Alzheimer病的早期诊断和指标规范化研究

1、Alzheimer病的早期诊断和指标规范化研究项目申请书编写提纲一、立项依据和目标1. 本课题研究意义及同类研究工作国内外研究现状、知识产权状况与存在问题人口老龄化成为一个全球性现象，在全世界186个国家和地区中，有1/3以上的国家和地区已进入“老年型”社会，中国的某些城市也已进入了“老年型”社会。据联合国估计，1950年，全世界60岁以上的老年人约有2亿，1970年达到3亿，2000年达到6亿。2020年将达到10亿，2050年，全球将有近20亿的老年人。目前世界绝大多数老年人口生活在亚洲3.38亿，中国60岁及以上老年人口1.34亿，占世界老年人口的21.34%，占亚洲老年人口的39.7%

2、，2050年，亚洲老年人口将增长到12.27亿，中国老年人口将超过4亿，占全国总人口的30%，比目前法、德、意、日、英五国的总人口还要多。随着人口的老年化，老年人的相关问题将日渐突出，如老年人生活问题、医疗保健和社会保障问题，这些问题的有效处理直接关系到国民经济发展和社会稳定。近年来多数调查结果显示，在欧美国家，60岁以上老年人6%12%发生痴呆，85岁以上的老人则有20%40%发生痴呆，其中半数以上为老年性痴呆。在全球约有超过2000万的人患有该病，痴呆发病率随着年龄的增长而成倍上升，年龄每增长5岁，发病率即增长一倍。在65岁以上的年龄段中，老年痴呆的发病率约为5%；超过85岁，发病率增加到

3、25%；95岁以上的人群当中高达60%。我国流行病学资料表明：55岁以上老人痴呆症总患病率为2.9%，65岁以上人口中痴呆症总患病率为5.22%。其中，60-69岁人群中老年痴呆症的发病率为2.3%，70-79岁为3.97%，80岁以上为32%。我国现有65岁以上人口9610万，估算全国共有各类痴呆症患者500万，老年痴呆占2/3之多，2050年，痴呆患者将增加到2000万，与目前全球痴呆人数持平。这是中国未来几十年将面临的严峻问题，医务人员和相关专业人员对这个问题应引起高度的重视，在疾病的早期诊断和干预方面做些深入的研究。阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD)是老年痴呆

4、的最常见原因，它是一种原因不明的、进行性的、中枢神经系统的退行性疾病，其特征性病理改变为大脑皮层及脑区的纤维蛋白沉积,即细胞外间隙的淀粉样蛋白(-amyloid, A)和细胞内多聚Tau蛋白的沉积,两者在病理形态学上分别表现为老年斑(SP)和神经纤维缠结(NFT)。AD患者的最终结局痴呆，当出现明显痴呆时，临床诊断没有多大困难，但此时病情已无法逆转，失去了治疗时机。最近有研究者提出从正常老年发展成AD痴呆是连续的过程，纽约大学医学院Barry Reisberg博士把这个连续过程分为七个期：Stage 1正常增龄期（normal ageing），Stage 2极轻微认知损害期（very mild

5、 cognitive impairment），Stage 3轻微认知损害期（mild cognitive impairment），Stage 4中度认知损害期（moderate cognitive impairment），Stage 5中等严重认知损害期（moderately severe cognitive impairment），Stage 6严重认知损害期（severe cognitive impairment）， Stage 7极严重认知损害期（very severe cognitive impairment）。正常增龄期，其记忆能力与年龄和教育水平相对应，既无主观记忆减退的体验，也无

6、客观的认知损害；极轻微认知损害期，个体有主观记忆减退的症状，如忘记熟悉的字或人名，或常找不到钥匙、眼镜或其它常用物品，朋友、家人或同事还没有注意到记忆问题，医学检查无异常发现，这些现象可能是增龄相关改变，也能是AD最早期的症状；轻微认知损害（MCI）期，有主观记忆困难，朋友、家人或同事能发现其记忆缺陷，医学检查或心理测试发现有记忆缺陷的证据，其它认知功能和社会功能没有明显的缺陷，有这些症状的老年人三年后有半数发展成AD，许多研究者把MCI看着临床前期AD；中度认知损害期，即临床早期AD，除记忆损害外，还有其它认知功能损害，如执行功能、推理能力和计算能力等方面的损害，IQ70，社会适应能力受损；

