分子生物学研究方法

1、.第五章 分子生物学研究方法本章主要内容：1、重组DNA技术概念及操作步骤2、工具酶与载体3、DNA操作技术（转化、阳性克隆的筛选、cDNA文库的构建、PCR等）4、基因克隆技术5、基因表达技术6、蛋白质表达技术一、 重组DNA技术发展史从1909年丹麦遗传学家W.Johannsen开始将孟德尔的遗传因子命名为基因到现在出现的克隆羊“多莉”，分子生物学的发展出现了划时代的突破和历史性变革，它已成为生命科学的领头学科。以分子生物学为理论基础，以重组DNA技术为主导的生物技术已日益渗透入农林牧副渔、医药、食品、石油、化工等应用领域，正在取得不可估量的经济和社会效益。让我们回顾一下分子生物学发展史上

2、的重大事件，这样会使我们更加理解重组DNA技术的诞生是历史发展的必然结果。（一）重组DNA技术诞生的理论基础随着分子生物学的发展，许多生命的基本现象实质和遗传的奥秘逐渐被揭开神秘的面纱。分子生物学发展史上的三方面成就为重组DNA技术的诞生奠定了坚实的理论基础。1、年代明确了遗传的物质基础是DNA1994年O.Avery及其同事们用光滑型（S）和粗糙型（R）两种肺炎球菌的菌株做实验。他们从S型菌的培养物中提取DNA，将其在试管内与R型菌混合，再接种到培养基里，所长出的部分菌落变成了S型，这样的现象称为“转化”。他们发现，加入各种蛋白水解酶，对转化无影响；但加入少量提纯的脱氧核糖核酸酶（DNase

3、）后，转化很快消失，说明引起细菌遗传性状改变的物质是DNA，而不是蛋白质，从而证实了遗传物质是DNA。2、 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制，解决了基因的自我复制和遗传信息传递问题在DNA的双螺旋结构建立之前，E.Chargaff已从不同生物来源的DNA中分离出四种碱基，即腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）。他们发现腺嘌呤的量总是和胸腺嘧啶一样（A=T），而鸟嘌呤的量也总是和胞嘧啶一样（G=C），并称之为碱基配对。而（A+T）/（G+C）的比值随不同来源的DNA而有所不同。另外M.Wilkins等已对DNA进行X衍射研究，阐明了有关结构、螺旋性质、线形

4、分子直径、相邻碱基之间的距离等情况。1953年J.D.Watson和F.H.Crick将E.Chargaff关于DNA碱基组成规律与M.Wilkins等通过X衍射获得的DNA结构资料结合起来，综合分析，提出了DNA双螺旋结构模型。Watson和Crick提出的DNA双螺旋中两条链的碱基互补的特点，预示了DNA复制是半保留复制，同时还指出遗传信息储存在DNA分子碱基序列之中。在1958年，Meselson和Stahl应用重同位素和超速离心的方法证实了DNA的半保留复制。3、 50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题1958年C

5、rick在DNA双螺旋学说基础上提出了分子生物学的“中心法则”，即通过DNA的自我复制，生物体的遗传信息由父代传给子代，通过转录，遗传信息传给RNA，再通过翻译传给蛋白质，从而决定了生物的表型，这是生物学最基本的规律。从1961年Nirengerg用人工合成mRNA破译出第一个遗传密码到1969年Crick-Nirenberg确定了全部遗传密码，人们了解了大多数生物遗传信息表达的规律。从遗传密码表中我们可以看到mRNA中每3个核苷酸组成一个密码子，体现一个氨基酸的信息。在64个密码子中,其中61个分别代表各种氨基酸，剩余的3个密码子(UAA、UAG、UGA)为肽链的终止信号，不代表任何氨基酸（

