《天然药物分析》4章TLC

1、1 中药中药( (天然药物天然药物) )分析分析 第四章第四章色谱分析法的应用2 色谱法（色谱法（Chromatography）是一种物理或物理）是一种物理或物理化学的分离分析方法。形成气相色谱、液相色谱、化学的分离分析方法。形成气相色谱、液相色谱、薄层色谱、离子色谱、亲和色谱、超临界流体色谱、薄层色谱、离子色谱、亲和色谱、超临界流体色谱、毛细管电泳、电色谱等分支。各种色谱仪器与质谱、毛细管电泳、电色谱等分支。各种色谱仪器与质谱、红外、核磁等技术联用创立了复杂混合物分析的新红外、核磁等技术联用创立了复杂混合物分析的新手段，成为发展最快、应用最广的分析方法之一。手段，成为发展最快、应用最广的分析

2、方法之一。 由于色谱分析具有分离与由于色谱分析具有分离与“在线在线”分析两种功能，分析两种功能，能很好的排除组分间的相互干扰，逐个将组分进行能很好的排除组分间的相互干扰，逐个将组分进行定性、定量分析，还能制备纯成分，因此在药物分定性、定量分析，还能制备纯成分，因此在药物分析中，特别是中药材、中成药、复方制剂分析、痕析中，特别是中药材、中成药、复方制剂分析、痕量分析、杂质检查、药材鉴别时，一般首选色谱分量分析、杂质检查、药材鉴别时，一般首选色谱分析法。各国药典都大量收载色谱法就是很好的证明。析法。各国药典都大量收载色谱法就是很好的证明。 3l 分离原理主要是利用物质在流动相与固定分离原理主要是利

3、用物质在流动相与固定相两相中的分配系数差异、吸附与解吸差异相两相中的分配系数差异、吸附与解吸差异或其他差异而被分离。或其他差异而被分离。l 当两相相对运动时，样品中的各组分将在当两相相对运动时，样品中的各组分将在两相中多次分配（可达两相中多次分配（可达2000100万次），这万次），这样就使得原来那种微小的性质差异，产生很样就使得原来那种微小的性质差异，产生很大的分离效果，分配系数大的组分迁移速度大的分离效果，分配系数大的组分迁移速度慢，反之分配系数小的组分迁移速度快而被慢，反之分配系数小的组分迁移速度快而被分离。分离。l 色谱法主要是一种分离技术，基础是色谱法主要是一种分离技术，基础是“差差

4、速迁移速迁移”。 4 第一节第一节 色谱法的分类与色谱法的分类与 柱色谱法、纸色谱法的应用柱色谱法、纸色谱法的应用 l 一色谱法的分类一色谱法的分类l 1按两相所处的状态分类按两相所处的状态分类l （1）气相色谱法（）气相色谱法（gas chromatography，GC）；）；l （2）液相色谱法（）液相色谱法（liquid chromatography，LC）;l （3）超临界流体色谱法（）超临界流体色谱法（supercripical fluid chromatograph，SFC）。）。 5l2按操作方法分类按操作方法分类l （1）柱色谱法（）柱色谱法（column chromatogr

5、aphy）l （2）纸色谱法（）纸色谱法（paper chromatography）l （3）薄层色谱法（）薄层色谱法（thin-layer chromatography） l 纸色谱法和薄层色谱法亦称为平面色谱法（纸色谱法和薄层色谱法亦称为平面色谱法（planar chromatography）63按分离原理分类按分离原理分类 l （1）吸附色谱法（）吸附色谱法（adsorption chromatography）利用吸附）利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差别而使之分离的色谱法称剂表面对不同组分物理吸附性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附色谱法。吸附色谱有为吸附色谱法。吸附色谱有GSC

6、和和LSC等。等。l （2）分配色谱法（）分配色谱法（partition chromatography）利用固定液）利用固定液对不同组分分配性能的差异而使之分离的色谱法称为分配色谱对不同组分分配性能的差异而使之分离的色谱法称为分配色谱法。分配色谱法有法。分配色谱法有GLC和和LLC等。等。 l （3）离子交换色谱法（）离子交换色谱法（ion exchange chromatography，IEC） 是用离子交换树脂作固定相，利用树脂上离子交换基团是用离子交换树脂作固定相，利用树脂上离子交换基团对样品离子交换能力的差别而使之分离的色谱法称为离子交换对样品离子交换能力的差别而使之分离的色谱法称为离

7、子交换色谱法。色谱法。l （4）尺寸排阻色谱法（）尺寸排阻色谱法（size exclusion chromatography，SEC） 用多孔凝胶作固定相，利用凝胶孔穴对不同尺寸的分用多孔凝胶作固定相，利用凝胶孔穴对不同尺寸的分子排阻效应的差别使之分离的色谱法称为尺寸排阻色谱法。子排阻效应的差别使之分离的色谱法称为尺寸排阻色谱法。 7l （5）亲和色谱法（）亲和色谱法（affinity chromatography）用具有生物活）用具有生物活性的配位基（如抗体、酶等）键合到非活性载体或基质表面构性的配位基（如抗体、酶等）键合到非活性载体或基质表面构成固定相，利用生物分子与固定相表面上配位基的专

8、属亲和力成固定相，利用生物分子与固定相表面上配位基的专属亲和力使之分离的色谱法称为亲和色谱法。使之分离的色谱法称为亲和色谱法。l （6）毛细管电泳法（）毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）样品）样品在毛细管的液体介质中，在电场力作用下的分离分析方法称为在毛细管的液体介质中，在电场力作用下的分离分析方法称为毛细管电泳法。毛细管电泳法。l （7）毛细管电色谱法（）毛细管电色谱法（capillary electro- chromatography，CEC）分离机制是靠色谱与电场两种作用力，依据样品组分的）分离机制是靠色谱与电场两种作用力，依据样品组分的分配系数及电