7、以后各期认知损害更加明显。Zaudig M认为从正常增龄到AD是一个连续谱，可以人为地分为几个期：正常增龄期、无症状AD期、主观记忆减退期、轻度认知损害期（轻、中、重）、AD痴呆期，如下图所示。MCI和AD的关系虽然没有最后定论，但多数研究者认为MCI是正常老化与AD的过度期，Bozoki A等人研究发现每年有4%-25%的MCI发展成痴呆，但多数随访研究发现每年有10%-15%的MCI发展成痴呆，所以多数研究者把MCI看着临床前期AD。在无症状AD期，部分病人未经特殊治疗，可能会自发逆转；在主观记忆减退期和轻度认知损害期，经合理有效治疗，部分病人可能会逆转；进入痴呆期后，即使积极治疗，也无法

8、使病情逆转，但能延缓疾病的进程。由此看来，AD的早期诊断对指导治疗和改变预后具有重要的意义，也是发展新治疗技术的基础。要改变AD患者的结局，必须在轻度认知损害期之前做出诊断，这才是真正意义上的AD早期诊断。AD早期诊断标记包括神经心理学标记和生物学标记，后者包括遗传标记、影像学标记和神经生化标记。在神经心理学标记方面，主要是测量新联想形成和保持的记忆测验、反映执行功能的神经心理测验，因为与学习和记忆有关的神经细胞首先受损，以后逐渐波及到控制思维、判断和行为的神经细胞。在遗传标记方面，目前发现有四个基因与AD发病有关，其中三个基因（分别在1、14和21号染色体上）与早发AD有关，载脂蛋白等位基因

9、（APOE-4）与晚发AD有关。在影象学标记方面，目前比较多研究认为SPECT和PET可以作为AD早期诊断技术，已发现早期AD患者存在颞顶区低灌流，而且血流降低程度与认知功能下降程度存在显著的相关关系；AD早期多巴胺系统的调节也值得关注，已发现海马、颞叶中D2受体变化与图片记忆、人名记忆等功能密切相关；FDG-PET显像显示中颞叶在AD早期存在糖代谢速率下降；近年来正在开发靶向斑块显像剂，以期待能在活体脑中直接标记显示AD的特征性病理改变老年斑(SP)和神经纤维缠结(NFT)。联合应用多种显像剂进行活体脑显像，探讨AD机制，将是AD早期诊断中的重大突破。在神经生化标记方面，主要是测量脑脊液和血

10、液中和Tau蛋白，目前认为在疾病早期随着年龄增加，A沉积增加，脑脊液中A1-42降低，但单纯检测脑脊液中A含量并不能作为AD的诊断指标。AD患者脑脊液中Tau蛋白含量增高，与其他神经系统疾病以及正常人之间有显著性差异。脑脊液中Tau蛋白检测对AD的诊断具有75%的特异性和93%的灵敏度。上述这些诊断技术在不同阶段的AD患者中诊断的特异性和敏感性，国内外都有研究报告，结果差距很大，从30%到90%，有些甚至出现矛盾的结果。从现有的研究文献来看，多数研究是对单一指标的考查，联合多项指标的研究不多；横断面或短期随访研究多，长期的随访研究少；多数研究的对象是临床期AD，对临床前期AD的诊断价值还不清楚

11、。AD早期诊断必须在轻度认知损害（MCI）期之前做出，在DSM-和ICD-10都列入了增龄相关认知损害的诊断类别，并提出了相应的诊断标准：年龄在50岁以上，有AD特征病理改变的物质基础，与年轻时相比记忆力有明显的减退，客观记忆测验成绩低于年轻成人平均成绩，一般认知功能和日常生活能力正常，没有痴呆的证据。多数调查发现，有1/3的老年人符合MCI的诊断标准。多数学者认为MCI是AD的早期，将来可能发展成AD痴呆，有研究报告每年有25%的MCI患者转化为痴呆，大多数研究报告每年有10%-15%的MCI患者发展成AD痴呆，因此及时诊断和治疗MCI对改变AD的结局具有重要的意义。本项目拟以MCI为研究对

