乳酸细菌胞外多糖的研究

1、LANZHOU UNIVERSITY OF TECHNOLOGY毕业论文 题 目 学生姓名 学 号 专业班级 指导教师 学 院 答辩日期 第 页10乳酸细菌胞外多糖的研究 摘要 乳酸细菌(LAB)胞外多糖（EPS）是乳酸细菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的的荚膜多糖和粘液多糖的总称。本实验采用酶解法从乳酸细菌发酵液中提取胞外多糖。通过测定胞外多糖的含量筛选出了2株高产胞外多糖的菌株，并运用单因素及正交实验对其发酵条件进行优化，优化后的最佳发酵条件是：初始培养基pH5.5，乳糖添加量为20g/L，接种量为5.0%，发酵温度为37 ，发酵时间为24 h。最后，利用薄板层析法测定多糖样品中含有的单糖

2、，初步确定有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖，多糖的抗氧化性研究结果表明, 保加利亚乳杆菌多糖样品液具有体外清除 O2 -和OH的作用, 在所作实验范围内其最大清除率分别为68.7%和 69.4%。 关键字：乳酸细菌 胞外多糖 薄板层析 发酵条件 氧化性Abstract Lactic acid bacteria (LAB) extracellular polysaccharide (EPS) is secreted by the name of lactic acid bacteria from the cell wall of the generic capsular polysacchari

3、de and mucus polysaccharides in the process of growth and metabolism. The experiments on extraction of exopolysaccharides from lactic acid bacteria in the fermentation broth by enzymatic method. By determination of extracellular polysaccharide were screened out 2 strains of polysaccharide high-yield

4、 extracellular, and the fermentation conditions optimization of single factor and orthogonal experiments, the optimum fermentation conditions optimization is: initial culture pH5.5, lactose concentration is 20g/L, inoculum 5%, fermentation temperature 37 , fermentation time was 24 h. Finally, determ

5、ination of monosaccharides containing polysaccharide samples of glucose, galactose, rhamnose and mannose by thin layer chromatography, antioxidant activity of polysaccharides showed that, Lactobacillus bulgaricus polysaccharide liquid samples with scavenging O2 - and OH role in the experimental rang

6、e, the maximum clearance rates were 68.7% and 69.4%. Keywords: lactic acid bacteria Extracellular polysaccharide Thin layer chromatography Fermentation conditions Oxidation I目录一、综述1（一）乳酸细菌胞外多糖的介绍11.乳酸细菌EPS的分类、化学组成和结构12.乳酸细菌EPS的物理学特性：13.乳酸细菌EPS的生理学特性2（二）多糖的提取方法研究31.碱提法32.酶解法3（三）国内外研究现状4（四）研究目的及意义4二、材

7、料与方法4（一）材料41.仪器42药品与试剂53.菌株54.主要培养基5（二）方法51.试剂的配制52.菌种的活化53.酶解法提取胞外多糖64.多糖的纯化65.胞外多糖（EPS）含量的测定66.单因素及正交实验优化发酵条件67.薄板层析法（TLC）分析多糖的单糖组成78.多糖抗氧化性的测定7三、结果与分析8（一）葡萄糖标准曲线8（二）胞外多糖产量8（三）单因素及正交实验优化发酵条件81.碳源的影响82.乳糖添加量的影响93.接种量的影响94.pH的影响105.培养时间的影响116.培养温度的影响117.正交实验和验证实验121.单糖的展层效果132.多糖的展层效果13（五）多糖抗氧化性的测定1

8、41.超氧阴离子自由基(O2 - )清除作用：142.羟基自由基(OH)的清除作用：15四、讨论15五、结论16参考文献16一、综述 微生物的生长通常伴随着胞外多糖(Exopolysaccharides， EPS)的产生。EPS具有特殊的生物学功能，它粘合在细胞表面，可以作为细胞膜的保护屏障， 也可以作为生物膜的组成成分1。黄原胶、硬葡聚糖、结冷胶、热凝多糖、右旋糖苷、短梗霉多糖、细菌纤维素等都属于胞外多糖，它们已经成功地应用于食品、医学、制药、化妆品及石油行业中。乳酸细菌胞外多糖是乳酸细菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一类糖类化合物，有的依附于微生物细胞壁形成荚膜，称为荚膜多糖(CPS)；

9、有的进入培养基形成粘液，称为粘液多糖(SPS)，是微生物次级代谢产物。乳酸细菌 EPS 有很多功能，如保护细胞体、作为胶黏剂与其他细菌表面相互作用、用作抵御环境的保护因子，在生物膜中起到结构稳定剂的作用等。乳酸菌 EPS的结构多样性使其具有一系列的物理化学和生物学特性。（一）乳酸细菌胞外多糖的介绍 1.乳酸细菌EPS的分类、化学组成和结构 （1）乳酸细菌EPS的分类：迄今为止,大多数已报道的产EPS乳酸细菌能代谢产生SPS,但部分乳酸细菌可同时产生CPS和 SPS。 按伯杰氏系统细菌学手册中的生化及形态分类法, 乳酸细菌分为18个属2,目前对其中几个属包括乳杆菌属( Lactobacillus

