PCR反应的影响因素

1、PCR反应的影响因素变性温度与时间：模板变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。变性温度太高，又会影响酶的活性。一般情况下可设为94 2030秒，高温时间应尽量缩短，以保持耐热DNA聚合酶的活力，zui高变性温度不宜超过95。退火温度与时间：退火温度决定PCR特异性与产量。温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。合适的退火温度一般在4568之间。设置特定反应的zui适退火温度，可根

2、据引物的（G+C）%含量进行推测，一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5，退火时间一般为3060秒，足以使引物与模板之间完全结合，长时间退火没有必要。延伸温度与时间：PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，延伸时间根据所用聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定，如同样扩增2 Kb片段，若使用Taq酶只需1分钟，使用Pfu酶则应设定2分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现，时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。循环次数：可根据模板DNA的量、扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素，设定20-40个循环。循环次数太少，扩增量不足，如果循环次数太多，错配几率会增加

3、，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。酶量：50 L反应体系可用0.5-5 U酶，酶量的选择与模板DNA的量，扩增片段大小等有关，酶量过多易发生非特异性反应，而且可能增加突变的机率，尤其在进行高保真扩增时，应尽量减少酶量，但酶量过少时反应性能下降。模板：模板可以是单链DNA，也可以是双链DNA，质粒DNA的扩增效率略低于线状DNA。模板加量一般不需太多，不超过1 g为宜，因为加量过多可能导致非特异性扩增增加，但是要考虑模板中靶序列的含量。例如，使用基因组为模板扩增单拷贝或低拷贝靶序列，就需要适当加大模板用量。引物：引物与模板配对的长度应至少为17个核苷酸，zui

4、高不宜超过30个核苷酸，zui佳长度为2024个核苷酸，如需插入酶切位点，应在酶切位点5端多加几个碱基，有利于酶切。引物的（G+C）%含量组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。引物内部应避免形成明显的次级结构，如发夹结构。两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3端。如果可能，引物3端zui好富有GC，这样退火后有利于引物3端的延伸。人工合成的引物zui好经过色谱层析纯化或PAGE纯化，以除去未能合成至全长的短链等杂质。引物的终浓度一般为0.1-2 M左右，浓度太高会导致非特异性扩增，太低则扩增产物太少。模板的制备PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA

5、。模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。反应的控制PCR反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20200umol/LTaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）引物 浓度一般为0.

6、1 0.5umol/L反应温度和循环次数变性温度和时间 95，30s退火温度和时间 低于引物Tm值5 左右，一般在4555延伸温度和时间 72，1min/kb(10kb内）Tm值=4(G+C) +2(A+T)循环次数 ：一般为25 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。标准的PCR过程分为三步：DNA变性（90-96）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA退火（60-6

7、5）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。延伸（70-75）：在Taq酶（在72左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3端开始以从53端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如图所示：现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60-65间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.

8、07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板（靶基因）核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。试剂对照：在PCR试剂

9、中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。反应条件选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至4060，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸（此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性）。变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的

10、最主要原因。一般情况下，9394min足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度

11、：Tm值（解链温度）=4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值-(510）在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：7080 150核苷酸/S/酶分子70 60核苷酸/S/酶分子55 24核苷酸/S/酶分子高于90时， DNA合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3