6、1986年报道UGA代表selenocysteine(硒代半胱氨酸)，2002年UAG可能是编码第22种氨基酸pyrrolysine的密码子）。AUG不仅代表蛋氨酸（高等动物），位于mRNA启动部位的AUG还是肽链合成的启动信号，这套密码从细菌到人都可通用。“中心法则”发现后，科学家又发现了违反“中心法则”的现象。如1970年Temin和Baltimore在研究只有RNA而无DNA的病毒时，发现了反转录酶，该酶能以RNA为模板合成DNA。Temin阐明了反转录现象的机制，“中心法则”的内容得到了扩充。Watson和Crick使经典遗传学的研究达到了现代的分子水平。DNA的自我半保留复制解释了遗

7、传性状代代相传的稳定性；DNA上一个碱基突变，使三联密码改变，可导致多肽链上氨基酸改变，进而可导致蛋白质生理功能的改变，这样就解开了基因突变之谜，从分子水平上阐明了经典遗传学“变异”的本质，“中心法则”奠定了在分子水平上研究生命现象的理论基础。Watson和Crick的理论是分子生物学发展史上的重要里程碑，它使人们了解基因指导和编码蛋白质的一级结构（结构基因），但不了解还存在具备其他功能的基因，故它只是揭开了生命基本现象的一部分本质，而不是全部。揭开生命基本现象另一部分本质的是Jacob和Monod。1961年Jacob和Monod提出了操纵子学说，用基因表达调控的原理解释了酶诱导的本质，人们

8、才知道还有一类专门起调节和控制蛋白质合成的基因，如调节基因。人们认识到，结构基因只提供编码某种蛋白质一级结构（氨基酸排列顺序）的潜在可能性，而它能否真正编码并生成某种特定蛋白质，则受调节基因的控制。细菌内外环境因素又决定了调节基因如何发挥作用。由此人们形成了基因调控和表达的概念。总之，“中心法则”和操纵子学说两者相辅相成地从分子水平上揭开了DNA的复制、转录、翻译、突变和调控表达的奥秘，使人们对生命现象的认识深化了一步。以上所有理论为重组DNA技术的诞生奠定了理论基础。（二）关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基到60年代，重组DNA技术的理论基础已经具备，但人们还无法自如地得到基因，更无法随

9、心所欲地移动和改造基因，要真正实施它，还有一些实验技术问题有待研究解决。众所周知，生物尤其是真核生物的染色体DNA数量之大，结构之复杂，研究之困难，令人生畏。例如人类遗传信息贮存在约30亿碱基的直线序列中，估计有33.5万个基因，这些基因决定着人体的构成和活动。人们必须具有分离和富集单基因的技术实力，才能在体外对它的结构与功能等有关问题作深入研究。直到70年代中期，几项关键性实验技术问世，才诞生了体外DNA重组技术，才有可能做DNA结构分析等研究。1、 DNA分子的切割与连接技术限制性核酸内切酶和连接酶的陆续发现，才使分子生物学家有了进行DNA操作的基本工具，因而它们的重要性是不言而喻的。19

10、70年Smith发现第一个型限制性核酸内切酶HinfI可对DNA分子进行体外切割。1972年H.Boyer首先发现了限制性核酸内切酶EcoRI，以后又不断发现新的限制性核酸内切酶。截止到1986年，已分离出600多种型限制性核酸内切酶，每种酶都有自己独特的碱基识别序列，这样就使分子生物学家对DNA的剪切变得随意多了。体外对DNA剪切还要连接起来，就要靠连接酶了。1967年世界上5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶，1970年Khorana又发现了T4 DNA连接酶，它具有更高的连接活性，现广泛应用于DNA操作中。1972年美国斯坦福大学P.Berg博士领导的研究小组用限制性核酸内切酶EcoRI

11、在体外对猿猴病毒SV40的DNA和噬菌体的DNA分别进行酶切消化，然后用T4 DNA连接酶将两种消化片段连接起来，结果获得了包括SV40和噬菌体DNA的重组杂种DNA分子，率先完成了世界上第一次成功的DNA体外重组实验，并因此与W.Gilbert、F.Sanger分享了1980年度的诺贝尔化学奖。2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立在体外得到异源重组DNA片段只是第一步，因为大多数的DNA片段无自我复制能力，它必须回到宿主细胞中进行繁殖，这就需要有一种载体（克隆载体）来充当这样的角色。现在噬菌体、质粒和病毒已被改建成克隆载体。1970年M.Mandel和A.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化

