过程。制备色谱的目的，是从混合物中得到纯物质。制备色谱系统则是利用是从混合物中得到纯物质。制备色谱系统则是利用制备色谱的思想高效能得到纯化物质的多个分析测制备色谱的思想高效能得到纯化物质的多个分析测试设备联用的总称。试设备联用的总称。 液相色谱分析最新57传统的制备色谱一般由一台可以连续输送液体的恒传统的制备色谱一般由一台可以连续输送液体的恒流流泵泵、紫外检测仪紫外检测仪与与色谱柱色谱柱构

45、成，其中最重要的部构成，其中最重要的部件是价格不一，款式多样的色谱柱，这也是影响最件是价格不一，款式多样的色谱柱，这也是影响最终制备效果的关键性环节。终制备效果的关键性环节。 各种规格的各种规格的玻璃柱子玻璃柱子在实验室里很容易得到，而在实验室里很容易得到，而且价格低廉，但玻璃柱子致命的弱点是它能承受的且价格低廉，但玻璃柱子致命的弱点是它能承受的压力很小，且非常容易破碎。当由于压力太小而导压力很小，且非常容易破碎。当由于压力太小而导致流动相流速很慢的时候，高位液面或加高压空气致流动相流速很慢的时候，高位液面或加高压空气（或者氮气）的采用是一个简单的解决办法。在底（或者氮气）的采用是一个简单的解

46、决办法。在底下加真空，也能在一定程度上解决这个问题。下加真空，也能在一定程度上解决这个问题。 液相色谱分析最新58不锈钢不锈钢柱子具有良好的耐腐蚀、抗压力性能，柱子具有良好的耐腐蚀、抗压力性能，但其价格相对很贵。如果，只有很小的分离任务且但其价格相对很贵。如果，只有很小的分离任务且经费也允许，市面上直径为经费也允许，市面上直径为1cm的小型制备柱就是的小型制备柱就是首选。首选。 有机玻璃有机玻璃柱子也能抗压力耐腐蚀，相对不锈钢柱子也能抗压力耐腐蚀，相对不锈钢柱子而言，它是半透明的，可以看到液体的运行状柱子而言，它是半透明的，可以看到液体的运行状态，对有色的物质其特点就更为突出。态，对有色的物质

47、其特点就更为突出。硅胶、键合固定相（如硅胶、键合固定相（如C18）、离子交换树脂）、离子交换树脂 、聚酰胺、聚酰胺、 氧化铝、氧化铝、 凝胶等都可以作为色谱柱的填凝胶等都可以作为色谱柱的填料。料。 有不少文献报道，对填料可以进行处理可提高有不少文献报道，对填料可以进行处理可提高分离效果。分离效果。 液相色谱分析最新59在制备色谱中在制备色谱中柱容量柱容量是影响所用技术和装置的是影响所用技术和装置的重要因素。重要因素。柱容量（柱负荷），在分析色谱中指不影响柱效能柱容量（柱负荷），在分析色谱中指不影响柱效能的情况下的最大进样量。在制备色谱中指不影响收的情况下的最大进样量。在制备色谱中指不影响收集物

48、纯度的前提下的最大进样量。集物纯度的前提下的最大进样量。进样量越大，色谱柱处于过载状态，柱效将大幅度进样量越大，色谱柱处于过载状态，柱效将大幅度降低，峰形变差，制备色谱中允许过载，但以柱效降低，峰形变差，制备色谱中允许过载，但以柱效降到降到50%为宜。为宜。液相色谱分析最新60一般操作方法：一般操作方法：在分析液相色谱上使组分得到在分析液相色谱上使组分得到最大分离；加大进样量直到色谱峰发生重叠；在这最大分离；加大进样量直到色谱峰发生重叠；在这柱容量极限内，色谱柱的操作情况和分析型分离很柱容量极限内，色谱柱的操作情况和分析型分离很接近，同时柱直径要按比例扩大以允许最大的试样接近，同时柱直径要按比

49、例扩大以允许最大的试样量。量。液相色谱分析最新61高速逆流色谱高速逆流色谱 （ high-speed countercurrent chromatography ， HSCCC ）是）是 20 世纪世纪 80 年代年代发展起来的一种连续高效的液发展起来的一种连续高效的液液分配色谱分离技术，液分配色谱分离技术， 它不用任何固态的支撑物或载体。它不用任何固态的支撑物或载体。 它利用两相溶剂它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连

50、续洗脱的过程中能保留大量固定相。为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。 由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅使样品能附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅使样品能够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性，特够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性，特别适合于天然生物活性成分的分离。别适合于天然生物活性成分的分离。液相色谱分析最新62 由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，由于被分离物质与液态固定相之间

51、能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分离手段。离手段。 它相对于传统的固它相对于传统的固液柱色谱技术，具有适用液柱色谱技术，具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。目前低等优点。目前 HSCCC 技术正在发展成为一种备技术正在发展成为一种备受关注的新型分离纯化技术，已经广泛应用于生物受关注的新型分离纯化技术，已经广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等领域，医药、天然产物、食品和化妆品等领域， 特别在天特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的新型分离技然产物行业中已被认为是一种有效的新型分离技 术；术；适合于中小分子类物质的分离纯化。适合于中小分子类物质的分离纯化。 液相色谱分析最新63 310毛细管电泳简介 在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。移速率不同，可实现分离。 19371937年，年，Tiselius(Tiselius(瑞典瑞