10、)、链球菌属( Streptococeus)、明串珠菌属( Leuconostoc)、乳球菌属( Lactococcus)等乳酸细菌的胞外多糖研究较多。从化学组成上讲, EPS又可以进一步分为两种类型:一种是同型多糖(HoPS), 由三个或以上的同种单糖构成, 如葡聚糖、果聚糖、半乳聚糖等。它是在细胞外或细胞壁上以蔗糖为糖基供体聚合而成的。另一种是杂型多糖(HePS), 即结构重复单元由不同的单糖组成, 每个重复单元由 3-8 个单糖、单糖衍生物或取代单糖组成。它由细胞内的糖基-核苷酸作为前体分子, 并在细胞膜上聚合而成,最后释放到细胞体外。 （2）乳酸细菌EPS的化学组成和结构：对于乳酸菌生

11、长过程中产生的EPS的化学组成,研究学者开始认为这类黏性物质是糖蛋白或者是碳水化合物蛋白质的复杂化合物。后来经过大量的研究, 逐渐发现这类黏性物质是由许多带有分支的重复单位构成的多糖。来自于乳酸细菌的HoPS分子量在4.01046.0106 之间, 可以分为以下四类2:-D-葡聚糖,其中有葡萄糖残基以-1,6键连接, 同时在-1,3位有不同程度的分支、少部分在 -1,2 位和 -1,4 位出现分支。-D-葡聚糖, 葡萄糖残基以-1,3 键连接,在 -1,2 处出现分支的结构。-D-果聚糖, 果糖残基以-2,6 键连接,在-2,1处出现分支的结构。其他, 聚半乳糖,由结构一致的重复单体以不同的糖

12、苷键连接而成的。HePS 分子量在4.01046.0106 之间,与 HoPS相比结构更为复杂。HePS 由分支(在 C2,C3,C4或C6)或无分支的重复单元组成。乳酸细菌HePS重复单元的组成成分有单糖,单糖衍生物和取代单糖。不同的 HePS, 其重复单元中的单糖种类和连接方式也不同。通常有 D-葡萄糖、D-半乳糖和 L-鼠李糖, 有时也会出现其他戊糖和己糖, 如 D-甘露糖, D-蔗糖, L-岩藻糖, D-木糖和 D-阿拉伯糖。少数EPS中还存在N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺和葡糖醛酸, 有时在非糖残基中可能存在其他基团如磷酸基、乙酰基和甘油等。这些单糖多以-键或-键连接的吡喃或呋喃糖

13、的形式存在。EPS 的一级结构决定了它的高级结构,其结构层次分类与蛋白质大致相同,也可以分为一级、二级、三级、四级结构。EPS 的二级结构是指多糖的骨架链内以氢键结合所形成的聚合体, 即多糖分子的主链构象并不涉及侧链的空间排布。二级结构进一步卷曲、折叠形成特定构象的三级结构。多糖的四级结构是多糖链间的相互协同结合, 即亚单位现象。由于乳酸菌EPS 的种类繁多、结构多样,目前对于其结构及与功能的关系的报道还相对较少。 2.乳酸菌EPS的物理学特性：乳酸细菌具有公认的安全性(generally recognized as safe, GRAS),在乳制品或其他发酵产品中有着广泛的应用。目前,除了右

14、旋糖酐外,还未见有其他乳酸菌EPS商业化生产。乳酸细菌 EPS作为乳酸菌在乳制品如酸乳、干酪发酵代谢产生的天然产物,对乳制品的品质有着重要的影响。同时,乳酸细菌EPS还具有良好的保健功能。由于乳酸细菌 EPS 具有独特的物理学和生理学特性,使其在酸乳干酪生产, 保健食品的开发及医药等方面有着巨大的应用潜力。hk发酵乳的重要结构特征是其硬度和持水力,这些特性和它的凝胶结构有关。发酵乳微观结构显示,在细胞表面和乳蛋白网络之间存在胞外多糖, EPS可以干扰酪蛋白在凝胶过程中与其他不稳固凝结物的结合。为了研究 EPS 对发酵乳黏度的影响,Ayala-Hernandez等3 从Lactococcus l

15、actis subsp.cremoris JFR1发酵液中分离纯化得到EPS,并将其加入到发酵乳中,调节pH到5.6和6.7,在不同时间段取样,并在4下放置6h后测定黏度,研究结果表明随着EPS含量的提高,发酵乳的黏度也有显著的提高,而pH 未对黏度产生显著影响。 Purwandari 等 4 在不同温度下用产EPS菌株S. thermophilus 发酵牛乳,发现 EPS 的含量对发酵乳的质构没有显著影响。Perry 等 5 研究了产 EPS 乳酸细菌发酵剂对低脂Mozzarella干酪的水分和融化特性的影响,研究发现产 EPS的发酵剂可以提高干酪的保水性和产量,改善干酪质构。多项研究表明乳