9、泳速度的差别使之分离的色谱法称为毛细管电色分配系数及电泳速度的差别使之分离的色谱法称为毛细管电色谱法。谱法。 8二柱色谱法的应用二柱色谱法的应用 l 2.洗脱剂的选择洗脱剂的选择 所用溶剂的吸附力应较弱，一般石油醚、苯、氯仿等为弱洗所用溶剂的吸附力应较弱，一般石油醚、苯、氯仿等为弱洗脱剂；乙醚、异丙醚为中等强度的洗脱剂；低分子量醇及酮为脱剂；乙醚、异丙醚为中等强度的洗脱剂；低分子量醇及酮为强洗脱剂。强洗脱剂。l 对未知样品的洗脱，常先试用石油醚、石油醚对未知样品的洗脱，常先试用石油醚、石油醚-苯不同比例苯不同比例的混合液、苯、苯的混合液、苯、苯-乙醚混合液、乙醚、乙醚乙醚混合液、乙醚、乙醚-甲

10、醇混合液及甲甲醇混合液及甲醇等。物质被洗脱出的先后顺序一般是：饱和烃、烯烃、双烯醇等。物质被洗脱出的先后顺序一般是：饱和烃、烯烃、双烯烃、芳烃、醚、酯、酮、醇及羧酸。烃、芳烃、醚、酯、酮、醇及羧酸。l 3.吸附剂应具备的条件吸附剂应具备的条件l （1）能可逆地吸附待分离的物质；）能可逆地吸附待分离的物质；l （2）不会引起被吸附物质的化学变化；）不会引起被吸附物质的化学变化；l （3）吸附剂的粒度适当，能使洗脱剂以一定速率流出）吸附剂的粒度适当，能使洗脱剂以一定速率流出（56ml/min）。）。9常用吸附剂的种类l （1）硅胶）硅胶l （2）氧化铝）氧化铝l （3）大孔树脂）大孔树脂l （4）

11、硅藻土）硅藻土l （5）Sephadex LH 20l （6）C-18,C-810l 色层的分离色层的分离l 可以采用推出法和洗脱法。色带的检出可以采用可以采用推出法和洗脱法。色带的检出可以采用直观（有色物质）、紫外光照射，采用含荧光素的直观（有色物质）、紫外光照射，采用含荧光素的吸附剂，用显色剂显色。吸附剂，用显色剂显色。l 大孔树脂大孔树脂l 分离中药水溶性成分的优势：分离中药水溶性成分的优势：l （1）吸附容量大、选择性好；）吸附容量大、选择性好；l （2）再生简单，可重复使用；）再生简单，可重复使用；11三纸色谱法的应用三纸色谱法的应用 l R 值的定义值的定义 （Rst）l 影响影响

12、R 值的因素：值的因素：l 如色谱层析条件中的流动相组成，展开时的温度，如色谱层析条件中的流动相组成，展开时的温度，流动相蒸气的饱和程度等，都将影响物质的流动相蒸气的饱和程度等，都将影响物质的R 值。值。l 而决定物质在一定的色谱条件时的而决定物质在一定的色谱条件时的R 值，主要是值，主要是物质本身的极性。一般来说，化合物极性大（或亲物质本身的极性。一般来说，化合物极性大（或亲水性强）在水中分配量就多，在纸色谱上水性强）在水中分配量就多，在纸色谱上R 值就小。值就小。相反亲脂性强的化合物，在纸色谱中的相反亲脂性强的化合物，在纸色谱中的R 值就大。值就大。 12第二节第二节 薄层色谱法的应用薄层

13、色谱法的应用 l 目前薄层色谱法已进入分离高效化、定量仪器化、数据处理目前薄层色谱法已进入分离高效化、定量仪器化、数据处理自动化阶段，与气相色谱法、高效液相色谱法并列为三种最常自动化阶段，与气相色谱法、高效液相色谱法并列为三种最常用的色谱分析方法。用的色谱分析方法。l l 吸附薄层的分离原理是将吸附薄层的分离原理是将A、B两组分的混合试样溶液，点两组分的混合试样溶液，点在薄层板的一端，在密闭的容器中，用适当的展开剂在薄层板的一端，在密闭的容器中，用适当的展开剂（developer）展开。此时）展开。此时A、B组分不断地被吸附剂所吸附，组分不断地被吸附剂所吸附，又被展开剂所溶解而解吸，且随之向前

14、移动。由于吸附剂对又被展开剂所溶解而解吸，且随之向前移动。由于吸附剂对A、B具有不同的吸附能力，展开剂对具有不同的吸附能力，展开剂对A、B也有不同的溶解、解吸也有不同的溶解、解吸能力，因此当展开剂不断展开，能力，因此当展开剂不断展开，A、B会在吸附剂和展开剂之会在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、解吸附，从而产生差速迁移得到分离。间发生连续不断的吸附、解吸附，从而产生差速迁移得到分离。l l 13l 薄层色谱的优点是：薄层色谱的优点是：l （1）设备简单；）设备简单；l （2）展开时间短；）展开时间短；l （3）分离效果好；）分离效果好；l （4）显色方便，也可喷洒腐蚀性显色剂、）显色方便

15、，也可喷洒腐蚀性显色剂、加热等；加热等；l （5）灵敏度高。）灵敏度高。 14薄层色谱法按分离机理分类可有五种形式薄层色谱法按分离机理分类可有五种形式l （1）吸附薄层色谱；常用硅胶、硅藻土、氧化铝为）吸附薄层色谱；常用硅胶、硅藻土、氧化铝为吸附剂；吸附剂；l （2）分配薄层色谱；常用纤维素、硅藻土、或硅胶）分配薄层色谱；常用纤维素、硅藻土、或硅胶为载体，在载体上吸附一定量的水或其它溶剂（如为载体，在载体上吸附一定量的水或其它溶剂（如缓冲液、酸溶液、甲酰胺、丙二醇等）为固定相，缓冲液、酸溶液、甲酰胺、丙二醇等）为固定相，另以与固定相不相混溶（或部分混溶）的展开剂作另以与固定相不相混溶（或部分混

16、溶）的展开剂作为流动相。为流动相。l （3）离子交换薄层色谱：用离子交换剂制作薄层。）离子交换薄层色谱：用离子交换剂制作薄层。l （4）排阻薄层色谱：用葡聚糖凝胶制作薄层。当展）排阻薄层色谱：用葡聚糖凝胶制作薄层。当展开剂流过薄层时，混合组分按分子大小的不同，在开剂流过薄层时，混合组分按分子大小的不同，在葡聚糖凝胶薄层上反复进行扩散和排阻，从而使混葡聚糖凝胶薄层上反复进行扩散和排阻，从而使混合物达到分离。合物达到分离。l （5）亲和色谱。）亲和色谱。15l 应用最广泛的是吸附薄层色谱，主要是利用应用最广泛的是吸附薄层色谱，主要是利用吸附过程的两个规律：吸附过程的两个规律：l （1）吸附是可逆的