12、象，采用纵向研究方法，考查神经心理测验、脑脊液/血浆和Tau蛋白、神经核医学显像技术（班块显像和D2受体显像）、载脂蛋白等位基因（APOE-4）对早期AD的诊断特异性和敏感性，以及对AD痴呆的预测价值。靶向班块显像技术在活体直接显示AD特征病理改变（老年斑）国内外还没有报道，有关多巴胺D2受体与AD的关系国内也未见报道。如能开展此项目，有望研制出一套客观、特异、灵敏的早期AD诊断技术，对AD预防、治疗和新药开发具有重要的指导意义，可望改变AD的结局，为家庭和社会做出积极的贡献。主要参考文献（1）Burns A, Zaudig M. Mild cognitive impairment in ol

13、der people. Lancet, 2002; 360:1963-1965（2）Albert MS. Cognitive and neurobiologic markers of early Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:13547-13551（3）Mitchell A, Brindle N. CSF phosphorylated taudoes it constitute an accurate biological test for Alzheimers disease? International Journa

14、l of Geriatric Psychiatry, 2003, 18:407-411（4）Nitsch RM, Rcacck GW, Deng M,et al. Cerchrospinal fluid levels of amyloid- protein in Alzheimers disease; Inverse correlation with severity of demcntia and effect of apolipo protein E genotype, Neurol,1995,87:512-518（5）Encinas M, De Juan R, Marcos A, et

15、al. Regional cerebral blood flow assessed with 99mTc-ECD SPET as a marker of progression of mild cognitive impairment to Alzheimers disease. Euro J Nucl Mol Imaging, 2003, 30:1473-1480（6）Estevez-Gonzalez A, Kulisevsky J, Boltes A, et al. Rey verbal learning test is a useful tool for differential dia

16、gnosis in the preclinical phase of Alzheimers disease: comparison with mild cognitive impairment and normal aging. Int J Geriatr Psychiatry 2003; 18: 10211028（7）Demattos RB, Bales KR, Cummins DJ, et al. Brain to plasma amyloid- efflux: A measure of brain amyloid burden in a mouse model of Alzheimers

17、 disease. Science, 2002, 295:2264-2267（8）Kung MP, Catherine H, Zhuang ZP, et al. IMPY: An improved thioflavin-T derivative for in vivo labeling of amyloid plaque. Brain Reseach, 2002, 956:202-210（9）Skovronsky DM, Bin Z, Kung MP, et al. In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheim

18、ers disease. Neurobiology, 2000, 97:7609-7614（10）王力，程灶火，李欢欢. Alzheimer病人记忆损害特征的研究。心理科学，2004年第4期（11）Kemppainen N, Laine M, Laakso MP, et al. Hippocampal dopamine D2 receptors correlate with memory functions in Alzheimers disease. Eur J Neurosci. 2003 Jul;18(1):149-54. （12）Mega MS, Chu T, Mazziotta JC

19、,et al. Mapping biochemistry to metabolism: FDG-PET and amyloid burden in Alzheimers disease. Neuroreport. 2本课题的研究内容、研究目标和拟解决的关键问题研究内容（1）神经心理测验对临床前期和临床早期AD的诊断特异性和敏感性和对AD痴呆的预测价值，采用标准化记忆测验和智力测验进行测试，选出对学习、记忆、新联想形成和执行功能等功能的心理学指标，这些是早期AD的主要心理改变。（2）神经核医学显像技术对临床前期和临床早期AD的诊断特异性和敏感性和对AD痴呆的预测价值，采用班块和D2受体等显像剂进

20、行活体SPECT/PET脑显像。（3）脑脊液或血浆1-42和磷酸化Tau蛋白对临床前期和临床早期AD的诊断特异性和敏感性，国内外已有研究报道，但主要针对AD痴呆病人，本研究主要考查对MCI的诊断特异性和敏感性，同时考查对AD痴呆的预测价值。（4）载脂蛋白等位基因（APOE-4）对临床前期和临床早期AD的诊断特异性和敏感性和对AD痴呆的预测价值。（5）综合分析不同诊断技术联合对临床前期和临床早期AD的诊断特异性和敏感性和对AD痴呆的预测价值。研究目标（1）考查正常老年人、MCI（临床前期AD）和临床早期AD在各项观察指标上的差异，确定MCI每年转化成AD的概率。（2）通过对100名MCI患者的追

