探讨厦门类孟买血型表型产生的分子遗传学基础

1、探讨厦门类孟买血型表型产生的分子遗传学基础类孟买血型是一种较为罕见的红细胞血型，血型血清学主要表现为： 红细胞 H 抗原部分缺失，血清中存在抗 H 抗体，常导致 ABO 血型鉴定的错误。该血型表型患者如接受含 H 抗原的血液可引起严重的溶血性输血反应，严重影响安全输血。因此，类孟买血型的鉴定在临床输血中具有重要的临床意义。与 H 抗原形成有关的编码基因 FUT1 位于19q13. 3。FUT1 基因突变导致了 H 抗原合成障碍，产生类孟买血型表型。国内外基础研究对 H 抗原缺失的分子遗传学基础已有较为深入的研究，结果显示： H 抗原缺失频率及 FUT1 基因突变分子基础在不同人群的有所差异1

2、4。因此，我们对本地区3 例血型鉴定确定为类孟买血型的个体进行了FUT1 基因的克隆和测序，探讨本地区类孟买血型表型产生的分子遗传学基础。一、材料和方法1.研究对象收集我院 3 例经血型血清学鉴定为类孟买血型表型的患者标本，其中男性 2 例，女性 1 例； 年龄分别为：18 岁（ 个体 1） 、37 岁（ 个体 2） 、65 岁（ 个体 3） 。以正常 O 表型患者标本为正常对照血清学检测试剂和方法正定型用单克隆抗 A、抗 B 、抗 H 试剂及反定型用试剂 A、B、O 细胞，均购自上海市血液生物医药有限公司产品。用常规方法进行 ABO 及 H 血型鉴定，同时进行凝集抑制试验以检测唾液中血型物质

3、。2. 样本 DNA 提取以全血 DNA 小量提取试剂盒 （ 美国 Omega 公司产品） 抽提 3 例类孟买血型患者及正常表型患者基因组 DNA，严格按照试剂说明书进行操作。3.FUT1 DNA 扩增PC 引物参考文献5由上海生工生物工程公司合成。引物序列： F: 5 -CATTTGCTAATTCGCCTTTC-CTC-3‘，： 5 -CCTTCTCTCCAACTCTCCCAAC-3’，扩增片段长度： 1286 bp。扩增反应体系体积 50 μl，其中： 2 × 缓冲液 25 μl，样本 DNA 2 μl，LA Taq 0. 5 μ

4、l（ 日本 TaKaa 公司产品） ，dNTP mix 1 μl，引物 F、各 1 μl，灭菌双蒸水 19. 5 μl。PC 参数： 94预变性5 min; 然后94变性30 s，60退火30 s，72延伸 2 min，30 个循环，72延伸 5 min 后冷却至 4。 PC 扩增产物在 2% 低熔点琼脂糖凝胶上 100 V 电泳 30 min，凝胶成像仪成像，提示扩增成功后，从凝胶上切取目的 DNA 片段，用 AXYGEN 凝胶纯化试剂盒（ AXYGEN 公司产品） 纯化回收 DNA 片段。4. FUT1 基因测序纯化的 PC 产物在 T4 DNA 连接酶作用下与 T 载体

5、连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取 4 个阳性克隆，提取质粒，以质粒 DNA 为范本测序鉴定 FUT1基因突变。二、结 果1.红细胞 ABO、H 血型鉴定3 个研究个体在 ABO 常规血型鉴定中正定型均为：O 型，反定型也均为 O 型，但是 O 细胞均出现不同程度的凝集，同时自身对照均为阴性。进一步的血清学鉴定发现 3 个研究个体血清中均有抗 H 抗体，而红细胞上 H 抗原缺失（ 表 1） 。2.唾液中 ABH 血型物质测定凝集抑制试验证实 3 个研究个体均为分泌型，其中个体 1，2 唾液中均含有 A、H 物质，而个体 3 唾液中含有 B、H 物质（ 表 1） 。3.PC 产物琼脂糖凝胶电泳分

6、析高保真 DNA 聚合酶扩增目的。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳成像，可见单一的特异性条带，提示成功扩增 FUT1 基因编码区全长。4.FUT1 基因测序分析高保真 PC 扩增产物，经 TA 克隆、测序及序列比对分析发现，个体 1 的 1 条染色体上 FUT1 基因为 h1（ 547-552delAG） ，另 1 条染色体上为 h4（ 35C T） ，即 FUT1 基因型为 h1h4; 个体 2，3 的 2 条染色体上FUT1 基因均为 h1（ 547-552delAG） ，即 FUT1 基因型为 h1h1。讨 论类孟买血型是一种罕见的红细胞血型表型，其主要特征是红细胞表面 H 抗原部分或完全缺失，