16、酸细菌EPS影响发酵乳的流变学特性, 因此研究者普遍认为酪蛋白在随pH 降低而凝固时与 EPS 之间的相互作用是影响凝乳质构的关键所在。由于乳酸菌 EPS 具有独特的流变特性, 可作为稳定剂、 凝胶剂、增稠剂在食品中使用。 3.乳酸细菌EPS的生理学特性 （1）乳酸细菌 EPS 的抗肿瘤作用：近几十年来，由于微生物胞外多糖在产品结构、性能及生产方面所具有的特别优势而得到大力研究和开发，新的微生物胞外多糖的开发已成为工业微生物研究的热点之一。由于乳酸细菌是食品级工业生产菌，与其他菌相比安全性高，所以近年来对乳酸细菌胞外多糖的研究逐渐增多。但产量低，菌株稳定性差，仍是制约其大规模生产的主导因素。现

17、在各国科学家试图用基因工程的手段构建高产菌株，但至今仍没成功。胞外多糖具有生物活性如免疫活性、抗肿瘤和抗溃疡，可应用于医药领域。刘慧等6从藏灵菇中筛选出产EPS的干酪乳杆菌 KL1, 并研究了其纯化后的EPS对人结肠癌细胞HCT-8的增殖抑制和诱导细胞凋亡作用。用CCK-8 法检测细胞活力,结果表明EPS能有效降低HCT-8的活力并抑制其增殖,且细胞生长抑制率呈时间-剂量依赖性。用 Annexin V-FITC 试剂盒检测细胞凋亡情况,表明 EPS处理组的阳性细胞明显高于对照组,由此判断EPS可诱导HCT-8细胞凋亡的发生,从而抑制HCT-8细胞的增殖。冯美琴等7 研究发现植物乳杆菌 7081

18、0 产生的EPS-1和 EPS-2对体外培养的大肠癌细胞 HT-29 的增殖均具有明显的抑制作用,随着EPS浓度的增加, 抑制率逐渐增大。阳性对照5-Fu在50g/mL时,对肿瘤细胞的抑制率达到68.51%但组分EPS-2的抑制率明显高于 EPS-1,原因可能与其结构参数如分子质量、单糖组成等有关。van 等8从Lb. plantarum NRRL B-4496 中分离得到一种以 -(14)和 -(16)键连接而成的葡聚糖, 发现它在体外可以抑制六种癌细胞(肠道癌细胞CACO、宫颈癌细胞HELA、结肠癌细胞 HCT116、肝癌细胞HEPG2、乳腺癌细胞MCF7、喉癌细胞HEP2)的生长, 其半

19、抑制浓度分别为 9.07、15.8、17.6、19.9、24.2、34.7 g/mL。并可以抑制小鼠体内欧利希氏腹水癌细胞的生长, 小鼠的平均存活时间延长了88.9。 （2）乳酸细菌 EPS 的抗氧化作用：自由基和脂质过氧化产物是引起氧化损伤的重要原因,自由基的清除、抑制脂质氧化也是评价抗氧化性的重要指标。大量研究表明,一些乳酸细菌EPS具有抗氧化作用。许女等9研究了干酪乳杆菌KW3产生的EPS抗氧化活性,体外试验表明,当EPS浓度为200g/mL时,其对DPPH 自由基的清除率为37.53%,FRAP 值为(600.1615.23)FeSO 47H 2 O mol/L体内抗氧化试验显示EPS

20、可显著降低衰老小鼠血清、肝和脑组织中的 MDA 含量,提高其SOD 和GSH-Px活性。颜炳祥等10研究了硒化的EPS抗氧化活性, 结果表明硒化的 EPS 总抗氧化能力及对羟自由基的清除能力增强,而对超氧阴离子自由基的清除能力变化不大。孟祥升等11研究发现副干酪乳杆菌H9产生的EPS抗氧化能力随浓度升高而增强,当EPS浓度达到200mg/L时,其对羟自由基、超氧自由基和DPPH 自由基清除率分别为 (55.31.5)% 、(68.71.1)% 和(70.80.6)%。 （3）乳酸细菌 EPS 的免疫调节作用：近些年, 有关乳酸菌 EPS 的免疫调节作用已成为研究的热点。刘佳等12研究了硒化乳酸

21、菌胞外多糖(Se-EPS)对小鼠腹腔巨噬细胞免疫活性的影响,结果显示 Se-EPS 能够显著增强体外巨噬细胞的吞噬活性,提高NO和TNF-的分泌量(NO可杀伤入侵的细菌、真菌等微生物和肿瘤细胞等, 同时在炎症损伤方面起着十分重要的作用;NF-是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一, 且可作为免疫的第一介质),并且在Se-EPS浓度为501000 g/mL 之间呈浓度依赖性增加。说明Se-EPS有助于促进巨噬细胞的细胞介导免疫反应, 增强免疫调节作用。Ruas-Madiedo等 13 研究发现 Bifidobacterium animalis ssp. lactis A1、IP