21、踪对照研究，考查各指标和不同指标组合对早期AD的诊断特异性和敏感性和对AD痴呆的预测价值。（3）建立早期AD的标准化诊断程序。（4）建立预测AD痴呆的数学模型和鉴别正常老人和早期AD的判别模型。拟解决的关键问题（1）获得有代表性的同质样本：国外一些研究结果不一致，样本的同质性问题可能其中原因之一，本研究将严格按MCI的诊断标准和AD的研究诊断标准选择样本，特别强调AD特征病理改变的物质基础。（2）选择能反映AD早期认知功能改变的神经心理测验，过去我们在增龄性记忆改变和老年痴呆记忆特征等研究中，发现多维记忆评估量表中的某些分测验（如汉词配对学习、图-符配对学习、图画回忆等分测验）对正常老年人、A

22、D痴呆和其它类型痴呆有鉴别价值。（3）神经核医学分子显像技术的建立是本研究的关键技术，也是本研究的难点，本研究需要的两种显像剂(多巴胺D2受体显像剂131I-epidepride、斑块显像剂131I-IMPY)合作单位已研制成功，并拥有放射性药品使用许可证(四类)，可在其下属江原医院完成本研究。3本课题的特色和创新之处（与国内外类似研究比较）（1）目前AD的生前诊断主要根据临床症状和间接的实验室证据，确诊需要死后病理证据（老年斑和神经纤维缠结），本研究联合应用多种神经核医学活体显像技术（尤其是131I-IMPY标记SPECT 班块显像技术和131I-epidepride标记SPECT多巴胺D2

23、受体显像技术）作为AD早期诊断指标，国内外均未见报道。这些技术能在活体上直接显示临床早期和临床前期AD的特征性病理改变，具有重要的确诊价值。（2）本项目以AD痴呆的高危人群（MCI）为研究对象，采用纵向追踪研究方法考查神经心理测验、血浆和Tau蛋白、APOE-4检测对AD早期诊断和预测价值，国内尚未见报道，国外纵向追踪研究也不多。（3）本项目MCI的入组标准比国外类似的研究严格，除记忆轻度减退外，特别强调AD特征性病理改变的物质基础脑脊液或血浆和Tau蛋白含量异常，排除其它原因（抑郁、脑血管病变等）引起的轻度认知损害，所以本项目中MCI是真正意义上的早期AD。4研究工作的预期结果、成果提交方式

24、及专利申请状况。本项研究通过对健康老年人和MCI患者的追踪对照研究，考查各指标和不同指标组合对早期AD的诊断特异性和敏感性和对AD痴呆的预测价值；建立早期AD的标准化诊断程序；建立预测AD痴呆的数学模型和鉴别正常老人和早期AD的判别模型。为AD的早期诊断提供敏感的或新的技术指标，对临床实践（老年痴呆的早期诊断、病理性记忆缺陷和增龄性记忆改变的鉴别、AD的早期治疗）都有重要的指导价值。本研究主要以发表科学论文的形式推广研究成果，预计可发表论文4-5篇，其中在国外期刊上发表1-2篇。培养研究生23名。二、研究方法和技术路线1拟采取的研究实验方法、步骤、技术路线及可行性、可靠性论证；研究对象本项研究

25、的对象包括健康老年人、MCI患者和老年痴呆患者三组。（1）健康老年人取样30-50人，入组标准为：年龄在60-70岁之间；目前和过去无明显精神和神经系统疾病；无主观记忆困难、详细医学检查无记忆缺陷的证据；标准化记忆测验的记忆商数和标准化智力测验的IQ在正常范围；脑脊液或血浆和Tau蛋白含量正常；脑部CT无异常发现。（2）MCI组取样60-100人，入组标准为：年龄在60-70岁之间；目前和过去无明显精神和神经系统疾病；有主观和客观记忆减退的证据，日常生活和社会功能基本正常；标准化记忆测验成绩低于健康成人1个标准差，标准化智力测验的IQ在85以上，或MQ低于IQ 15分以上；脑脊液或血浆和Tau

