重组DNA技术精简版

1、 基因重组与基因工程基因重组与基因工程 gene recombination and genetic engineering 孙庆涛 刘华明2011.3.16 重组重组dna技术又称为基因工程（技术又称为基因工程（genetic engineering）或分子克隆或分子克隆（molecular cloning）。基因工程的操作过程主要由以下步骤组成：基因工程的操作过程主要由以下步骤组成：载体和目的基因的分离载体和目的基因的分离载体和目的基因的切断载体和目的基因的切断载体和目的基因的重组载体和目的基因的重组重组重组dna的转化和扩增的转化和扩增重组重组dna的筛选和鉴定的筛选和鉴定 一、载体和目

2、的基因的分离一、载体和目的基因的分离 为了进行基因重组，首先需要对载体为了进行基因重组，首先需要对载体dna和目的和目的基因分别进行分离纯化，得到其纯品。基因分别进行分离纯化，得到其纯品。（一）载体：（一）载体：基因工程中常用的载体基因工程中常用的载体(vector)主要包括主要包括质粒质粒(plasmid)噬菌体噬菌体(phage)病毒病毒(virus) 这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。一的限制酶切点等。 1质粒：质粒： 存在于天然

3、细菌体内的一种存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的独立于细菌染色体之外的双链环双链环状状dna，具有，具有独立复制独立复制的能力，的能力，通常带有细菌的通常带有细菌的抗药基因抗药基因。最早使用的质粒最早使用的质粒dna是人工构建是人工构建的的pbr322，该质粒分子大小为，该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含霉素基因，含ecor，bamh，hind等单一的限制酶切点。等单一的限制酶切点。 2噬菌体：噬菌体： 可 通 过 转 染 方 式 将 其可 通 过 转 染 方 式 将 其dna送入细菌体内进行增殖。送入细菌体内进行增殖。常用的为人

4、工构建的常用的为人工构建的噬菌噬菌体载体体载体。噬菌体两端的片段。噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而对于其包装是必需的，因而应予保留；而其中间部分则应予保留；而其中间部分则可进行改造或置换，使之具可进行改造或置换，使之具有某种单一的限制酶切点。有某种单一的限制酶切点。目的基因与噬菌体目的基因与噬菌体dna进行进行重组时，可采用重组时，可采用插入重组方插入重组方式式，也可采用，也可采用置换重组方式置换重组方式。 3病毒：病毒： 常用的为常用的为sv40，通过感染方式将其，通过感染方式将其dna送入哺乳送入哺乳动物细胞中进行增殖。动物细胞中进行增殖。（二）目的基因：（二）目的基因：目的基因的

5、筛选和分离可采用以下方法进行：目的基因的筛选和分离可采用以下方法进行：1直接从染色体直接从染色体dna中分离：中分离：仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。2人工合成：人工合成： 根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。多肽的基因。 3.从从mrna合成合成cdna： 采用一定的方法钓取采用一定的方法钓取特定基因的特定基因的mrna，再通，再通过逆转录酶催化合成其互过逆转录酶催化合成其互补补dna（cdna

6、），），除去除去rna链后，再用链后，再用dna聚合聚合酶合成其互补酶合成其互补dna链，从链，从而得到双链而得到双链dna。这一方。这一方法通常可得到可表达的完法通常可得到可表达的完整基因。整基因。 4从基因文库中筛选：从基因文库中筛选： 将某一种基因将某一种基因dna用适当的限制酶切断后，与载体用适当的限制酶切断后，与载体dna重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组dna的种群，称为的种群，称为g-文库文库(genomic dna library)。 将某种细胞的全部将某种细胞的全部mrna通过逆转合成通过逆转合成cdna，然，然后转化宿主细胞

7、，得到含全部表达基因的种群，称为后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为c-文库文库(cdna library)。c-文库具有组织细胞特异性。文库具有组织细胞特异性。 5利用利用pcr合成：合成： 如已知目的基因两端如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶的序列，则可采用聚合酶链反应（链反应（polymerase chain reaction,pcr）技术，在）技术，在体外合成目的基因。但此体外合成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。基因碱基序列的改变。 pcr概述概述 pcr：使用一对寡核苷酸引物，以目的序列为模板，利用：使用一对寡核苷酸引物，

8、以目的序列为模板，利用dna合成合成 酶和四种脱氧酶和四种脱氧核糖核酸进行核糖核酸进行dna的体外合成反应。的体外合成反应。 pcr技术具有灵敏度高，特异性高、操作方便和重复性好等特点，能够在几个小时技术具有灵敏度高，特异性高、操作方便和重复性好等特点，能够在几个小时内获得多达几百万拷贝的目的基因。内获得多达几百万拷贝的目的基因。 该技术在上个世纪该技术在上个世纪80年代中期由美国年代中期由美国k.mullis发明建立，经过近二十年已发展成包发明建立，经过近二十年已发展成包括多种衍生技术，在很多领域中广泛使用，括多种衍生技术，在很多领域中广泛使用，k.mullis也因此获得也因此获得1993年

9、度的诺贝尔化学年度的诺贝尔化学奖。奖。 pcr基本原理基本原理 dna在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖核酸聚合过程，是在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖核酸聚合过程，是 dna聚合聚合酶、酶、dna连接酶、引发酶、连接酶、引发酶、dna引物、四种脱氧核糖核酸、引物、四种脱氧核糖核酸、dna超螺旋酶、离子环超螺旋酶、离子环境等多成份参与的过程。境等多成份参与的过程。 pcr是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的dna复制，所以在一个复制，所以在一个pcr中必需成分是中必需成分是 1. 模板模板dna 2. dna聚合酶聚合酶 3. 四种脱氧核糖