12、钙适当处理之后，便能吸收噬菌体的DNA。1972年美国斯坦福大学S.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNA技术的创立具有特别重要的意义，因早期使用的克隆载体都是在大肠杆菌中增殖的复制子。1973年S.Cohen等人在质粒研究中做出了开创性工作，他们将编码卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒DNA和编码四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101 DNA混合后，加入限制性核酸内切酶EcoRI对DNA进行酶切，然后用T4 DNA连接酶将它们连接成重组的DNA分子，最后用其转化大肠杆菌，结果发现，某些转化菌落表现出既抗卡那霉素又抗四环素

13、的双重抗性特性。从这种双抗性转化菌落的大肠杆菌细胞中分离出来的重组质粒DNA带有完整的pSC101分子和一个来自R6-5质粒编码卡那霉素抗性基因的DNA片段。人们进一步要问：不同物种的外源DNA片段是否也能在大肠杆菌细胞中增殖呢？S.Cohen等人的进一步实验回答了这个问题。他们把非洲爪蟾的编码核糖体基因的DNA片段同pSC101质粒重组，并导入大肠杆菌细胞。结果表明：非洲爪蟾的基因进入大肠杆菌细胞，并转录出相应的mRNA产物。S.Cohen等的工作是世界上第一次成功的基因克隆实验，创立了体外重组DNA技术的模式。它说明像pSC101这样的质粒分子可作为基因克隆的载体将外源DNA导入宿主细胞，

14、也说明像非洲爪蟾这样的真核动物的基因可成功地被转移到原核细胞中并实现其功能表达，这预示着人类将遗传性状定向改造，创造出具有优良性状新物种的理想的实现已为期不远了。3、 Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应1975年Southern发明了Southern印迹杂交技术，他先用限制性核酸内切酶对DNA分子进行酶切，然后经琼脂糖凝胶电泳将所得DNA片段按分子量大小分离，再将DNA片段的琼脂糖凝胶变性，并将其中的单链DNA片段转移到硝酸纤维素膜或其他固相支持物上。这种滤膜可用于下一步的杂交反应。杂交双方是待测核酸序列和用于检测的已知核酸片段的探针。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高

15、度灵敏性，它已被广泛应用于基因克隆的筛选、酶切图谱制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病诊断等方面，它的应用大大推进了分子生物学的发展。1977年Sanger在总结了1953年加减法测序基础上，创造了双脱氧链末端终止法，可在放射自显影的图谱上直接读出DNA的顺序，使人类基因组结构快速分析成为可能。1985年K.B.Mullis建立了聚合酶链反应（PCR）并于1987年获得专利。PCR是近年发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。人们为了获得某一特定DNA进行研究，按传统方法，要经过DNA酶切、连接、导入菌体进行扩增、筛选等过程，耗时数周到数月，而PCR技术可在数小时内将仅有几个拷

16、贝的基因放大百万倍，大大简化了传统的体外重组DNA技术，从而使人们可较容易地对目的基因进行分析、鉴定。故PCR技术虽问世时间不长，但迅速渗透到生物学、医学、法医学、考古学等许多领域，得到了广泛应用。Southern杂交、DNA序列分析和PCR等技术的相继涌现，使重组DNA技术发展日新月异，逐步完善。21世纪是“生物学世纪”，生命科学已成为科学的前沿，而分子生物学又是生命科学的带头学科，它的理论和技术导致众多学科向分子水平发展，生物工程高技术产业也随之诞生并得到迅速发展，它正在国民经济发展中发挥越来越重要的作用。（三）重组DNA技术的概念重组DNA技术(recombinant DNA techn

17、ique): 是按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA的大量拷贝。所谓克隆(clone)是指通过无性繁殖过程的产生的与亲代完全相同的子代群体。由于实验是对基因操作(gene manipulation)，故又称为基因克隆(gene cloning)；又由于这类克隆是在分子水平上操作的，又称为分子克隆(molecular cloning)。它之所以有这么多的名称，是由于重组DNA技术从诞生到现在仅仅30年的历史，所使用的名词术语还未来得及统一的缘故。人们混用这些名称，从某种意义上讲，只不过是各自强调的侧重点有所不同而已。（四）重组