26、蛋白含量异常；脑部CT无异常发现。（3）临床早期AD组取样30-50人，入组标准为：年龄在60-70岁之间；符合器质性精神障碍的诊断标准；记忆和智力全面受损（标准化记忆测验的记忆商数在70以下、标准化智力测验的IQ在50-69之间；脑脊液或血浆和Tau蛋白含量异常；脑部CT证明有脑萎缩；排除其它躯体和脑部疾病及精神疾病所致智能损害或假性痴呆。研究方法（1）神经心理测验：采用项目负责人编制的多维记忆评估量表和龚耀先教授修订的韦氏成人智力量表对入组对象做个别测试，健康老年人和MCI组以后每年检测一次，观察动态变化过程。（2）脑脊液或血浆1-42和磷酸化Tau蛋白含量测定：采用双抗体夹心式酶联免疫吸

27、附法（ELISA）进行定量测定。所有对象入组时都做检测，健康老年人和MCI组以后每年检测一次，观察动态变化过程。（3）载脂蛋白等位基因（APOE-4）检测：采用聚合酶链式反应(PCR)检测APOE基因型，所有对象入组时都做检测。（4）神经核医学显像：注射适量显像剂后用SPECT/PET采集脑断层影像，用脑断层显像和图像重建技术显示脑内情况，用固定框取连续3层获得各局部脑组织的放射性计数率，再求出各局部脑组织的放射性浓度。所有对象入组时都做检测，研究过程MCI患者发展成AD痴呆时检测确诊，MCI组未出现痴呆者在研究的第三年再测一次。可行性分析（1）MCI在老年人群中发生率高（20%-30%），有

28、可靠的被试来源，最近两年我们完成了本地区精神疾病的流行病学调查（包括老年痴呆），掌握了本地区老年人的基本资料。（2）本研究所需的贵重仪器（SPECT）项目申请者或主要研究者所在单位已具备。（3）本项目采用的神经心理测验取自项目负责人编制多维记忆评估量表，已建立了国内常模，具有较高信度和效度，龚耀先教授修订的韦氏成人智力量表在国内已广泛应用，我们曾对老年人、老年痴呆、Parkinson病等进行过一些研究，发现这些测验对老年痴呆具有较好的诊断和鉴别诊断价值。 （4）神经核医学分子显像是本研究的关键技术，合作单位（江苏省原子医学研究所）已研制成功多种国内外先进的脑显像剂(如脑血流灌注显像剂99 mT

29、c-ECD、多巴胺D2受体显像剂131I-epidepride、斑块显像剂131I-IMPY、代谢显像剂18F-FDG等)。其下属江原医院有放射性药品使用许可证(四类)和相应的显像设施、医技人员，可保证本研究的按时高质完成。（5）本研究涉及的相关技术，研究组成员都已掌握，并有多年的相关研究经验。2研究工作的总体安排及进度。研究期限：2006年6月-2009年6月，在2007年1月前完成准备工作和文献查阅，撰写综述1-2篇。2007年1月-6月，完成所有研究对象入组工作和心理、班块和多巴胺D2受体的活体显像（SPECT）检测工作，2007年7月-12月完成三组研究对象的生化指标的检测工作，并对第

30、一批数据进行分析，撰写论文1-2篇。2008年1月-12月，对健康老年人组和MCI组做一次随访，复测血浆和Tau蛋白、APOE-4检测和神经心理测验。2009年1月-6月，对健康老年人组和MCI组做第二次随访，再次检查血浆和Tau蛋白、APOE-4检测和神经心理测验，复测SPECT。总结资料，撰写论文2-3篇。登记序号： 项目编号：中医药、中西医结合科研项目课题设计书课题名称：痛痹颗粒对骨关节炎细胞凋亡和增殖的机理研究申报单位： 江苏省中医院课题负责人： 朱萱萱计划年限：邮政编码： 联系电话： 30306申报日期：江苏省中医药局制填写提纲一、立项依据：与选题直接相关的国内外现状、水平和发展趋势

31、；选题的理论和实践依据；研究目的、意义；本研究达到的科学技术水平，预期社会经济效益和应用推广前景。二、科研假说或技术构思，主要研究内容、关键技术、目标（达到的主要技术指标或技术经济指标），技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。三、研究试验方法及技术路线（工艺路线）。四、现有工作条件和基础：开展本项研究的技术优势，现有的主要仪器设备及应用合格实验动物的基本条件等；已有工作基础，预试验情况。五、计划进度：根据总的研究期限、年度计划进度，分别列出具体的目标和进度的考核指标。六、参加（协作）单位意见及具体分工（附协议书）。七、经费概算（包括其他部门的拨款、贷款、自筹记忆取得的自主）和核算依据，以