22、LA-R1、Bifidobacterium longum NB667 和 Lb. rhamnosus GG代谢产生的 EPS 在1g/mL 时可以抵御体外真核细胞的细胞毒素,保护人体免受病原体侵害。乳酸菌 EPS 可作为益生元加以利用。益生元是一类非消化性的物质, 但可作为底物被肠道正常菌群利用,能选择性刺激结肠内一种或几种细菌生长,对宿主健康起到有益作用。Looijesteijn 等14对Lactis subsp.cremoris NZ4010产生的胞外多糖的不可消化性进行了研究,用含 EPS的饲料对老鼠进行体内试验,发现在老鼠粪便中的胞外多糖接近100,由此表明胞外多糖在肠道中没有消化。目

23、前主要应用的益生菌(乳杆菌和双歧杆菌)都能够产生 EPS, 因此乳酸菌及其发酵制品的生理功能可能归功于其细胞壁的成分,尤其是EPS。乳酸菌EPS也可以促进菌体在肠粘膜上的非特异性粘附作用,其中CPS使菌体更容易在肠道内定植EPS由于能够增加食品的粘度,使得发酵乳制品可以再在胃肠道内的存留更长的时间,对益生菌在肠道内的作用十分有益。所以对于一株高产具有良好粘附性的EPS的益生菌来说,更具有应用价值。（4）其他：乳酸细菌EPS对细胞体有着保护作用,它有助于细胞抵御不良环境、免受毒害、便于菌体附着在固体表面。研究发现SPS可保护细菌免受机械力的破坏以及抗菌物质破坏细胞。菌体在干燥、高温或冷冻等极端条

24、件下,可以利用具有高亲水性的胞外多糖间质存留的水保护菌体。当菌体遭遇外源病原物的侵袭时,外膜包被着具有粘液状的EPS能够有效保护菌体免受病原物或噬菌体的识别或吞噬。此外,乳酸菌EPS还具有降血压、降血脂、降胆固醇、缓解乳糖不耐症、抑制有害微生物和预防腹泻等功能特性。产胞外多糖对乳酸菌而言是一种显著的耗能行为。目前,对乳酸菌胞外多糖的生理作用尚不完全清楚。一般认为,胞外多糖具有保护作用, 如形成亲水表面防止细胞干裂、螯合重金属离子防止其毒害、使噬菌体不敏感从而防止其侵害、防止抗菌素破坏( 抗菌素必须在胞外多糖中达到饱和以后才能到达细胞壁)、提供高氧张力等。此外,胞外多糖还参与金属离子吸收、营养物

25、转运、致病性识别、起粘合作用及作为储备碳源等。由突变链球菌和唾液链球菌所产的突变聚糖( mutan)及果聚糖在龋齿的形成中起重要作用,这两种水不溶性多糖的粘合作用使致龋齿菌得以依附于牙齿上。（二）多糖的提取方法研究 1.碱提法多糖在碱性溶液中稳定，例如粘多糖的提取多采用碱提取法15 . 张兰杰16 等在70 条件下，将五味子用稀 NaOH 溶液调 pH8， 水溶液提取3次，滤液浓缩、醇析、Savage 法脱蛋白、脱脂、脱色、DATE纤维素柱洗脱等步骤，分离出两种多糖组分，质量分数分别为 0.387 % 和 0061 %. 田龙17以豆渣为原料，在碱性条件下脱蛋白，再用质量分数为 30 %氢氧化

26、钠溶液在 45 提取 90 min，以干豆渣计算，水溶性大豆多糖提取率为48 %.碱有利于酸性多糖的浸出，可提高多糖的收率，缩短提取时间，但提取液中含有其它杂质，使粘度过大，过滤困难，且浸提液有较浓的碱味，溶液颜色呈黄色，这样会影响成品的风味和色泽. 2.酶解法 酶解法指的是使用酶来提取多糖，从而提高提取率的生物技术.其中经常使用的酶有蛋白酶、纤维素酶等.蛋白酶对植物细胞中游离的蛋白质具有分解作用，使其结构变得松散；蛋白酶还会使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解，有利于多糖的浸出. 谢红旗等18采用中性蛋白酶解法提取香菇多糖，和直接水提法比较，结果表明在pH 4.8，温度50 ，处理时间60m

27、in，多糖得率增大40%，杂质蛋白质减少50%.张文超等19对金针菇多糖的酶法提取进行了研究，采用木瓜蛋白酶，最佳提取条件为：温度 60，pH 6.5，酶添加量为原料体积的2%，提取时间2h.在最佳提取条件下金针菇多糖的提取率为 20.32%. 纤维素酶则能特异性地降解纤维素，使植物细胞的细胞壁破裂，多糖易从胞内释放。此法具有条件温和、杂质易除和得率高等优点。（三）国内外研究现状 近年来，乳酸细菌（LAB）胞外多糖 (EPS）的研究与开发越来越引起学者的关注。目前研究的大多数产胞外多糖的乳酸细菌来自于乳制品, 也能从发酵肉制品中分离到。王静颖等20从保加利亚乳杆菌和嗜热乳链球菌的牛乳培养物中提

