水稻重组白蛋白的研发生产

1、 2009级生物技术产业专题讲座课程论文报告 报告题目： 水稻重组白蛋白的研发生产 姓 名： 专业年级： 提交时间： 水稻重组人白蛋白的研发生产1 概述人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)，是一种多功能用途广泛的蛋白质。由585个氨基酸组成的单链多肽，分子呈心型，理论分子量66438da，pI 4.7-4.9，沉降系数(S20，W)4.6，电泳迁移率5.92，585个氨基酸组成三个同源结构域，标记为Domain，整个分子盘旋成球型。单链分子内通过17.5对二硫键交叉连接，分子稳定性较好。白蛋白纯品为白色粉末，分子内有较多极性氨基酸使其易溶于水，水溶液为黄褐色或暗绿色。

2、HSA是人血浆中最丰富的蛋白成分，占血浆总蛋白的60，每升成人血液中约有40g，白蛋白除存在于血浆中，也存在于组织、身体的分泌液、皮肤和淋巴腔中，构成血管外池，渗透压占全部血浆的80。HSA的mRNA由2078个核苷酸组成，HSA前体(prepro HSA)在肝脏中合成，并且在高尔基体中被加工剪切，形成成熟的HSA分子，分泌进入血液循环系统。1, 2图1 HSA的3D结构Fig1. 3D structure of HSAHSA能维持血液动力学平衡和血管内渗透压，吸收组织中多余液体到血液循环中，使动脉压升高，广泛应用于失血创伤烧伤引起的休克，脑水肿及损伤引起的颅压升高，肝硬化及肾病引起的水肿或腹

3、水，低蛋白血症的防治和新生儿高胆红素血症等。目前临床使用的HSA制品绝大部分部是从人源血浆中提取纯化而得（Plasma-derived HSA，pdHSA），来源有限，价格昂贵，还不能排除病毒（特别是艾滋病病毒和乙肝病毒）或其他潜在致病因子的影响，这都极大限制着HSA的广泛应用。到目前为止，由于血浆供应紧张，HSA仍为紧俏药品。所以说，研究低成本的方法来生产重组HAS（recombinant HAS，rHSA），可以作为pdHSA的安全替代物，并且可以使产量大大提高，满足医疗应用需求。3, 42 国内外研究现状通过这些年的研究，多种不同的基因重组方法被研究出来用于生产rHSA，包括细菌表达系统

4、，酵母表达系统，转基因动物和转基因植物等等。2.1 rHSA在细菌表达系统Lawn，RM等5在1981年首次报道了rHSA的cDNA序列和首次采用色氨酸(Trp)启动子，色氨酸引导肽及来自质粒pBR322的Tcr和Ampr基因构建了第一个表达重组人血清白蛋白的表达载体pHSAI，并在大肠杆菌(Ecoli)中得到了成功表达。但表达的rHSA含有585个氨基酸和人血清白蛋白前原蛋白(preproprotein)的24个氨基酸，并在细胞内形成包涵体聚集。Latta等6把HSA 的cDNA克隆到pXL276上也得到重组的metHSA，但当把噬菌体c蛋白的前六个残基(Val-Arg-Ala-Asn-Ly

5、s-Arg-)与成熟HSA基因融合后克隆到Ecoli中表达，通过胰蛋白酶(Trypsin)有效裂解得到同源成熟的HSA蛋白，与天然HSA蛋白并无二致。rHSA在枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)表达系统中得到分泌表达。一淀粉酶信号肽和中性蛋白酶信号肽序列都是有效的信号肽。但bHSA(bacteriaHuman serum albumin融合蛋白)的表达量与信号肽序列的有效酶解是成负相关的。72.2 rHSA在酵母表达系统由于rHSA分子量较大，在原核生物中表达产量不高(毫克级)和分泌效果不够理想，许多研究者开始用真核生物酵母，如酿酒酵母，毕赤酵母，克鲁维酸酵母，粟酒裂殖酵母，多