32、及分年度使用计划。填写说明一、内容填写自备附页，用纸大小和封页一致，字迹清楚，装订整齐后按申报要求上报。二、填写提纲所列内容，要全面详细、如实填写。三、封面上“登记序号”“项目编号”请勿填写。1、 立项依据1.1 研究目的、意义骨关节炎（osteoarthritis，OA）又称退行性关节病，以关节软骨发生弥漫性龟裂、纤维化和脱失及因骨组织增生性变化为特征的一组临床征候群，是多见于中年以后的慢性进行性关节疾患。该病发病率随年龄增长而升高，据调查，在美国目前2亿多人口中，就有骨关节炎4500万，发病率占总人口的20%，在老年人中所占比例更高，50岁以上人群中，OA的患病率仅次于心血管疾病，位居第二

33、位。在我国，根据流行病学调查显示，5564岁的人群中发病率达40%，而65岁以上人群的患病率达60%90%。随着计划生育政策的长久实施及经济发展，我国已进入老龄化社会，OA的发病率还将越来越高，这不仅严重危害人民的生活、健康，对社会也将造成很大负担。同时世界其他国家也面临着同样的问题，因而OA引起了国际、国内医学界的相当重视。近年来对OA的研究颇多，在发病机制、检测手段以及治疗方法上均取得较大进步，但总的来说还缺乏令人满意的突破性进展。西药治疗OA的主要手段是非甾体药，但存在副作用大、作用单一及有较多禁忌症等缺点。虽然中药治疗OA也取得了一些经验，但对其具体的作用机制有深入研究的却很少，因此在

34、中医理论的指导下，运用现代科学技术，对疗效确切的中药复方进行深入的机理研究，使中药治疗OA的疗效在国际先进行列中占一席之地，是摆在我们面前非常重要的课题。1.2 国内外现状水平和发展趋势近十年来，国内外对OA进行了较深入地研究，大致归纳如下：1.2.1 流行病学研究已广泛开展在近100种不同类型的关节疾病中，OA是影响人类健康最常见的关节疾患之一，没有明显的种族和地域差异，本病的患病率随年龄增加而增高，故随着人类平均寿命的延长，患病率也有增高的趋势。Felson等报道70岁以下人群膝OA患病率为7%（男6.4%，女11.4%），80岁以上为11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射学膝OA

35、70岁以上为27.4%（男30.4%，女25.1%），80岁以上为43.7%。Butter等报道，44岁以下、4559岁、60岁以上人群中，放射血OA 患病率各为6.2%、21.6%和42.0%。国内陈顺乐等队13541名钢铁工人的调查结果显示，症状性OA患病率2.2%；无症状性OA患病率53%，其中3039、4049、5059岁患病率各为11%、27%和62%。汕头大学医学院统计551例，结果40岁以下、4049、5059和60岁以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同关节OA易感性不同。美国在卫生统计中心调查结果，OA患病率以手最高，以下依次为足、膝、髋。国内陈顺乐

36、等调查结果OA是颈椎最多，以下依次为腰椎、膝、手和腕。本病性别差异在脊柱差别不大，但手、膝、髋OA均以女性较多，且女性骨关节炎的遗传易感性较男性高。在Framingham的研究中，Felaon等发现女性体重减少11磅，骨关节炎形成的风险相应减少50%。 Saase等调查结果，膝OA患病率男、女峰值分别为24.7%和54.6%。根据1994年统计，在美国，骨关节炎的消耗为155亿美元，约为类风湿关节炎的3倍，其中一半以上消耗缘于工作丧失。在我国虽未作全国大范围的普查，但随着老龄化社会进程的不断加快，OA的发病率会越来越高，这必将给家庭、社会带来沉重负担。1.2.2 病因、发病机制有了巨大突破目前