17、、吸附与解吸附处于一）吸附是可逆的、吸附与解吸附处于一个动态平衡中；个动态平衡中；l （2）吸附剂对不同物质的吸附行为有差异。）吸附剂对不同物质的吸附行为有差异。l 主要的吸附剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺等。主要的吸附剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺等。被吸附物与吸附剂之间的作用力包括色散力、被吸附物与吸附剂之间的作用力包括色散力、静电力、诱导力和氢键作用力等。静电力、诱导力和氢键作用力等。l 强弱顺序是：强弱顺序是：l 氢键作用力氢键作用力静电力静电力诱导力诱导力色散力色散力16l 含单官能团的化合物与硅胶或氧化铝亲和力大小次序：含单官能团的化合物与硅胶或氧化铝亲和力大小次序：l 羧酸醇、酰胺伯胺酯、醛

18、、酮腈、叔胺、硝基化合羧酸醇、酰胺伯胺酯、醛、酮腈、叔胺、硝基化合物醚烯卤化烃烷物醚烯卤化烃烷l （1）分子中双键数目增加，吸附力也增大，特别是当双键处）分子中双键数目增加，吸附力也增大，特别是当双键处于共轭时更是如此；芳环的影响比双键大；于共轭时更是如此；芳环的影响比双键大；l （2）芳香化合物随着环的数目增加，吸附力增大；）芳香化合物随着环的数目增加，吸附力增大；l （3）同系物中分子量愈大，吸附力也愈强。）同系物中分子量愈大，吸附力也愈强。l （4）分子中极性官能团数目增大，一般情况下吸附力增加，）分子中极性官能团数目增大，一般情况下吸附力增加，但是若两个官能团处于邻位，能发生分子内氢键

19、缔合时，则它但是若两个官能团处于邻位，能发生分子内氢键缔合时，则它们与吸附剂形成氢键的能力削弱。们与吸附剂形成氢键的能力削弱。l 在薄层色谱中，就是凭借上述基本概念来选择吸附剂、展开在薄层色谱中，就是凭借上述基本概念来选择吸附剂、展开剂和估定剂和估定R值顺序的。值顺序的。 17一薄层色谱实验技术一薄层色谱实验技术 l （一）吸附剂的选择（一）吸附剂的选择 在薄层色谱中吸附剂与展开剂的选择，是色谱分离能否获得在薄层色谱中吸附剂与展开剂的选择，是色谱分离能否获得成功的关键。成功的关键。 l 1.硅胶略带酸性，适用于分离酸性和中性物质，商品硅胶分为硅胶略带酸性，适用于分离酸性和中性物质，商品硅胶分为

20、两类：硅胶两类：硅胶H（不加石膏），硅胶（不加石膏），硅胶G（加石膏）；（加石膏）；l 2.氧化铝略带碱性，适用于分离碱性和中性物质；氧化铝略带碱性，适用于分离碱性和中性物质；l 3.聚酰胺多用于分离黄酮类成分。聚酰胺多用于分离黄酮类成分。l 应该根据被分离物质的极性大小来选择吸附活度合适的吸附应该根据被分离物质的极性大小来选择吸附活度合适的吸附剂，对极性小的试样可选择吸附活性较高的吸附剂，对极性大剂，对极性小的试样可选择吸附活性较高的吸附剂，对极性大的试样，选择活度较低的吸附剂。的试样，选择活度较低的吸附剂。 l 吸附剂的活化主要是通过一定温度烘烤，除去颗粒中的水分吸附剂的活化主要是通过一定

21、温度烘烤，除去颗粒中的水分 18l 吸附剂的粒度大小，对层析速度、分离效果及吸附剂的粒度大小，对层析速度、分离效果及R 值均有明显影响，颗粒太大，则其总面积相对减小值均有明显影响，颗粒太大，则其总面积相对减小 ，吸附量降低，展开速度快，层析后组分的斑点扩散，吸附量降低，展开速度快，层析后组分的斑点扩散，使分离效果变差。颗粒较小，层析速度较慢，但颗使分离效果变差。颗粒较小，层析速度较慢，但颗粒太小，不易于干法铺板，一般颗粒以粒太小，不易于干法铺板，一般颗粒以150200目目比较合适，湿法铺板以比较合适，湿法铺板以250300目为好。目为好。l 根据薄层分离的需要，还可制成酸性，碱性或根据薄层分离

22、的需要，还可制成酸性，碱性或pH缓冲薄层和荧光薄层等。缓冲薄层和荧光薄层等。 19（二）薄层板的制备（二）薄层板的制备 l 1干法干法l l 2湿法湿法 l 常用粘合剂有煅石膏、羧甲基纤维素钠（常用粘合剂有煅石膏、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）和淀粉。煅石膏用量一般为吸附剂的和淀粉。煅石膏用量一般为吸附剂的10 % 20 %；CMC-Na溶液一般配成溶液一般配成0.3 % 1.0 %；淀粉为；淀粉为5 % ，可用于铺制不同需求的薄层板。铺好的薄层板在室可用于铺制不同需求的薄层板。铺好的薄层板在室温下晾干后，再入烘箱内活化温下晾干后，再入烘箱内活化 20（三）上样方式（三）上样方式 l 样品溶于

23、易挥发的有机溶剂中，如甲醇、乙醇、样品溶于易挥发的有机溶剂中，如甲醇、乙醇、氯仿、丙酮等，尽量不用水，否则会降低吸附剂活氯仿、丙酮等，尽量不用水，否则会降低吸附剂活性。用毛细管、微量注射器、微量点样器（定量毛性。用毛细管、微量注射器、微量点样器（定量毛细管）、微量吸管等将样品液滴加在薄层板上，注细管）、微量吸管等将样品液滴加在薄层板上，注意展开剂不能浸过起始线。意展开剂不能浸过起始线。l 接触上样接触上样 l TAS法法 21（四）展开（四）展开 l 1.展开剂的基本要求展开剂的基本要求l 1）能使待测组分很好的溶解）能使待测组分很好的溶解l 2）使待测组分与杂质分开，而待测各组分之间能达）使