10、核酸四种脱氧核糖核酸 4. 正向和反向两条引物正向和反向两条引物 5. 适当的缓冲体系。适当的缓冲体系。1.变性：是指模板的热变性，双螺旋模版变性：是指模板的热变性，双螺旋模版dna成为单链的成为单链的dna分子；在应用分子；在应用taq dna聚聚合酶进行合酶进行pcr反应时，变性往往在反应时，变性往往在9495条件下进行。这也是条件下进行。这也是taq dna聚合酶进行聚合酶进行30个左右的个左右的pcr循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。2.退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物退火：是指引

11、物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物的熔解温度低的熔解温度低510，pcr实验要对退火温度进行优化。实验要对退火温度进行优化。pcr基本步骤基本步骤3.延伸：在镁离子存在条件下，延伸：在镁离子存在条件下，dna聚合酶按碱基互补原则，催化四种脱氧核糖核酸加聚合酶按碱基互补原则，催化四种脱氧核糖核酸加在引物的在引物的3端，使引物沿端，使引物沿53方向生成与模版方向生成与模版dna互补的新互补的新dna链。链。双链模版双链模版dnadna变性变性退火退火5 53 35 53 35 55 53 33 35 55 53 33 35 55 53 33 3上游引物上游引物下游引物

12、下游引物延伸延伸3 35 55 53 33 35 55 53 3多次循环多次循环（2 2n n 拷贝）拷贝）1、目的基因的克隆、目的基因的克隆2、基因的体外突变、基因的体外突变3、dna和和rna的微量分析的微量分析4、dna序列测定序列测定5、基因突变分析、基因突变分析pcr的主要用途的主要用途二、载体和目的基因的切断二、载体和目的基因的切断 通常采用通常采用限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载体，简称限制酶，分别对载体dna和目的基因进行切断，以便于重组。和目的基因进行切断，以便于重组。 限制酶目前已经发现限制酶目前已经

13、发现400多种，所识别的顺多种，所识别的顺序往往为序往往为4-8个碱基对，且有个碱基对，且有回文结构回文结构。 由限制酶切断后的末端可形成由限制酶切断后的末端可形成平端、平端、3-突突出粘性末端和出粘性末端和5-突出粘性末端突出粘性末端三种情况。形成三种情况。形成粘性末端粘性末端(cohesive end)者较有利于载体者较有利于载体dna和和目的基因的重组。目的基因的重组。 三、载体和目的基因的重组三、载体和目的基因的重组 即将带有切口的载体与所获得即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新的目的基因连接起来，得到重新组合后的组合后的dna分子。分子。（一）粘性末端连接法：（一）

14、粘性末端连接法： 当载体当载体dna和目的基因均和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入行互补粘合，再加入dna连接连接酶，即可封闭其缺口，得到重酶，即可封闭其缺口，得到重组体。组体。 较少的情况下，对产生的平较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。端也可直接进行连接。 （二）人工接尾法：（二）人工接尾法： 即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采

15、用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。时，可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的载体或目的基因的3-端，如载体上添加一段端，如载体上添加一段polyg，则可在目的基因上添加一段则可在目的基因上添加一段polyc，故二者即可通过碱，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由基互补进行粘合，再由dna连接酶连接。连接酶连接。 （三）人工接头连接法：（三）人工接头

16、连接法： 将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的dna片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。互补的粘性末端。 四、重组四、重组dna导入受体细胞导入受体细胞（一）转化（一）转化（transformation） 转化是指将质粒或其他外源转化是指将质粒或其他外源dna导入处于感受态的导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。转化常用的宿宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。转化常用的宿主细胞是大肠

17、杆菌。大肠杆菌悬浮在主细胞是大肠杆菌。大肠杆菌悬浮在cacl2溶液中，并溶液中，并置于低温（置于低温（05）环境下一段时间，钙离子使细胞膜）环境下一段时间，钙离子使细胞膜的结构发生变化，通透性增加，从而具有摄取外源的结构发生变化，通透性增加，从而具有摄取外源dna的能力，这种细胞称为感受态细胞（的能力，这种细胞称为感受态细胞（competent cell）。）。 (二二)感染（感染（infection） 噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组dna分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感

18、染适当的细胞，并在细胞内繁殖。噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内繁殖。由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导（转导（transduction）。）。 (三三)转染转染（transfection） 转染是指真核细胞主动摄取或被动导入外源转染是指真核细胞主动摄取或被动导入外源dna片段片段而获得新的表型的过程。而获得新的表型的过程。 常用的方法有电穿孔法（常用的方法有电穿孔法（electroporation）、磷酸钙）、磷酸钙沉淀法、脂质体融合法等。进入细胞的沉淀法、脂质体融合法等。进入细胞的dna可以被整合至可以被整合至宿主细胞的

19、基因组中，也可以在染色体外存在和表达。宿主细胞的基因组中，也可以在染色体外存在和表达。 五、重组五、重组dna的筛选和鉴定的筛选和鉴定 由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。可采用以下方法进行：鉴定。可采用以下方法进行：（一）根据重组体的表型进行筛选：（一）根据重组体的表型进行筛选： 对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插插入灭活法入灭活法进行筛选。如进行筛选。如pbr322中带有抗氨苄青中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在