实验五拟南芥TDNA插入突变纯合体的鉴定

1、拟南芥拟南芥t-dna插入突变体的鉴定插入突变体的鉴定 实验目的实验目的1熟练掌握植物基因组dna快速提取的方法；2掌握利用pcr方法鉴定拟南芥t-dna插入突变体的方法。 t-dna插入鉴定的原理突变体鉴定的步骤1. t-dna插入基因的基因组序列；2. t-dna插入方向的确定；3. t-dna插入位置的确定；4. 引物设计；5. pcr扩增；6. 电泳检测。t-dna插入基因的基因组序列点击基因编号进入网页点击sequence viewer进入http:/www.arabidopsis.o

2、rg点击nucleotide view进入 点击突变体编号后进入的网页进入网站进入网站/cgi-bin/tdnaexpress查找基因突变体及插入方向查找基因突变体及插入方向基因方向t-dna方向5引物3引物实验设计引物设计 基因上面引物的设计可以通过下面提供的拟南芥网站/tdnaprimers.html进行自动生成，也可以根据自己的需要进行设计。一般进行鉴定的引物距离t-dna插入的位置300bp以上为宜，即3

3、00+n bp。 lba1 of pbin-prok2 for salk lines：tggttcacgtagtgggccatcg 植物基因组dna的快速提取 （1）取植物叶片（拟南芥一片叶子），置于1.5ml离心管中，加入400 ml提取缓冲液；（2）用研磨棒研磨植物材料，直至缓冲液变为绿色；（3）在台式离心机上13000 rpm离心5分钟；（4）离心后将上清300 ml转移至一个新的1.5 ml离心管中；（5）在上清中加入300 ml异丙醇，混匀后于室温下13000 rpm条件下，离心5分钟；（6）弃上清后，用70%乙醇润洗沉淀，并在室温下干燥沉淀；（7）100 ml te溶解沉淀，将制备

4、好的样品在4保存备用。（此方法提取的基因组（此方法提取的基因组dna只适用于只适用于pcr的鉴定，不适合酶切和大片段基因的扩增）的鉴定，不适合酶切和大片段基因的扩增）pcr鉴定 30ml反应体系： 2ml 植物基因组dna样品 3ml 10扩增缓冲液 0.5ml taqase （5u/ml） 0.5 ml dntp（10 mmol/l） 1ml 引物1（10 mmol/l） 1ml 引物2（10 mmol/l） 用无菌水补足体积。pcr反应条件94 3min30循环（94/1min，55/1min，72/1min）； 72 延伸10min。注：反应条件需根据所要扩增产物的大小和引物的性质进行合

5、适的调整。pcr安排安排每小组四个pcr反应，引物和dna模板分别如下： 1.wt基因组模板2个pcr反应：引物分别为基因自身的5和3端引物；5引物和lba引物。2.突变体基因组为模板2个pcr反应：引物分别为基因自身的5和3端引物；5引物和lba引物。046号突变体的鉴定（号突变体的鉴定（1-6组）组） 30m ml反应体系反应体系1： 2 ml 植物基因组dna样品（wt） 3 ml 10扩增缓冲液 0.5 ml taqase （5u/ml） 0.5 ml dntp（10mmol/l） 1 ml 046 5引物（10mmol/l） 1 ml 0463引物（10mmol/l） 30m ml反

6、应体系反应体系2： 2 ml 植物基因组dna样品wt 3 ml 10扩增缓冲液 0.5 ml taqase （5u/ml） 0.5 ml dntp（10 mmol/l） 1 ml 046 5引物（10 mmol/l） 1 ml lba 引物（10 mmol/l） 30m ml反应体系反应体系3： 2 ml 植物基因组dna样品（111） 3 ml 10扩增缓冲液 0.5 ml taqase （5u/ml） 0.5 ml dntp（10mmol/l） 1 ml 046 5引物（10mmol/l） 1 ml 0463引物（10mmol/l） 30m ml反应体系反应体系4： 2 ml 植物基因组

7、dna样品（111） 3 ml 10扩增缓冲液 0.5 ml taqase （5u/ml） 0.5 ml dntp（10 mmol/l） 1 ml 046 5引物（10 mmol/l） 1 ml lba 引物（10 mmol/l） 135号突变体的鉴定（号突变体的鉴定（7-11组）组） 30m ml反应体系反应体系1： 2ml 植物基因组dna样品（wt） 3ml 10扩增缓冲液 0.5 ml taqase （5u/ml） 0.5 ml dntp（10 mmol/l） 1ml 135 5引物（10 mmol/l） 1ml 135 3引物（10 mmol/l） 30m ml反应体系反应体系2：

8、2ml 植物基因组dna样品（wt） 3ml 10扩增缓冲液 0.5 ml taqase （5u/ml） 0.5 ml dntp（10 mmol/l） 1ml 135 3引物（10 mmol/l） 1ml lba 引物（10 mmol/l） 30m ml反应体系反应体系3： 2ml 植物基因组dna样品（111） 3ml 10扩增缓冲液 0.5 ml taqase （5u/ml） 0.5 ml dntp（10 mmol/l） 1ml 135 5引物（10 mmol/l） 1ml 135 3引物（10 mmol/l） 30m ml反应体系反应体系4： 2ml 植物基因组dna样品（111） 3ml 10扩增