28、取胞外多糖并进行了纯化。陈营、孙莉萍等应用苯酚硫酸法对干酪乳杆菌胞外多糖产生的影响因素进行了研究。虽然产生胞外多糖的乳酸细菌研究较多, 但真正有价值并已商品化的胞外多糖却很少。除菌种的本身因素外, 胞外多糖的产量又受许多因素的影响。由于国内对乳酸细菌胞外多糖的研究报道不多，多数的乳酸细菌胞外多糖还处于研究开发阶段21。葡聚糖明串株菌生产的葡聚糖由于转化率高，成本相对较低，已经用于食品生产的许多方面。但对大多数乳酸细菌胞外多糖而言，其转化率低，生产成本相当高，要在工业上应用还待进一步的研究，提高 EPS 的产量，拓宽EPS 潜在的应用范围。总结多年来国内外有关的研究概况，现阶段主要集中于影响 E

29、PS 的生物合成条件的研究。乳酸细菌 EPS 的多种生物学功能，吸引了各个领域的学者，国际上 EPS 专题会议已经进行了多次研究。EPS 已广泛应用于食品、 医疗等各个领域。利用产 EPS 的乳酸细菌生产酸奶可改善产品的流变学特性，同时可不再使用被限定的稳定剂。近年来，有关乳酸细菌全基因组或部分基因组序列的提出， 为乳酸细菌的遗传学、生物化学和生物学分析提供了更多的依据和信息，结合多糖合成代谢途径调控，可以生产具有特定用途的EPS22。（四）研究目的及意义 微生物多糖除了对细菌自身有生物学意义外，更重要的是它具有安全无毒，理化性质独特，用途广泛，易于菌体分离及通过深层发酵实现工业化生产等优良特

30、性而备受关注。与植物多糖相比，微生物多糖的生产周期短，不受季节，地域和病虫害条件的限制，具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景，越来越受到人们的关注，它在很大程度上能够满足人们对天然无公害食品的需求。随着生产技术的不断提高，微生物多糖在工业中的应用范围将不断拓宽。 本文围绕乳酸细菌EPS，利用酶解法生产EPS，通过测定其EPS含量筛选出1到2株高产EPS的菌株，并且运用单因素及正交实验对其发酵条件进行优化。最后，利用薄板层析法测定多糖的单糖组分，并且测定多糖的抗氧化性。二、材料与方法 （一）材料 1.仪器表1主要仪器及型号仪器名称型号生产厂家紫外分光光度计 UV-9200北京瑞利分析仪器公司分析

31、天平 AB104-N梅特勒仪器(上海)有限公司超净工作台 JJ-CJ-ID杭州净化设备厂电热恒温干燥箱 HPX-9162MBE 上海博讯实业有限公司水浴锅 HH-2江苏省金坛市医疗仪器厂生化培养箱SPX-100B-Z上海博讯实业有限公司恒温振荡培养箱BS-2F江苏省金坛市医疗仪器厂手提式电热压力灭菌锅 XYQ-SG46-280S上海博讯实业有限公司电炉1KW单联北京科伟永新仪器有限公司循环水式多用真空泵SHB-A郑州长城科工贸有限公司表2主要玻璃仪器及规格仪器名称仪器规格三角瓶 100mL 、250mL移液管0.5mL、1mL、5mL、10mL比色管10mL烧杯250mL、500mL量筒 50

32、0mL 、100mL离心管50mL 2药品与试剂表3主要药品与试剂及生产厂家药品与试剂名称生产厂家氢氧化钠 天津市德恩化学试剂有限公司葡萄糖上海化学试剂厂乙醇 天津百世化工有限公司磷酸氢二钾天津百世化工有限公司氯化钾 天津开发区海光化学制药厂氯化钠 天津开发区海光化学制药厂盐酸天津市东方化工厂抗坏血酸天津市德恩化学试剂有限公司蛋白胨 北京双旋微生物培养基制品厂 牛肉膏 北京双旋微生物培养基制品厂氯仿、正丁醇、过氧化氢均为国产分析纯。 3.菌株 德氏乳杆菌（ Lactobacillus delbrueckii）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（St

33、reptococcus thermophilus）均为兰州理工大学微生物室保存。 4.主要培养基 （1）牛肉膏蛋白胨培养基：称取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20g、加水1000mL、pH（7.07.2），121灭菌20min。 （2）MRS培养基：称取牛肉膏10.0g、蛋白胨10.0g、酵母膏5.0g、葡萄糖20.0g、聚山梨酯-801.0g、柠檬酸氢二胺 2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁 0.1g、硫酸锰 0.05g、磷酸氢二钾2.0g、加蒸馏水1000mL pH（6.5-7.2），121灭菌20min。（二）方法 1.试剂的配制 （1）D-Hanks液的配制：称取氯化钾0.4

34、g、磷酸二氢钾0.06g、氯化钠8.0g、碳酸氢钠0.35g、磷酸氢二钠 0.132g、葡萄1.0g、 酚红（0.1%）1mL、加蒸馏水1000mL，121灭菌15min。 （2）胰蛋白酶液的配制：称取0.6g胰蛋白酶粉末于研磨器中(研磨器放在冰浴中)，加入少量DHanks液研磨调制成糊状。再放入4预冷的200mLD-Hanks液中，4下低速搅拌使完全溶解。然后用NaHC03干粉将胰酶溶液的pH值调至8.0左右，并加入0.02EDTA以协助消化作用。最后于4下低温保存。 2.菌种的活化在无菌的条件下，刮取少量菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，置于37的恒温培养箱，培养24h。 3.酶解法提取胞外