6、形汉逊酵母等宿主菌来进行重组白蛋白的表达。8酵母作为真核生物具有能对所表达的蛋白进行翻译后修饰，易于大规模培养等优点，可将目的产物直接分泌到培养基内，培养基的氧化环境有利于二硫键形成和天然构象的蛋白分子表达。毕氏酵母作为宿主菌，还具有培养方法简便，内毒素含量低，表达水平高的特点，易于实现工业化。但rHSA是由微生物分泌产生，其纯化过程中需除去的杂质种类较多。rHSA纯化过程需除去的杂质除某些剩余培养基成分（无机盐）外，其余均源于宿主细胞，如宿主细胞分泌的杂蛋白、多肽、脂质、多聚糖、热原、色素等代谢产物以及细胞破碎释放出的核酸及胞内物等。导致提取产物的过程繁琐，成本较高。2.3 转基因动物表达r

7、HSA研究表明，重组人血清白蛋白在大鼠，小鼠，山羊，奶牛等转基因动物中都能得到表达。在体内试验时，可通过微注射方法把HSA基因片断注射到鼠受精卵中，这些基因通过同源重组的方式表达完整的HSA；也可以通过中间受体基因传送把HAS的 DNA输送到肝细胞中得到表达，且靶DNA基本上是以质粒的形式存在于细胞中，拷贝数大于1000，且在4周内可使表达量稳定。HSA在转基因动物表达系统中表达量与HSA基因含的内含子有密切关系，且这些基因能够很稳定地遗传给它们的下一代。由于HAS在动物宿主表达时并不是把其cDNA转到动物宿主中，而是转化其DNA，当HSA的微基因含有内含子1时表达量为25g/l，而当含有内含

8、子1和内含子2时表达量达到35g/1；HSA内含子是以嵌合方式来作用的，因此，高表达与微基因含的内含子的特异个数比含整个HSA基因内含子更有效。重组白蛋白基因通过细胞外植培养也可进行分泌表达，rHSA表达时与乳蛋白基因一样在外植培养时能够很快地诱导，但在HSA转基因表达调控时受到胞外基质的双重调控。9, 102.4 转基因植物表达rHSA研究证实，rHSA通过转基因技术在马铃薯和烟叶中得到成功的分泌表达。分泌表达时信号序列既可使用HSA的前原序列，也可采用马铃薯胞外蛋白PRS的信号序列来指导分泌。在转基因的叶组织细胞和细胞悬浮培养时采用两种信号肽都可进行分泌表达，但经过对rHSA的 N端分析发

9、现HSA前体的后加工处理为成熟的HSA与信号肽有关，HSA的preproHSA信号肽能引导proHSA的分泌和成熟HSA前体的部分加工；而马铃薯细胞的PRS信号肽与HSA融合后进行表达时能够在原序列处正确酶解加工，后处理的rHSA与天然的HSA完全一样。11-132.5 转基因水稻表达rHSArHSA表达研究至今，但目前仍处于新兴产业阶段。比较成熟的技术主要是利用酵母和细菌表达系统来生产，因酵母表达系统表达量高(克级)且提纯比较方便，所以利用酵母生产白蛋白有其优越之处但也存在诸多不足之处。同时，转基因动物分泌表达重组人血清白蛋白表达量高，翻译后容易加工处理等具有诱人的前景，但转基因动物来源的r

10、HSA仍然存在病毒污染的危险，技术也不成熟，目前主要处于实验阶段。水稻用于重组白蛋白的生产，有着其他方式无可比拟的优势。水稻种子用于生产重组蛋白质，因为其可以实现重组蛋白的高积累，得到的蛋白质的稳定性水平高，可长时间储存，并在生产规模上可控制。此前的研究表明，人溶菌酶和口服乳铁蛋白已水稻种子中成功表达。在这里，水稻种子作为规模化生产的生物反应器，生产水稻重组人血清白蛋白（Oryza sativa recombinant HAS，OsrHSA）。OsrHSA可以非常稳定水稻种子中有效表达并可加工成本低廉，并且OsrHSA被发现和pdHSA生化特性，物理结构，功能，和免疫原性都相同，可安全替代pd

