Shimadzu液相色谱基础

1、液相色谱基础液相色谱基础 2色谱起源色谱起源石油醚石油醚碳酸钙颗粒碳酸钙颗粒色素色素玻璃柱玻璃柱俄国植物学家茨维特（俄国植物学家茨维特（tswett）在）在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法发现的，色谱法(chromatography)因因之得名。之得名。3岛津高效液相色谱仪岛津高效液相色谱仪lc-10avp系列系列4高效液相色谱分析过程高效液相色谱分析过程 高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、分离系高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统统、检测系统、记录系统 等五大部分组成。 分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子分

2、析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。到色

3、谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。5色谱分离过程色谱分离过程temporal course流流动动相相6高效液相色谱原理高效液相色谱原理 色谱法：利用样品组分在两相间分配系数色谱法：利用样品组分在两相间分配系数 不同而进行分离的技术不同而进行分离的技术 流动相：携带样品流过整个系统的液体流动相：携带样品流过整个系统的液体 固定相：静止不动的一相，化学键合型固固定相：静止不动的一相，化学键合型固 定相定相 7高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法法高效液相色谱法法( (high performance liquid chromatographyhigh perfor

4、mance liquid chromatography，hplchplc) )与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法压液相色谱法( (high pressure liquid chromatographyhigh pressure liquid chromatography，hplchplc) )。 hplc hplc 有以下特点：有以下特点： 高压高压- -压力可达压力可达1530mpa1530mpa。 高速高速

5、- -流速为流速为0.00110.000 ml/min0.00110.000 ml/min。 高效。在一根柱中同时分离成份可达高效。在一根柱中同时分离成份可达100 100 种。种。 高灵敏度高灵敏度- -紫外检测器灵敏度可达紫外检测器灵敏度可达0.01ng0.01ng。荧光和电化学检测。荧光和电化学检测器可达器可达0.1pg0.1pg。8高效液相色谱法的分类高效液相色谱法的分类 按分离机制不同分为 液固色谱法 键合相液相色谱法 正相色谱法 反相色谱法 离子交换色谱法 离子对色谱法 体积排阻色谱法9液相维护流程图液相维护流程图吸滤头单向阀柱塞密封圈线路过滤器检测器色谱柱10 流动相流动相流动相

6、选择注意事项：流动相选择注意事项：纯度：采用纯度：采用“ “ hplc ”hplc ”级溶剂级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂变化的溶剂对试样有适宜的溶解度对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小溶剂粘度要小与检测器相匹配与检测器相匹配11溶剂前处理溶剂前处理过滤：过滤：0.45um0.45um或更小孔径滤膜或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。脱气脱气 目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气

7、泡泡 气泡对测定的影响：气泡对测定的影响： 1 1）柱流量不准）柱流量不准 2 2）检测器基线波动）检测器基线波动 脱气注意点：脱气注意点： 1 1）每天脱气）每天脱气( (无在线脱气器时）无在线脱气器时） 2 2）混合溶剂脱气时间不能过长）混合溶剂脱气时间不能过长12工作原理工作原理在线脱气机在线脱气机13何时需要使用在线脱气机何时需要使用在线脱气机14输液泵输液泵 送液方式：送液方式： 恒流控制恒流控制 恒压控制恒压控制 vpvp系列：系列：lc-10advplc-10advp泵和泵和lc-10atvplc-10atvp泵泵 prominenceprominence：lc-20ad lc-

8、20ad 、lc-20atlc-20at、 lc-20ablc-20ab泵泵 d d泵：并联微体积往复式泵泵：并联微体积往复式泵 t t泵：串联式往复泵泵：串联式往复泵 b b泵：并联微体积往复式泵（泵：并联微体积往复式泵（2 2组）组）15等度洗脱和梯度洗脱等度洗脱和梯度洗脱等度洗脱等度洗脱梯度洗脱梯度洗脱16梯度洗脱梯度洗脱 梯度洗脱梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、的强度、极性、phph值或离子强度相应地变化，达到提高

9、值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。分离效果，缩短分析时间的目的。 优点：可提高分离度、缩短分析时间、降低最小检测量和优点：可提高分离度、缩短分析时间、降低最小检测量和提高分离精度提高分离精度 注意事项：注意事项： 溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差17高压梯度泵系统高压梯度泵系统18四元低压梯度泵系统四元低压梯度泵系统19进样器进样器 20手动进样器使用须知手动进样器使用须知全量进样：进样体积至少为定量环的全量进样：进样体积至少为定量环的3 3倍以上。倍以上。半量进样：进样量应不大于定量环体积的半量进样：进样量应不大于定量环