35、多糖23 蛋白酶会使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解，有利于多糖的浸出。酶解法提取的实质是通过酶解反应强化传质过程. 此法具有条件温和、杂质易除和得率高等优点。 （1）发酵液的制备：分别将活化后的菌种于30 ml MRS液体培养基中，37 恒温培养24h。然后将活化后的菌液按5%（V/V）的量接入装有100 mL MRS液体培养基的250 mL三角瓶，37 恒温培养24h后,得发酵液。 （2）离心：将发酵液在3000rmin下离心10分钟，得到上清液和沉淀，弃掉沉淀。 （3）等电点法除酪蛋白：用饱和NaOH调样液pH至8.0，4000r/min离15min，上清液用HCl 调节pH至4.6,

36、4000r/min离心15min。 （4）酶解：调pH 至7.5，加入1/10 体积的胰蛋白酶液（浓度为3g/L，现配现用），40水浴酶解2.5h后，3000r/min 离心15min。 4.多糖的纯化 （1）Sevag脱蛋白：加入1/3 体积的Sevag液（氯仿：正丁醇=5:1），振摇30min，4000r/min 离心15min，去除沉淀，重复三次。（2） 乙醇沉淀：将上述多糖溶液加入35倍体积的95% 的乙醇，充分振荡（多糖呈絮状沉淀析出），抽滤得沉淀。（3） 洗涤干燥：将沉淀用丙酮洗涤脱水两次，真空干燥得粗多糖。 5.胞外多糖（EPS）含量的测定 （1）葡萄糖标准曲线的制备：首先配置1

37、00ug/mL的标准葡萄糖溶液，精密吸取葡萄糖标准溶液0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL，于10 mL容量瓶，以蒸馏水稀释至刻度，摇匀。分别取2 mL上述溶液于l0mL具塞试管中，以2 mL蒸馏水作空白，各自加入1.0ml 5.0% 苯酚加热，取出置冷水中冷却，用分光光度计在波长490nm处测定光密度以葡萄糖浓度为横座标，光密度值为纵座标绘制标准曲线。 （2）胞外多糖含量的测定：采用苯酚 - 浓硫酸法测定24。准确称取干燥的胞外多糖样品10mg，置于250mL容量瓶中定容，吸取样品溶液 2mL于试管中，然后按标准曲线制备步骤操作，测定样品的吸光度，由回归直线方程求出浓度c，然后

38、由下式求得可溶性胞外多糖含量。 胞外多糖含量(%)=(c250)/(w10 6 )100 式中，c为苯酚 - 浓硫酸法所测吸光度由回归直线方程求得的浓度( g/mL)；w 为待测样品的质量(g)。根据所测得的胞外多糖含量，从而筛选出1到2株高产胞外多糖的菌株。 6.单因素及正交实验优化发酵条件 （1）碳源对EPS产量的影响：分别以乳糖、蔗糖和麦芽糖代替MRS液体培养基中的碳源，初始pH6.5。分别接入5%活化后的菌液， 37 摇床培养24 h，测EPS含量 。 （2）不同乳糖添加量对EPS产量的影响 将培养基中乳糖的量分别取为10、15、20、25、30 g/L，其他成分不变，制成各设计培养基

39、。分别接入5%活化后的菌液，37 恒温培养24 h， 测EPS含量。 （3）不同接种量对EPS产量的影响：将活化后的菌液分别按3%、4%、5%、6%、7%接入5个装有100 mLMRS液体培养基的250 ml三角瓶，37 下恒温培养24 h，测EPS含量。 （4）不同初始pH对EPS合成的影响：将MRS培养基初始pH分别调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，分别接入5%活化后的菌液于各设计培养基中，37 下恒温摇床培养24 h，测EPS含量 。 （5）不同培养时间对EPS产量的影响：取9个250 mL三角瓶， 各装95 mLMRS液体培养基， 调pH至5.0， 接入5%活化后的菌液，37

40、 恒温培养。分别在培养9、12、15、18、21、24、27、36、48 h时取出，测EPS 含量。 （6）不同培养温度对EPS产量的影响：取5个250 mL三角瓶， 每个三角瓶装乳糖MRS液体培养基95 mL， 调pH至5.0。再接入5%活化后的菌液， 分别在33、35、37、39、41 下恒温培养24 h， 然后测定每个温度下EPS的产量。 （7）正交实验优化发酵条件：结合单因素实验分析结果，乳酸菌产EPS的主要影响因素为乳糖、接种量和pH。我们采用 L9（33）正交表进行试验，如表4所示，选择发酵的最佳条件。表4 L 9 (33 )设计试验 水平因素乳糖添加量（g/l）pH接种量/%11