11、HSA。143 研发思路和技术路线该实验的研发思路是通过基因重组技术，实现人体血清白蛋白在水稻种子中的重组生产。技术路线较为复杂，先将人白蛋白基因合成出来，构建根癌农杆菌双元载体，然后将重组质粒导入农杆菌，选取导入成功的农杆菌与水稻的愈伤组织共同培养，然后对水稻进行个体生物学水平鉴定。详细的实验步骤和方法如下。3.1目的基因的获得为了节省时间和资源，目的基因通过蓝鹭生物技术公司(Blue Heron Biotechnology)合成得到，并分别在基因的5和3端加上SchI 和 XhoI酶切位点，并在目的基因的上游添加一段1,241-bp长的 Gt13a启动子和信号肽序列 (GenBank ac

12、cessionno. AP003256) ，该序列从水稻基因组TP 309中获取的，这样可以充分利用水稻基因的密码子偏爱性来有效表达HSA基因。3.2 构建根癌农杆菌双元载体将合成的HSA基因用SchI 和XhoI双酶切，并克隆进pOsPMP01质粒载体，得到了重组质粒成为pOsPMP02。同时，为了构建根癌农杆菌双元载体，用HindIII 和 EcoRI双酶切pOsPMP04载体，将得到的2,832-bp的片段克隆进双元载体pCambia1301，得到的重组载体命名为pOsPMP114，并将其导入到农杆菌EHA105中。图2 pOsPMP载体结构Figure 2 pOsPMP carrier

13、 structure3.3 农杆菌介导的共转化将pOsPMP114 和 pOsPMP02通过农杆菌介导共转化进从水稻品种TP309分离得到的愈伤组织。3.4 转化检测用PCR方法鉴定出成功转化的愈伤组织，Gt13a信号肽的正向引物（5-gagggtgtggaggctcttgt-3）和HSA基因的反向引物（5- gtcacttcacgtctggaca-3）进行PCR，用来确定转化成功的愈伤组织。所用的PCR程序是如下：94变性5 min后，30个循环94 30s，58 30s，和72 45s。所有PCR阳性植株保持在温室中培养直至成熟。3.5 粗提取和定量检测在提取液（50 mM Tris (p

14、H 8.0), 100 mM NaCl）中研磨种子，12000g离心10min取上清，得到粗提取液。其中蛋白质浓度可用BCA蛋白测定法测定。使用人血白蛋白ELISA定量试剂盒对HSA进行量化，测定流程按试剂盒上的说明进行，测定出水稻种子的蛋白产率。3.6 提取纯化重组白蛋白将水稻种子研磨成粉，用磷酸盐缓冲液（PB）（25 mM PB 50 mM NaCl ，pH 7.5）在室温下溶解1小时，然后用乙酸调节pH为5，沉淀2小时，再12000g离心10min取上清。工业生产中，进行大规模纯化时，可采用压力过滤器。上清装在pH值为5时上满Capto MMC柱子，用PB缓冲液（25 mM PB 100

15、 mM NaCl ，pH 7.0）洗脱。这步进行的是阳离子交换层析，白蛋白吸附在层析介质上，细胞碎片及部分杂质不被吸附，直接流出。所收集的馏分，进一步调节pH值为7.5，用Q Sepharose Fast Flow柱子纯化，用pH7.5的PB缓冲液洗脱。这步进行阴离子交换层析，去除抗原类物质、碳水化合物和含色素的白蛋白。然后通过Phenyl HP柱子，使用0.45 M硫酸铵洗脱。这步进行的是疏水亲和层析，用于除去非抗原性的碳水化合物及部分色素。非抗原性的碳水化合物包括：戊糖、己糖、低聚糖、糖醛酸等。最后用Pellicon进行超滤浓缩和超滤脱盐，得到的是纯度很好的rHSA蛋白溶液。3.7 重组白

16、蛋白纯度分析(1)电泳分析：采用Phastsystem电泳系统，参照Phastsystem说明书，用8-25梯度胶进行Native-PAGE电泳分析，考马斯亮蓝染色，l0ug呈单带。10-15%的梯度胶进行SDS非还原和还原电泳分析，考马斯亮蓝染色，上样量为2ug。(2)凝胶分析：HPLC分析使用TSK3000柱对终产品进行分析检测，流动相为：0.3氯化钠的50mmol/L的磷酸盐缓冲液，pH6.5，流速1ml/min，进样量为100ul。3.8 无菌分装经过提取纯化的rHSA经纯度检定合格后，一般纯度达到99.9%以上，即可进行制剂，采用的剂型为水剂，将上述提纯的rHSA进行无菌过滤，小剂量