10、体积的50%50%。一定要使用合规格的进样器，规格为外径一定要使用合规格的进样器，规格为外径0.0280.028英寸英寸，长，长2 2英寸的平头针。英寸的平头针。一定不能使用尖针！它会严重一定不能使用尖针！它会严重刮坏转子垫圈。刮坏转子垫圈。21 装填状态装填状态样品注入样品注入六通阀六通阀22柱温箱柱温箱柱温控制的优点：柱温控制的优点：分析结果重现性好分析结果重现性好提高柱效提高柱效降低柱压降低柱压保证检测稳定性保证检测稳定性23cto-10asvpcto-10asvp( (半导体模块加热式）半导体模块加热式）cto-10a(c)vpcto-10a(c)vp( (空气循环式）空气循环式）ct

11、o-10a系列系列24色谱柱色谱柱反相色谱柱：反相色谱柱：c18c18、c8c8、氰基、氨基、苯基、氰基、氨基、苯基正相色谱柱：硅胶、氰基、氨基正相色谱柱：硅胶、氰基、氨基离子交换色谱柱：离子交换色谱柱：scxscx、saxsax凝胶色谱柱：凝胶凝胶色谱柱：凝胶手性色谱柱：牛血清蛋白、手性色谱柱：牛血清蛋白、agpagp、环糊精等、环糊精等25检测器检测器spd-10avp(190600nm) spd-10avp(190600nm) 紫外检测器紫外检测器spd-10avvp(190-900nm) spd-10avvp(190-900nm) 紫外检测器紫外检测器spd-m10avp(190800

12、nm) spd-m10avp(190800nm) 二极管阵列检测器二极管阵列检测器rf-10axl rf-10axl 荧光检测器荧光检测器rid-10a rid-10a 示差折光检测器示差折光检测器cdd-10avp cdd-10avp 电导检测器电导检测器l-ecd-6a l-ecd-6a 电化学检测器电化学检测器elsd elsd 蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器26紫外可见光检测器紫外可见光检测器eineouta= e= ecl = - log (eout / ein) 比尔定律比尔定律c : 浓度浓度l原理：27岛津岛津vp系列紫外检测器功能系列紫外检测器功能设定时间程序（切换检测波长

13、等）设定时间程序（切换检测波长等）双波长检测双波长检测比例色谱，初步判断峰的纯度比例色谱，初步判断峰的纯度停泵扫描，确定组分最大吸收波长停泵扫描，确定组分最大吸收波长28时间程序时间程序29双波长检测双波长检测30比例色谱比例色谱31停机扫描停机扫描32二极管阵列检测器二极管阵列检测器色谱图色谱图光谱图光谱图吸光度吸光度波长波长时间时间33荧光检测器荧光检测器34示差折光检测器示差折光检测器原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。组分浓度。优点：通用型检测器优点：通用型检测器缺点：缺点： 1 1）对温度变化敏感）对温度变化敏感 2

14、2）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测 3 3）属于中等灵敏度的检测器）属于中等灵敏度的检测器35电导检测器电导检测器原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化来测定电离物质含量。变化来测定电离物质含量。优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用于优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用于梯度洗脱梯度洗脱缺点：对温度变化敏感（每升高缺点：对温度变化敏感（每升高1 1度，电导率增加度，电导率增加2%-2.5%)2%-2.5%)广泛应用于离子色谱。主要用于检测水溶性无机和广泛应用于离子色谱。主要用于检测水溶

15、性无机和有机离子有机离子36电化学检测器电化学检测器 原理：测量电活性分子在工作电极表面氧化或还原反原理：测量电活性分子在工作电极表面氧化或还原反应时所产生电流变化的检测应时所产生电流变化的检测 优点：优点： 1 1）灵敏度高）灵敏度高 2 2）选择性好，只检测电活性物质）选择性好，只检测电活性物质 缺点：缺点： 1 1）不适用于梯度洗脱）不适用于梯度洗脱 2 2）对温度、压力变化敏感）对温度、压力变化敏感37蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器原理：柱流出物雾化原理：柱流出物雾化 流动相蒸发流动相蒸发 溶质粒子散射光强度溶质粒子散射光强度 检测检测优点：优点：1 1、适用于没有特征紫外吸收或紫外

16、吸收很弱的待测物、适用于没有特征紫外吸收或紫外吸收很弱的待测物2 2、可以应用有强紫外吸收的试剂，如氯仿、丙酮等、可以应用有强紫外吸收的试剂，如氯仿、丙酮等3 3、适用于梯度洗脱、适用于梯度洗脱4 4、通用型检测器，只要待测物挥发性低于溶剂，即可适用、通用型检测器，只要待测物挥发性低于溶剂，即可适用5 5、对环境影响不灵敏，室温下即可操作、对环境影响不灵敏，室温下即可操作6 6、没有溶剂前缘峰，适用于保留时间短的物质的检测、没有溶剂前缘峰，适用于保留时间短的物质的检测缺点：缺点：1 1、如果流动相不能挥发（如含有钠盐、钾盐等、如果流动相不能挥发（如含有钠盐、钾盐等) )，不适用，不适用2 2、对有紫外特征吸收的物质，检测灵敏度不如紫外