7、而分泌液中存在 H 物质。H 抗原是 Hh 血型系统的唯一抗原，是 A、B 血型抗原形成的基础。在正常情况下，FUT1 基因编码的 α1，2 岩藻糖基转移酶催化 L-岩藻糖连接到前体糖链上从而形成 H 抗原。因此，FUT1 基因的异常是形成类孟买血型的重要分子基础。FUT1 基因位于 19q13. 3，全长 5380 bp，其中编码序列长为 1095 bp，编码 365 个氨基酸。目前已经发现的 FUT1 基因异常包括缺失、错义突变和插入突变等，包含了 30 种不同的突变。众多国内外研究已表明： H 抗原缺失频率及 FUT1 基因突变分子基础在不同人群的有所差异。目前，本地区已经报

8、道的 FUT1 基 因 突 变 分 子 基 础 仅 有 h1 （ 547-552delAG） 、h2 （ 880-882delTT） 、h3 （ 658 C T） 、h9（ 424 C T）1 6。为了进一步揭示对本地区类孟买血型个体的 FUT1 基因突变类型，我们对 3 例血型鉴定确定为类孟买血型的个体进行了 FUT1 基因的克隆和测序及比对分析。我们首先通过常规血型鉴定、抗体筛选等血清学及唾液血型物质检测等方法，确定了 3 例类孟买血型个体。随后，我们提取了 3 个个体的基因组DNA。通过高保真 PC 扩增了 FUT1 DNA，经过 TA克隆及测序证实了 3 例类孟买血型个体中，个体 1的

9、 1 条染色体上 FUT1 基因为 h1（ 547-552delAG） ，另 1 条染色体上为 h4（ 35C T） ，即 FUT1 基因型为h1h4; 个体 2，3 的 2 条染色体上 FUT1 基因均为 h1（ 547-552delAG） ，即 FUT1 基因型为 h1h1。本研究的结果进一步证实了池泉等6报道的本地区类孟买血型个体的主要流行基因（ h1 和 h2） 的结论。同时，我们也发现 h4 基因型同样存在于本地区类孟买血型个体中。关于 h4 基因型在类孟买血型形成中的作用，目前研究还存在争议。许先国等7研究结果认为，h4基因型（ 35C T） 是一种基因多态性，而不是引起类孟买型的

10、基因突变，但是不能完全解释郭忠慧等8研究发现的 2 例 h4h4 纯合子的类孟买血型个体。我们研究的个体 3 FUT1 基因为 h1/h4，由于 FUT1基因的遗传方式是常染色体隐性遗传，因此我们认为，h4 基因型的存在导致类孟买个体3 另1 条染色体上 FUT1 无效表达，最终导致了个体 3 类孟买血型表型的形成。总之，类孟买血型的分子基础在不同人群存在着差异，并且尚有存在争议的问题。因此，扩大样本量，进一步挖掘类孟买血型个体的 FUT1 基因突变情况，将有利于我们理解类孟买血型表型形成的机制。参 考 文 献：1 Daniels G. Human blood groups. Oxford:

11、Blackwell Science Ltd，2002: 185 187.2 李勇，马学严。 实用血液免疫学。 北京： 科学出版社。 2006: 146 155.3 Cai XH，Jin S，Liu X，et al. Molecular genetic analysis for the para-Bombay blood group revealing two novel alleles in the FUT1 gene. Blood Transfus，2011; 9（ 4） : 466 468.4 Storry J，Johannesson JS，Poole J，et al. Identification of six newalleles at the FUT1 and FUT2 loci in ethnically diverse individualswith Bombay and Para-Bombay phenotypes. Transfusion，2006; 46（ 12） : 2149 2155.5 黄豪博，范丽萍，魏世金，等。 中国福建地区类孟买血型个体FUT1 基因突变研究。 中国实验血液学杂志，2010; 18 （ 5） : 1338 1340.6 池泉，张爱，任本春，等。 类孟买血型基因分析及 1 种 FUT1 新无效等位基因的发现。 中国输