17、（10ml）包装分装，得到的就是利用水稻进行基因重组生产的人白蛋白。在正常生产过程中，不包括前期的转基因水稻的研发，可在预留足够的种子后大规模种植，得到的水稻进行上述工艺加工，即大规模生产rHSA。4 rHSA与pHSA的比较利用生物技术重组微生物表达的rHSA与从人血浆中提取的pHSA是否完全一致，尤其是否具有相同的生理功能，是决定rHSA研究意义的重要指标。现已通过多种分析方法证明在分子组成和结构上rHSA与pHSA完全相同。Wataru Ohtani等比较了两者的理化特性及免疫化学特性。通过测定pH6.70.1情况下的rHSA的胶体渗透压得到的第二维里系数与pHSA无明显不同。在25%（

18、w/v）的药用浓度下，rHSA与pHSA的粘度相同，均呈牛顿型流体特性。在脂肪酸含量方面，两者所含脂肪酸种类相同，rHSA总脂肪酸含量高于pHSA，而rHSA 中棕榈酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）的含量高于pHSA。采用抗-pHSA 多克隆抗体法证明rHSA与pHSA的免疫化学特性相同。能与多种物质结合是白蛋白的重要生理功能之一，这也是白蛋白活性的体现，Ohmura等分别以Bilirubin，Warfarin，lauric acid代表染料、药物及脂肪酸来考察rHSA结合化合物的能力。实验表明，rHSA与这3种物质的结合与pHSA一致。由此可见，rHSA 与pHSA 基本相同，两者具有

19、相同的生理功能，rHSA可与pHSA同样用于临床。155讨论植物源重组人血清白蛋白临床前研究结果不仅与人血清白蛋白效果等同，而且产量比其他表达体系和同类技术体系分别高101000倍，成本只相当于酵母或细菌发酵成本的2%10%，相当于动物细胞培养的0.01%0.05%，并且在1年内就可以可获得公斤级的重组蛋白产品，无动物源、避免肝炎、艾滋病等病原的风险，水稻原料生产能耗仅为酵母的1/28，二氧化碳和污水排放为零。成功实现重组人血白蛋白规模化和产业化，完全摆脱了相关制约，具有纯度更高、无动物组分、安全、高效、绿色环保、廉价、无限量供应等优势。随着植物源重组人血清白蛋白的发展，我国人血清白蛋白日益紧

20、张的局面必将得到缓解，日后，待其产业规模不断扩大后，甚至可以满足全世界的白蛋白需求。当然，作为科研工作者，我们也可以借鉴转基因植物系统去生产其他的生物单分子产品，像免疫球蛋白等等。参考文献1.Rosenoer, V.M., M. Oratz, and M.A. Rothschild, Albumin structure, function and uses. 1977.2.Geisow, M.J. and G.H. Beaven, Large fragments of human serum albumin. Biochem. J, 1977. 161: p. 619-625.3.Carter

21、, D.C. and X.M. He, Structure of human serum albumin. Science, 1990. 249(4966): p. 302-303.4.Chauhan, A., D. Arora, and N. Khanna, A novel feeding strategy for enhanced protein production by fed-batch fermentation in recombinant Pichia pastoris. Process biochemistry, 1999. 34(2): p. 139-145.5.Lawn,

22、R.M., et al., The sequence of human serum albumin cDNA and its expression in E. coli. Nucleic acids research, 1981. 9(22): p. 6103-6114.6.Brefort, G., et al., Process for the microbiological preparation of human serum albumin. 1990, Google Patents.7.Saunders, C.W., et al., Secretion of human serum a

23、lbumin from Bacillus subtilis. Journal of bacteriology, 1987. 169(7): p. 2917-2925.8.Goodey, A.R., et al., Process of high purity albumin production. 2003, US Patent 20,030,187,226.9.Shani, M., et al., Expression of human serum albumin in the milk of transgenic mice. Transgenic research, 1992. 1(5): p. 195-208.10.Ilan, N., et al., Dual regulation of -lactoglobulin/human serum albumin gene expression by the extracellular matrix in mammary cells from transgenic mice. Experimental cell research, 1996. 224(1): p. 28-38.11.Farran, I., et al., Targeted expression of human serum albumin