24、待测组分与杂质分开，而待测各组分之间能达到基线分离，到基线分离，R1.5l 3）使展开后的组分斑点圆而集中，不应有拖尾现象）使展开后的组分斑点圆而集中，不应有拖尾现象l 4）使待测组分的）使待测组分的Rf值最好在值最好在0.4 0.6；组分多，也；组分多，也可在可在0.2 0.8之间之间l 5）混合溶剂应临时新配，一般只能使用一次）混合溶剂应临时新配，一般只能使用一次l a.低沸点的溶剂容易挥发低沸点的溶剂容易挥发l b.极性大的溶剂优先被吸附剂吸附，使比例变小极性大的溶剂优先被吸附剂吸附，使比例变小l c.在第一次展开后，吸附剂的杂质可能被带入在第一次展开后，吸附剂的杂质可能被带入22l 6

25、）与组分能发生化学反应或在某些吸附剂上能聚合）与组分能发生化学反应或在某些吸附剂上能聚合的溶剂不宜用的溶剂不宜用l 有些有机溶剂含有少量或微量杂质，会影响色谱有些有机溶剂含有少量或微量杂质，会影响色谱行为行为l 7）具有适中的沸点和小的粘度）具有适中的沸点和小的粘度23l2展开剂的选择展开剂的选择l 在吸附薄层色谱中，理想的分离是得到一在吸附薄层色谱中，理想的分离是得到一组组Rf值在值在0.2 0.8之间的清晰斑点。展开剂之间的清晰斑点。展开剂的极性愈大，则对同一化合物的洗脱能力也的极性愈大，则对同一化合物的洗脱能力也愈大，愈大，Rf值增加。若发现值增加。若发现Rf值太小时，可改值太小时，可改

26、用一种极性较大的展开剂，或在原来展开剂用一种极性较大的展开剂，或在原来展开剂中加入一定量另一种极性较大的溶剂。中加入一定量另一种极性较大的溶剂。l 选择展开剂时一般要考虑吸附活度、被分选择展开剂时一般要考虑吸附活度、被分离化合物的极性及溶剂的极性这三者的关系。离化合物的极性及溶剂的极性这三者的关系。l 24l 选择展开剂有两个原则：选择展开剂有两个原则：l （1 1）展开剂对被分离物质应有一定的解吸）展开剂对被分离物质应有一定的解吸能力，但又不能太大。一般展开剂极性应比能力，但又不能太大。一般展开剂极性应比被分离物质极性略小。被分离物质极性略小。l （2 2）展开剂应对被分离物质有一定的溶解）

27、展开剂应对被分离物质有一定的溶解度，如被分离的物质不能溶解于展开剂中，度，如被分离的物质不能溶解于展开剂中，就不能随展开剂向前移动。就不能随展开剂向前移动。25l 在硅胶薄层上展开剂洗脱能力递增顺序为：在硅胶薄层上展开剂洗脱能力递增顺序为：l 石油醚石油醚 四氯化碳四氯化碳 苯苯 氯仿氯仿 二氯甲烷二氯甲烷 乙醚乙醚 乙酸乙酯乙酸乙酯 丙酮丙酮 乙腈乙腈 甲醇。甲醇。l 在氧化铝薄层上展开剂洗脱能力顺序为：在氧化铝薄层上展开剂洗脱能力顺序为：l 异辛烷异辛烷 石油醚石油醚 环己烷环己烷 四氯化碳四氯化碳 苯苯 乙醚乙醚 氯仿氯仿 二氧甲烷二氧甲烷 二氧乙烷二氧乙烷 丙酮丙酮 乙酸乙酯乙酸乙酯

28、乙腈乙腈 异丙醇异丙醇 正丙醇正丙醇 乙醇乙醇 甲醇甲醇 乙酸。乙酸。l 实际工作中常用两种或两种以上混合溶剂作展开剂，有利于实际工作中常用两种或两种以上混合溶剂作展开剂，有利于调配展开剂的极性。调配展开剂的极性。l “基础溶剂基础溶剂” 、“洗脱溶剂洗脱溶剂”26l 聚酰胺薄层色谱是一种特殊形式的吸附色谱聚酰胺薄层色谱是一种特殊形式的吸附色谱l l 聚酰胺与被分离物质形成氢键的能力不但决定于样品成分本聚酰胺与被分离物质形成氢键的能力不但决定于样品成分本身，也与溶剂介质有关，一般吸附剂在水中形成氢键能力最强，身，也与溶剂介质有关，一般吸附剂在水中形成氢键能力最强，在有机溶剂中形成氢键的能力较弱

29、，在酰胺类中形成氢键的能在有机溶剂中形成氢键的能力较弱，在酰胺类中形成氢键的能力最弱，力最弱，l 各类展开剂洗脱能力大小的顺序大致为：水乙醇甲醇各类展开剂洗脱能力大小的顺序大致为：水乙醇甲醇丙酮稀丙酮稀NH4OH（NaOH）溶剂甲酰胺。也可用混合溶剂展）溶剂甲酰胺。也可用混合溶剂展开，如水开，如水- 乙醇（：乙醇（：1）；水）；水- 甲醇（：甲醇（：1）等。）等。 l 3. 展开方式展开方式27（五）显色（五）显色l 1. 显色方式显色方式l 1）蒸气显色）蒸气显色 2）喷雾显色）喷雾显色 3）紫外光灯显色）紫外光灯显色l 2. 显色剂的种类显色剂的种类l 1）通用显色剂）通用显色剂l A.