41、9.54.54.522055320.55.55.5 7.薄板层析法（TLC）分析多糖的单糖组成25 （1）硅胶G羧甲基纤维钠薄层的制备：取羧甲基纤维素0.2g，溶于25mL水中，在水浴上加热搅拌使完全溶解，静置一夜，取上层清液，置烧杯中加入硅胶G粉8g混合成均匀的稀糊，直至混合成搅拌时，物质能够在玻璃棒上掉下时成一条状，放置片刻，待杯里没有气泡后用药匙取一定量，分别倒在一定大小的玻璃片上，均匀涂布成0.250.5mm厚度，轻轻振动玻璃板，使薄层面平整均匀，在水平位置放置，待薄层发白近干，于烘箱中110活化1小时，冷后贮于干燥器内备用。（2）单糖标准溶液的配置：分别称取葡萄糖、半乳糖、果糖、鼠李

42、糖、甘露糖，分别溶于蒸馏水中制得五种单糖标准液，浓度均为1.00mg/mL 。（3）水解多糖样品的制备：称取20mg多糖，加1mol/L硫酸2mol100封管水解5h,再加3.7mgBa(OH)2.7H2O中和硫酸，过滤收集滤液即可。（4）展开系统配置：分别把乙酸乙脂、吡啶、无水乙醇、水按8: 1: 1: 2(体积比)的比例混合摇匀。 （5）显色剂的配置：本实验选用苯胺-二苯胺-磷酸显色剂，2%二苯胺丙酮溶液、2%苯胺丙酮溶液、85%磷酸按 5: 5: 1的比例混合摇匀。 （6）点样：将水解多糖、已知单糖标准液标准液按一定顺序分别点样在薄层板上。点样量约10L，分次滴加，使点样扩散后其直径不超

43、过2mm。 （7）展层：将点好样品的薄层板置于密闭的层析缸中，用配置的展开剂，采用倾斜上行法，将薄层板的下端浸在展开剂中0. 30. 5cm，至展开剂距离薄层板的上端约1cm左右时取出自然风干。 （8）显色：在除去溶剂后的薄层板上，均匀喷上显色剂，烘箱中加热显色。 8.多糖抗氧化性的测定 （1）超氧阴离子自由基(O2 - )清除作用：超氧阴离子自由基(O2 - )清除率的测定参照邻苯三酚自氧化法26。取4.5ml 50mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.2）并与4.2ml蒸馏水混合，25恒温放置20min后立即加入25预热过的1.0ml不同浓度多糖和0.3ml3mmol/L的邻苯三酚

44、溶液，胞外多糖的浓度为0、20、25、50、100、150、200 mg/L，快速摇匀后测定样品在325nm处的吸光度值，每隔30s记录一次，连续记录4min，每个样品平行测定三次。最后一次记录值为A0，第一次记录值为A1。选用Vc做阳性对照。各管的氧化速率及对O2 -的清除率按下式计算：氧化速率=（A0-A1）/4超氧阴离子自由基的清除率(%)=(1-样品邻苯三酚自氧化速率/空白品邻苯三酚自氧化速率)100 （2）羟基自由基(OH)的清除作用：羟基自由基(OH)的清除率的测定参照邻二氮菲-Fe2+ 氧化法27：取75mmol/L邻二氮菲1mL，加入1.5mL150mmol/L磷酸缓冲液（pH

45、7.4）充分混匀后，再加入7.5mmol/LFeSO4溶液1.0mL，每加一管立即摇匀，加0.01%H2O21.0mL，最后以蒸馏水补至总体积为10ml。反应液37温浴1h，测定波长536nm处的吸光度A01,。多糖溶液清除OH的作用，依上法，分别加入1.0mL不同浓度多糖溶液后再加入H2O2，37保温1h，胞外多糖的浓度为0、20、25、50、100、150、200 mg/L，然后测定吸光度值A02。对照管为不加H2O2及多糖溶液，测定吸光度值A03，每个样品平行测定三次。选用Vc做阳性对照，多糖对羟基自由基(OH)的清除率按下式计算： 清除率（%）=（A02-A01）/（A03-A01）三

46、、结果与分析（一）葡萄糖标准曲线 图1葡萄糖标准曲线 葡萄糖标准溶液在波长490nm处有最大吸收峰，故可选择490nm为测定波长；由图1可知，葡萄糖浓度（X）在10-60ug/mL范围内与吸光度（Y）存在良好的线性关系；（二）胞外多糖产量 将粗多糖的吸光度值（Y）代入回归方程，得多糖浓度。再按公式计算得多糖含量，如表5所示。表5胞外多糖产量菌种名称发酵液体积（mL）多糖含量（%）EPS产量（mg/L）德式乳杆菌20056.7297.68保加利亚杆菌20081.65469.49嗜热链球菌20073.75361.38 由表5看出 保加利亚杆菌和嗜热链球菌EPS产量相对较高，故本实验筛选出上述两种菌