18、DNA技术的基本步骤1、重组DNA技术的四大要素外源基因；载体；工具酶；受体细胞。2、重组DNA技术的基本步骤目的基因的获得与载体的制备目的基因与载体DNA的连接重组DNA分子导入受体细胞重组体的筛选与重组DNA的鉴定克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化（五）重组DNA技术的意义重组DNA技术从诞生之日到现在仅仅三十年间已有了飞跃发展，它已涉及农林牧副渔、医药、环境监测与净化、食品、石油、化工等国民经济的诸多应用领域。它已给人类社会带来难以估量的社会效益和经济效益，有着广阔的应用前景。在本门课的绪论部分已经介绍了其应用概况，这里只重点讲一下它的理论意义。重组DNA技术填平了生物种属间不可逾

19、越的鸿沟根据传统的遗传学规律，人们深信“种瓜得瓜，种豆得豆”是天经地义的事情，但跨越天然物种屏障，将原核生物和真核生物、植物和动物、细菌和人、动物和人的基因连接起来，进行基因交流，形成杂种生物，造福人类，这在过去，人们是难以想象，也是难以置信的，现在已成为现实。重组DNA技术缩短了进化时间遗传和变异是一对矛盾，遗传赋予生物种的稳定，变异赋予生物种的进化。在漫漫历史长河中，自然变异的进化时间千万年，常规育种亦要几年，而重组DNA技术将进化时间大大缩短至几年。近年来已兴起阐明作物遗传信息序列和绘制基因图谱的热潮，我国也正在绘制水稻基因图。我们相信，基因操作用于育种，将缩短进化时间，在解决全世界人民

20、温饱问题上将发挥重要作用。重组DNA技术使人能对生物进行定向改造自然变异是不以人的意志为转移的随机过程，而重组DNA技术革命标志着人类控制和改造生物的历史已进入了一个新纪元。以重组DNA技术培育出抗真菌蔬菜为例，几丁质是真菌细菌壁的组分之一，几丁质酶能水解几丁质，美国科学家将几丁质酶基因导入西红柿、马铃薯、和甜菜中，正准备大田试验，这一技术将对蔬菜抗真菌感染具有重要意义。另外应用重组DNA技术可以在体外大量扩增、纯化人们感兴趣的基因，研究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上遗传性疾病、肿瘤、肥胖、心血管疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意义。（六）重组DNA实验

21、中常见的主要工具酶酶类功能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶按5到3方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5-OH末端末端转移酶在双链核酸的3末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶从DNA链的3末端逐个切除单核苷酸噬菌体DNA外切酶从DNA链的5末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5或3末端的磷酸基团限制性核酸内切酶和连接酶是基因工程关键的工具酶，由于这两种酶的发现和分离纯化，使体外基因重组得以

22、实现。限制性核酸内切酶用于有规律地切割DNA，把提供的DNA原材料切割成具有特定末端的DNA片段。现已有从不同生物中发现和分离出上千种限制性核酸内切酶，基本上可满足按不同目的切割各种DNA分子的需要。根据限制性核酸内切酶识别序列的规律性，还有一些能识别某些识别序列的限制性核酸内切酶没有被发现，今后随着研究的深入将会逐步填补这些空白。此外，耐热性限制性核酸内切酶和长识别序列稀有内切酶仍然是当前研究的热门课题。DNA连接酶用于连接各种DNA片段，使不同基因重组。现在常用的DNA连接酶只有两种，即大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶，前者只能连接粘性末端的DNA片段；后者既能连接具有粘性末端的DNA片段，也能连接具有平末端的DNA片段。是否还有更好的DNA连接酶，有待进一步研究。DNA聚合酶用于人工合成引物等DNA小片段以及含基因的较大DNA片段，还用于制备DNA探针。多种耐热性DNA聚合酶的发现，使PCR技术迅速发展，给当今生命科学很多学科提供了先进的研究手段。用于PCR的耐热性DNA聚合酶有Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