30、碘碘l B. 碳化试剂碳化试剂l C. 磷钼酸磷钼酸l D. 三氯化锑或五氯化锑三氯化锑或五氯化锑l E. 水水l 2）专属性显色剂）专属性显色剂28二二. 薄层扫描法薄层扫描法 l （一）测定原理（一）测定原理l 薄层扫描仪的单色光透过薄层板上的斑点，此时部薄层扫描仪的单色光透过薄层板上的斑点，此时部分单色光被斑点吸收，使透射光的强度减弱，通过分单色光被斑点吸收，使透射光的强度减弱，通过直接测量透射光的强度来测定的方法称为透射法。直接测量透射光的强度来测定的方法称为透射法。l 而使单色光从薄层板上的斑点表面反射出来，此时而使单色光从薄层板上的斑点表面反射出来，此时部分单色光被斑点吸收，使反射

31、光的强度减弱，通部分单色光被斑点吸收，使反射光的强度减弱，通过直接测量反射光的强度来测定的方法则称为反射过直接测量反射光的强度来测定的方法则称为反射法。法。l 若利用两束不同波长的单色光若利用两束不同波长的单色光S和和 R交替照射交替照射在同一位置上，测定其吸收值差在同一位置上，测定其吸收值差A来计算样品含量来计算样品含量的方法称为双波长测定法。的方法称为双波长测定法。 29（二）测量方法（二）测量方法 l 1透射法透射法 l 一般薄层用的玻璃板，能吸收一般薄层用的玻璃板，能吸收200300nm波长的光，因此应波长的光，因此应采用石英板制备薄层，或只用于测定可见光区域采用石英板制备薄层，或只用

32、于测定可见光区域（300700nm）。）。l 2反射法反射法 l 反射法测量时，薄层厚度对测定结果的影响较透射法为小，反射法测量时，薄层厚度对测定结果的影响较透射法为小，但薄层表面状况影响较大。但薄层表面状况影响较大。l 3荧光法荧光法l 是以能激发荧光的物质为对象，基线稳定，峰面积与浓度在是以能激发荧光的物质为对象，基线稳定，峰面积与浓度在比较大的范围内呈线性关系比较大的范围内呈线性关系 l 若化合物本身无荧光，但含有与荧光试剂反应的官能基团，若化合物本身无荧光，但含有与荧光试剂反应的官能基团，经荧光基团处理后可生成荧光化合物也可用荧光法测定；经荧光基团处理后可生成荧光化合物也可用荧光法测定

33、；l 对无荧光化合物也可采用荧光熄灭法对无荧光化合物也可采用荧光熄灭法 l 30（三）光源的选择（三）光源的选择 l 1可见光可见光l 薄层展开后的斑点本身有颜色，或喷以显色剂使斑点显色，薄层展开后的斑点本身有颜色，或喷以显色剂使斑点显色，斑点的吸收曲线在可见光区。以钨灯为光源。斑点的吸收曲线在可见光区。以钨灯为光源。l 2紫外光紫外光l 薄层斑点中的物质对紫外光有吸收，用紫外光扫描。这样可薄层斑点中的物质对紫外光有吸收，用紫外光扫描。这样可不经显色，避免了显色引起的误差，方法简便，灵敏度高。但不经显色，避免了显色引起的误差，方法简便，灵敏度高。但只适用于反射法。只适用于反射法。l 值得注意的

34、是，化合物斑点在薄层上的值得注意的是，化合物斑点在薄层上的 max与其在溶液中与其在溶液中的可能不同。以氘灯为光源。的可能不同。以氘灯为光源。l 3荧光荧光l 利用在紫外光下物质被激发产生荧光强弱来测定化合物含量。利用在紫外光下物质被激发产生荧光强弱来测定化合物含量。一般以高压汞灯或氙灯为光源。一般以高压汞灯或氙灯为光源。31（四）扫描方式（四）扫描方式 l 1线性扫描线性扫描 线性扫描对斑点的要求高，最好是理想的圆形斑线性扫描对斑点的要求高，最好是理想的圆形斑点，浓度分布成同心圆状。点，浓度分布成同心圆状。l 这样扫描得到的轮廓曲线可成对称的峰形，同时这样扫描得到的轮廓曲线可成对称的峰形，同

35、时要求狭缝光束的长度必须大于斑点的直径，且光束要求狭缝光束的长度必须大于斑点的直径，且光束的中心与斑点的中心在一条线上。的中心与斑点的中心在一条线上。l 2锯齿形扫描锯齿形扫描l 锯齿扫描的优点是对于非对称性斑点从不同方向锯齿扫描的优点是对于非对称性斑点从不同方向扫描所的积分值相似，且精密度比线性扫描高。扫描所的积分值相似，且精密度比线性扫描高。 l 32三薄层色谱定性分析三薄层色谱定性分析 l （一）薄层色谱定性分析（以（一）薄层色谱定性分析（以Rf值为基准）值为基准）l 薄层色谱中的薄层色谱中的值可作为定性鉴别的依据。应用值可作为定性鉴别的依据。应用定性，一般用待测化合物的纯品作对照，在两

36、种定性，一般用待测化合物的纯品作对照，在两种或两种以上展开剂系统中展开，若样品中斑点的或两种以上展开剂系统中展开，若样品中斑点的值与纯品值与纯品值都相同，可肯定两者为同一化合物。值都相同，可肯定两者为同一化合物。 但在中药鉴定中也常用标准药材为对照品，用以鉴但在中药鉴定中也常用标准药材为对照品，用以鉴别药材的真伪。别药材的真伪。l 为消除实验中难以避免的误差，提高为消除实验中难以避免的误差，提高值的重现值的重现性，可采用相对比移值性，可采用相对比移值st定性，即用一个待测化定性，即用一个待测化合物相近的已知化合物做相对标准，在同一条件下合物相近的已知化合物做相对标准，在同一条件下平行展开测定，

37、求两者平行展开测定，求两者值的比值作为鉴定的依据值的比值作为鉴定的依据（同纸色谱）（同纸色谱） 33影响薄层色谱分析的主要因素： l 1样品的预处理及供试液的制备样品的预处理及供试液的制备l 一般认为薄层色谱所用固定相（薄层板）可即用即弃，不怕一般认为薄层色谱所用固定相（薄层板）可即用即弃，不怕供试液中杂质的污染，因而样品无需净化精制。但在实践中，供试液中杂质的污染，因而样品无需净化精制。但在实践中，由于中药的成分复杂，未知成分多，供试液中溶出的物质较多，由于中药的成分复杂，未知成分多，供试液中溶出的物质较多，其中有欲测成分也有其他其中有欲测成分也有其他“杂质杂质”，常常由于相互干扰或背景，常