47、进行发酵条件的优化。（三）单因素及正交实验优化发酵条件 1.碳源的影响不同碳源对EPS产量的影响见图2，从图2可以看出，对保加利亚杆菌而言，用乳糖作为碳源时，EPS的产量最高，达到490.28mg/L；其次为蔗糖，达到了474.94mg/L；产量最低的为麦芽糖，只有283.02mg/L。相对于嗜热链球菌，用乳糖作为碳源时，EPS的产量最高，达到402.37mg/L；其次为蔗糖，达到了385.06mg/L；产量最低的为麦芽糖，只有186.30mg/L。所以乳糖是保加利亚杆菌和嗜热链球菌产EPS的最适宜碳源。 图2碳源对EPS产量的影响 2.乳糖添加量的影响 不同乳糖添加量对EPS产量的影响见图3

48、，由图3可见，乳糖添加量为20 g/L时，发酵液中的EPS产量最大，保加利亚杆菌发酵液达到了482.31mg/L，而嗜热链球菌发酵液达到了379.33mg/L。乳糖添加量在10-20g/L范围内，EPS的产量随乳糖添加量增大而增大：当乳糖添加量超过20 g/L时， EPS的产量随乳糖添加量的增大而减小。所以，培养保加利亚杆菌和嗜热链球菌产EPS的乳糖浓度最适宜添加量是20 g/L。图3乳糖添加量对EPS产量的影响 3.接种量的影响不同接种量对EPS产量的影响见图4，由图4可以看出，接种量为5%，发酵液中的EPS产量最大，保加利亚杆菌EPS产量达到487.03mg/L，嗜热链球菌EPS产量达到4

49、02.39mg/L。接种量在3%-5%时，EPS产量随接种量增大而增大；接种量在5%-7%时，EPS产量随接种量增大而减小。所以最适宜的接种量是5%。图4接种量对EPS产量的影响 4.pH的影响不同pH对EPS产量的影响见图5，由图5看出，对保加利亚乳杆菌而言， pH5.0时EPS产量最大，达到487.22 mg/L；其次是pH4.0时，EPS的产量为430.55mg/L； 产量最低的是pH为8.0时，为375.10 mg/L。相对于嗜热链球菌，pH5.0时EPS产量最大，达到399.25mg/L；其次是pH4.0时，EPS的产量为364.20mg/L；产量最低的是pH为8.0时，为217.8

50、5mg/L。 图5pH对EPS产量的影响 5.培养时间的影响不同培养时间对EPS产量的影响见图6，由图6可以看出，培养24h后，EPS产量达到最大，保加利亚乳杆菌EPS产量达到490.32mg/L，嗜热链球菌EPS产量达到374.51mg/L。当培养时间从0至12 h，EPS的合成量增长缓慢，培养时间在12-21 h这个阶段EPS量几乎呈直线上升趋势；在培养24 h后，EPS量达到最大；之后，随着发酵时间的延长，EPS产量逐渐降低，渐呈平缓下降的趋势。因此，培养24 h是保加利亚杆菌和嗜热链球菌产EPS的最适宜培养时间。 图6培养时间对EPS产量的影响 6.培养温度的影响 不同培养温度对EPS

51、产量的影响见图7，由图7可知，培养温度在33-37 时，EPS的产量逐渐增大，在37 时保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的EPS产量达到最大，保加利亚乳杆菌EPS产量达到487.54mg/L，嗜热链球菌的EPS产量达到369.44mg/L。当培养温度继续升高（37-41 ），EPS的产量又降低，在41下EPS的产量最低。因此，37 是保加利亚杆菌和嗜热链球菌EPS的最适宜培养温度。图7培养温度对EPS产量的影响 7.正交实验和验证实验 结合单因素实验分析结果可知，乳酸细菌产EPS的主要影响因素为乳糖、接种量和pH。设计正交实验，统计实验结果如表6，表7所示。 （1）正交实验： 表6保加利亚杆菌正交实

52、验结果实验号乳糖添加量/ApH/B接种量/CEPS产量/（mg/L）1111379.932122497.273133489.314212488.645223495.236231493.717313479.358321486.529332499.13K11366.511347.921360.16=4309.09K21477.581479.021485.04K31465.001482.151463.89k1455.50449.31453.39k2492.53493.00495.01k3488.33494.05487.96R37.0344.7441.62 由表6、表7可知，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌

53、实验号9（A 3 B 3 C 2）的条件最佳，保加利亚乳杆菌EPS的产量达到499.13mg/L，嗜热链球菌EPS的产量达到412.36mg/L。由表6、表7的极差R值可知，乳糖添加量、pH和接种量对保加利亚乳杆菌EPS产量高低均有着较大的影响，其中pH的影响最大，其次是接种量，乳糖添加量的影响相对较小。 表7嗜热链球菌正交实验结果实验号乳糖添加量/APh/B接种量/CEPS产量/（mg/L）1111326.542122409.883133401.154212399.645223407.866231402.277313392.588321397.249332412.36K11137.571118.461126.05=3549.52K21209.771214.981221.88K31202.181215.781201.59k1379.19372.82375.35k2403.26404.99407.29k3400.73405.26400.53R24.0732.4431.94 （2）验证实验：由表6、表7 的各因素同一水平累计（K1、K2、K3）和均值（k1、k2、k3 ）知，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的最优方案均为A2B3C2。计算出的最优方案A2B3C2 与表6、表7实验所得的最优方案A3B3C 2不一致，安排一轮验证