38、常由于相互干扰或背景污染而难以得到满意的分离效果，甚至难以辨认，尤其成方制污染而难以得到满意的分离效果，甚至难以辨认，尤其成方制剂更是如此。剂更是如此。l 所以在许多情况下为了得到一个较为清晰的色谱，样品提取所以在许多情况下为了得到一个较为清晰的色谱，样品提取物经预处理，使供试液得以净化，往往是一个重要的有时甚至物经预处理，使供试液得以净化，往往是一个重要的有时甚至是关键的步骤，制备样品供试液所用的溶剂一般要求溶解度不是关键的步骤，制备样品供试液所用的溶剂一般要求溶解度不宜太大，粘度不宜太高，沸点适中；但中药制剂往往希望各成宜太大，粘度不宜太高，沸点适中；但中药制剂往往希望各成分尽量多地提取出

39、来，最常被选用的是甲醇或乙醇，欲测成分分尽量多地提取出来，最常被选用的是甲醇或乙醇，欲测成分和许多其他和许多其他“杂质杂质”均可能被提取出来，因此供试液的净化就均可能被提取出来，因此供试液的净化就显得更为必要。显得更为必要。 34l样品供试液净化的方法通常有：样品供试液净化的方法通常有： l 单一溶剂萃取法；单一溶剂萃取法；l 分段萃取法；分段萃取法；l 液液萃取法；液液萃取法；l 固液萃取法。固液萃取法。 35l 2薄层色谱的点样技术薄层色谱的点样技术l 点样是薄层色谱的第一步，也是关键的一步，它既关系到能点样是薄层色谱的第一步，也是关键的一步，它既关系到能否得到可以重现的薄层色谱，也关系到

40、定量测定结果的准确与否得到可以重现的薄层色谱，也关系到定量测定结果的准确与否，因为不良的点样是测定误差的最主要的来源。一般在常规否，因为不良的点样是测定误差的最主要的来源。一般在常规薄层板上原点的直径不大于薄层板上原点的直径不大于3mm，高效薄层板要求原点直径，高效薄层板要求原点直径不大于不大于2mm。l 点样量不宜过大，最好控制在点样量不宜过大，最好控制在10l以下，如在一个位置重复以下，如在一个位置重复多次点样时，须注意尽量不要将原点点成一个空心圈。选用溶多次点样时，须注意尽量不要将原点点成一个空心圈。选用溶剂沸点不宜太高（如正丁醇）或太低（如乙醚）。剂沸点不宜太高（如正丁醇）或太低（如乙

41、醚）。l 点样时需注意尽量不要损伤薄层板表面。点样时需注意尽量不要损伤薄层板表面。 36l 3吸附剂的活性与相对湿度的影响吸附剂的活性与相对湿度的影响l 吸附剂的活性是由吸附剂如硅胶的表面能和表面积决定的。吸附剂的活性是由吸附剂如硅胶的表面能和表面积决定的。硅胶的硅醇是亲水性基因，很易吸附水分子而成为水合硅醇基硅胶的硅醇是亲水性基因，很易吸附水分子而成为水合硅醇基而失去活性。而失去活性。l 日常操作时，当活化后硅胶（或氧化铝）薄层板从干燥器中日常操作时，当活化后硅胶（或氧化铝）薄层板从干燥器中取出，自开始点样到展开前，薄层板一般是暴露在实验室的大取出，自开始点样到展开前，薄层板一般是暴露在实验

42、室的大气中，其活性取决于实验室环境的相对湿度。气中，其活性取决于实验室环境的相对湿度。l 在其他条件相同的情况下，相对湿度对许多样品色谱质量的在其他条件相同的情况下，相对湿度对许多样品色谱质量的影响是明显的。通常认为薄层色谱重现性差，在不同的相对湿影响是明显的。通常认为薄层色谱重现性差，在不同的相对湿度下点样和展开是其原因之一。度下点样和展开是其原因之一。l 控制相对湿度可在双槽展开缸的一侧用一定浓度的硫酸溶液，控制相对湿度可在双槽展开缸的一侧用一定浓度的硫酸溶液，密闭放置一定时间（如密闭放置一定时间（如1530min），再加入展开剂于另一侧），再加入展开剂于另一侧展开。也可将点样后的薄层板放

43、入一定的容器中内有一定浓度展开。也可将点样后的薄层板放入一定的容器中内有一定浓度的硫酸溶液或其他调节相对湿度的无机盐水溶液，密闭旋转一的硫酸溶液或其他调节相对湿度的无机盐水溶液，密闭旋转一定时间后，取出，立即在箱中展开。定时间后，取出，立即在箱中展开。l 37l4溶剂蒸气在薄层色谱中的作用溶剂蒸气在薄层色谱中的作用l 薄层色谱与柱色谱的区别之一就是溶剂的蒸气相薄层色谱与柱色谱的区别之一就是溶剂的蒸气相在展开缸中也参与色谱的展开而形成三维的层析过在展开缸中也参与色谱的展开而形成三维的层析过程。展开缸的空间气体在薄层层析过程中起着重要程。展开缸的空间气体在薄层层析过程中起着重要的作用。的作用。l

44、在常规薄层色谱分析中，层析过程是很复杂的，在常规薄层色谱分析中，层析过程是很复杂的，特别是使用多元又能形成两相的展开剂时，即有吸特别是使用多元又能形成两相的展开剂时，即有吸附行为也有分配行为。这时，对薄层色谱的层析过附行为也有分配行为。这时，对薄层色谱的层析过程和结果有很大的影响。程和结果有很大的影响。l 38l 5温度的影响温度的影响l 温度也是影响层析行为的因素之一。温度也是影响层析行为的因素之一。l 最直观的影响是被分离物质的最直观的影响是被分离物质的Rf值和物质的相互值和物质的相互分离度以及斑点的扩散等，在温差较大的不同地点分离度以及斑点的扩散等，在温差较大的不同地点或时间，其它条件相

45、同展开同样的样品，所得色谱或时间，其它条件相同展开同样的样品，所得色谱可能会有差异。可能会有差异。39（二）薄层扫描定性分析（二）薄层扫描定性分析 l 薄层扫描定性分析即在薄层色谱的基础上，通过薄层扫描仪薄层扫描定性分析即在薄层色谱的基础上，通过薄层扫描仪将色谱斑点转换成色谱峰，进而利用对特征峰的确认来进行鉴将色谱斑点转换成色谱峰，进而利用对特征峰的确认来进行鉴别。别。l 1. 薄层扫描薄层扫描l （1）根据分析样品中所含化学成分的特性选择测定方法，如）根据分析样品中所含化学成分的特性选择测定方法，如样品中的化学组分有荧光，样品中的化学组分有荧光，l 则可选择荧光法测定，一般以反射法和荧光法较

46、为常用。则可选择荧光法测定，一般以反射法和荧光法较为常用。l （2）测定波长的选择，一般需选择最大吸收波长）测定波长的选择，一般需选择最大吸收波长s或次强吸或次强吸收波长作为测定波长，若选用双波长测定，收波长作为测定波长，若选用双波长测定，s同前述，同前述，R应应选择吸收较小或无吸收的波长作为参比波长。选择吸收较小或无吸收的波长作为参比波长。 l （3）扫描方式，根据薄层斑点的形状，若为对称性好的圆形）扫描方式，根据薄层斑点的形状，若为对称性好的圆形斑点可选用线性扫描，这样扫描可得到对称的色谱峰；若薄层斑点可选用线性扫描，这样扫描可得到对称的色谱峰；若薄层斑点不规则，可选用锯齿形扫描斑点不规则

47、，可选用锯齿形扫描 l 40l 2特征色谱峰的确认特征色谱峰的确认l （1）对已知样品可根据文献记载，进行薄）对已知样品可根据文献记载，进行薄层扫描及薄层扫描图谱分析。层扫描及薄层扫描图谱分析。l （2）对未知样品应在了解样品来源、被分）对未知样品应在了解样品来源、被分析组成的性质等情况，设计鉴定方案。析组成的性质等情况，设计鉴定方案。l （3）对色谱峰的化学成分归属，则需有标）对色谱峰的化学成分归属，则需有标准对照品对照，为使鉴定结果可靠，通常需准对照品对照，为使鉴定结果可靠，通常需两个以上不同的展开系统验证。两个以上不同的展开系统验证。41四四. 薄层色谱定量分析薄层色谱定量分析 l（一）

48、洗脱法（一）洗脱法l 将待测化合物从薄层吸附剂中提取出来，用分光光将待测化合物从薄层吸附剂中提取出来，用分光光度法定量。共分三步：度法定量。共分三步：l 1斑点定位斑点定位l 1）选择不影响下一步测定的显色方法，如置紫外）选择不影响下一步测定的显色方法，如置紫外灯光下照射或置碘蒸气中显色。灯光下照射或置碘蒸气中显色。l 2）必须用显色剂时，可用对照显色法，即在同一薄）必须用显色剂时，可用对照显色法，即在同一薄层板上将标准品及部分待测样品，喷显色剂。其它层板上将标准品及部分待测样品，喷显色剂。其它部分用玻璃板盖住，待显色后，将未显色的相应位部分用玻璃板盖住，待显色后，将未显色的相应位置的吸附剂画

49、出，以备洗脱。置的吸附剂画出，以备洗脱。42l 2洗脱洗脱l 斑点位置确定后，用吸集器收集或用小刀将斑点位斑点位置确定后，用吸集器收集或用小刀将斑点位置的吸附剂刮下，刮取时要仔细地、定量地将斑点置的吸附剂刮下，刮取时要仔细地、定量地将斑点上吸附剂完全刮下，然后用溶剂洗脱，或刮入离心上吸附剂完全刮下，然后用溶剂洗脱，或刮入离心管中，直接加显色剂及溶剂，一并提取和显色，离管中，直接加显色剂及溶剂，一并提取和显色，离心后取上清液测定。心后取上清液测定。l 3测定测定l 薄层色谱法取样一般为几微克至几十微克，常用薄层色谱法取样一般为几微克至几十微克，常用测定的方法为紫外及可见分光度法。测定中，应刮测定

50、的方法为紫外及可见分光度法。测定中，应刮取相当样品斑点的空白吸附剂，作同样洗脱及显色取相当样品斑点的空白吸附剂，作同样洗脱及显色后，作为空白对照液，以消除吸附剂本身的吸收。后，作为空白对照液，以消除吸附剂本身的吸收。l 薄层色谱分离后用分光光度法测定，方法误差薄层色谱分离后用分光光度法测定，方法误差2%6%。 43（二）薄层扫描定量法（二）薄层扫描定量法 l 1. 方法学考察方法学考察l 新建薄层扫描定量方法必须进行方法学考察，以新建薄层扫描定量方法必须进行方法学考察，以说明新建方法的可靠性，考察的内容有工作曲线、说明新建方法的可靠性，考察的内容有工作曲线、定量结果的精密度及准确度、统计检验等

51、内容。定量结果的精密度及准确度、统计检验等内容。l 44l （1）工作曲线：对于用）工作曲线：对于用Kubelka- Munk曲线校直法曲线校直法进行定量校准的仪器，如进行定量校准的仪器，如CS系列薄层扫描仪，绘制系列薄层扫描仪，绘制色谱峰峰面积色谱峰峰面积A与纯品点样量（与纯品点样量（g/斑点）间的工作斑点）间的工作曲线，并非直接用于定量，其目的是：曲线，并非直接用于定量，其目的是：l 检查所选择的散射参数检查所选择的散射参数SX值是否适宜。值是否适宜。l SX值适宜则工作曲线被校直为直线，否则，调整值适宜则工作曲线被校直为直线，否则，调整SX值再校正，直至在一定点样量范围内工作曲线成值再校

52、正，直至在一定点样量范围内工作曲线成直线为止。直线为止。45l 考察工作曲线是否过原点，以便确定采用一点法考察工作曲线是否过原点，以便确定采用一点法或二点法定量。直线过原点，截距为零时，可用外或二点法定量。直线过原点，截距为零时，可用外标或内标一点法或二点法定量；直线不过原点，截标或内标一点法或二点法定量；直线不过原点，截距不为零时，不能用一点法定量，只能用二点法定距不为零时，不能用一点法定量，只能用二点法定量。量。l 确定点样量的线性范围。既使采用曲线校直，也确定点样量的线性范围。既使采用曲线校直，也只是在一定点样量范围内工作曲线为直线，因此需只是在一定点样量范围内工作曲线为直线，因此需确定

53、点样量的上、下限。为降低定量误差，最好调确定点样量的上、下限。为降低定量误差，最好调整点样量，使供试品与对照品的峰面积相接近。为整点样量，使供试品与对照品的峰面积相接近。为了克服薄层板间差异，外标法及内标法均应采用随了克服薄层板间差异，外标法及内标法均应采用随行标准法即标准溶液与供试品溶液交叉点在同一行标准法即标准溶液与供试品溶液交叉点在同一块薄层板上。块薄层板上。46l （2）精密度考察：取同一供试品溶液，在同一块薄）精密度考察：取同一供试品溶液，在同一块薄层板上以相同点样量平行点层板上以相同点样量平行点5点以上，展开后测定其点以上，展开后测定其峰面积，求算相对标准差（峰面积，求算相对标准差

54、（RSD），作为衡量定量），作为衡量定量分析结果精密度的指标。分析结果精密度的指标。RSD应小于应小于4；有时根据；有时根据要求，还要做异板精密度考察。要求，还要做异板精密度考察。l （3）准确度考察：回收率是衡量定量方法准确度的）准确度考察：回收率是衡量定量方法准确度的指标，常用加样回收率（指标，常用加样回收率（R）来衡量，其值应在）来衡量，其值应在95105之间，测量数据一般为之间，测量数据一般为56个。个。l 将加入纯品的试样溶液、供试品溶液及标准溶液点将加入纯品的试样溶液、供试品溶液及标准溶液点于同一块薄层板上，展开后进行薄层于同一块薄层板上，展开后进行薄层扫描，测定各斑点的峰面积，计

55、算各溶液小组分的扫描，测定各斑点的峰面积，计算各溶液小组分的量，计算回收率（量，计算回收率（R）。）。 47l （4）统计检验：）统计检验：l 统计检验是检验两种方法、两台仪器或两个人测统计检验是检验两种方法、两台仪器或两个人测量的两组实验数据的精密度或准确度（偶然误差或量的两组实验数据的精密度或准确度（偶然误差或系统误差）间是否存在显著性差异，说明新建定量系统误差）间是否存在显著性差异，说明新建定量方法可否代替旧方法或优于旧方法。方法可否代替旧方法或优于旧方法。l 统计检验包括统计检验包括F检验与检验与t检验。检验。F检验即精密度差别检验即精密度差别检验，用以检验两组数据的精密度或偶然误差是

56、否检验，用以检验两组数据的精密度或偶然误差是否存在显著性差异，一般为单侧检验。存在显著性差异，一般为单侧检验。t检验即准确度检验即准确度差别检验，用以检验两组测量数据的平均值或系统差别检验，用以检验两组测量数据的平均值或系统误差是否存在显著性差异。若误差是否存在显著性差异。若t检验证明两种方法测检验证明两种方法测得的均值不存在显著性差异时，则新方法可以代替得的均值不存在显著性差异时，则新方法可以代替旧方法，旧方法，t检验一般为双侧检验。检验一般为双侧检验。 48 2 定量分析定量分析l （1）外标法：外标法是薄层色谱扫描最常用的定量）外标法：外标法是薄层色谱扫描最常用的定量方法，方法简便，但点

57、样必须准确。由于薄层板间方法，方法简便，但点样必须准确。由于薄层板间差异较大，为克服这种差异，应采用随行标准法，差异较大，为克服这种差异，应采用随行标准法，即供试品与标准溶液（或对照溶液）交叉点在同一即供试品与标准溶液（或对照溶液）交叉点在同一块板上，包括外标一点法和外标二点法。块板上，包括外标一点法和外标二点法。l 外标一点法：工作曲线通过原点（截距为零）时外标一点法：工作曲线通过原点（截距为零）时可用外标一点法定量如图可用外标一点法定量如图4-4。只需点一种浓度的标。只需点一种浓度的标准品溶液，与供试液同板展开，对比，测定组分含准品溶液，与供试液同板展开，对比，测定组分含量，其计算公式为：

58、量，其计算公式为：l C = F1A l 式中，式中，C：组分的重量或浓度；：组分的重量或浓度；A：测得该组分的峰面积；：测得该组分的峰面积；F1：直线的斜率或比例常数。：直线的斜率或比例常数。 49图图4-4 外标一点法外标一点法 图图4-5 外标二点法外标二点法50l 外标二点法：工作曲线不通过原点时，只能用外外标二点法：工作曲线不通过原点时，只能用外标二点法定量，至少需点二种不同浓度的标准溶液标二点法定量，至少需点二种不同浓度的标准溶液(或一种浓度两种点样量或一种浓度两种点样量)才能决定一直线，其计算才能决定一直线，其计算公式为：公式为：l C = F1A + F2 l 式中，式中，C：

59、组分的重量或浓度；：组分的重量或浓度；A为测得该组分的为测得该组分的峰面积；峰面积；Fl：直线的斜率或比例常数；：直线的斜率或比例常数；F 2：纵坐标：纵坐标的截距。的截距。F1和和F2值由仪器自动算出值由仪器自动算出。 51l （2）内标法：内标法是选一个纯物质作为内标物，）内标法：内标法是选一个纯物质作为内标物，并准确称取一定量内标物加至供试液及标准液中，并准确称取一定量内标物加至供试液及标准液中，计算供试品溶液中某组分含量的定量方法。计算供试品溶液中某组分含量的定量方法。l 与外标法相似，当工作曲线通过原点时采用内标一与外标法相似，当工作曲线通过原点时采用内标一点法，工作曲线不通过原点时

60、必须采用内标二点法；点法，工作曲线不通过原点时必须采用内标二点法；并以浓度比及峰面积比代替浓度及峰面积。并以浓度比及峰面积比代替浓度及峰面积。l 内标一点法公式：内标一点法公式： C/Cis = F1A/Ais l 内标二点法公式：内标二点法公式： C/Cis = F1A/Ais + F2 l 式中，式中，C、Cis：分别为组分及内标物的浓度或重量；：分别为组分及内标物的浓度或重量；A、Ais：分别为测得组分及内标物的峰面积；：分别为测得组分及内标物的峰面积；F1：直线的斜率或：直线的斜率或比例常数，比例常数，F2：截距。：截距。F1和和F2由仪器自动计算并内存，可直由仪器自动计算并内存，可直