37、基础研究认为软骨的损伤与退变是OA的根本，随着分子生物学免疫学的发展，近年来众多学者对OA关节软骨退行性改变的原因从不同角度进行了大量研究，其发病机制仍未完全明了，又提出了许多学说，如软骨下骨内高压学说：由于骨血液动力学的改变，在骨髓腔容积不变的前提下增加内容物引起压力增高，即表现为骨内压力增高。骨内高压持续增高存在下关节滑液pH值下降，成分改变，干扰并破坏了软骨细胞的正常代谢导致细胞变性坏死，胶原纤维解聚，蛋白多糖分解，软骨下骨破坏、修复，最终产生骨性关节炎。自由基学说：认为自由基对软骨细胞DNA和PG的合成具有抑制作用。自由基作用软骨细胞后，引发膜脂质过氧化，使脂质过氧化代谢产物丙二醛增多

38、，丙二醛可与DNA发生交联，自由基也可直接攻击软骨细胞DNA即合成DNA所需的酶，使DNA链断裂、碱基损伤从而影响了DNA的合成，也造成前列腺（PG）合成障碍。骨关节炎时，滑膜、滑液、血管翳内常有中性白细胞、巨嗜细胞浸润，其表面受免疫复合物、补体等作用能释放大量O2-和H2O2；细胞因子学说：细胞因子对骨关节炎的发生、发展起了重要作用，如白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子（TNF）等在OA中水平明显增高。IL-1具有刺激软骨细胞分泌一氧化氮、前列腺E和IL-6的作用，引起滑膜炎症和疼痛，同时IL-1也是软骨基质降解的主要驱动因子；软骨酶降解学说：OA软骨细胞的

39、基质降解酶类的合成与分泌率明显增加，并与关节炎的严重程度密切相关。参与降解基质大分子的降解酶类可以增加达到几倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白。基质金属蛋白酶，尤其是基质溶素和胶原酶，参与关节软骨的降解过程，这些酶类可以降解细胞外基质的所有成分，与循环系统中的纤维蛋白溶酶和局部合成的纤溶酶原一起，快速降解软骨。在滑膜细胞和软骨细胞产生的IL-1和TNF的作用下，软骨细胞以酶原的形式分泌大量的基质金属蛋白酶，而对金属蛋白酶组织抑制剂无影响，使二者失衡从而增加对软骨主要成分型胶原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使软骨进行性破坏；一氧化氮学说：NO是一种细胞间信使分子，可介导许多生物学现象。N

40、OS可催化重要炎性介质NO的产生，OA患者血清、滑液中NO含量明显高于正常。NO可通过抑制软骨细胞增殖，促进软骨细胞凋亡，改变蛋白多糖和胶原蛋白的合成与分泌功能，同时使软骨细胞分泌透明质酸减少，滑膜粘蛋白解聚，抑制软骨细胞合成软骨基质，促进软骨细胞糖酵解，使软骨破坏。细胞凋亡学说：细胞凋亡是细胞死亡的形式之一，许多正常组织均可发现凋亡，但凋亡亢进与不足则会引起相关疾病，在骨关节炎患者软骨中软骨细胞的凋亡有异常表现，且凋亡细胞数目与骨关节炎严重程度明显相关。凋亡小体存在于软骨细胞小孔或间隙内，其产生的焦磷酸盐能从溶液中沉积钙，有NTPPH（nucleosid triphosphate pyrop

41、hos phohydrolase）和碱性磷酸酶作用,造成余下软骨细胞修复过程失败，而逐渐发展成关节软骨的完全丢失。OA软骨细胞凋亡主要通过两种相互独立的途径完成，一种是同滑膜炎症无关的途径,由NO介导;另一种是同滑膜炎症相关的途径,由Fas介导。典型的OA不存在明显的炎症反应,此时软骨细胞凋亡以NO途径为主;当产生炎症反应时,则通过as途径加剧软骨细胞凋亡和关节破坏。NO通过两种方式造成组织及细胞损伤。一是高浓度的NO能抑制多种与线粒体呼吸传递系统及柠檬酸循环有关的酶,从而抑制线粒体呼吸,造成组织损伤;二是NO与超氧化阴离子2-反应,生成氧化亚硝基阴离子ONOO-,在酸性条件下(如病理条件)迅

42、速分解为OH-和NO2自由基,这两种自由基具有很强的细胞毒性,可造成组织细胞损伤。在OA患者中,受损区软骨细胞的凋亡比例明显高于未受损区。Fas表达的结果与其相符,OA受损区的Fas表达远高于未受损区,提示Fas表达可诱导软骨细胞凋亡。除NO途径和Fas途径外,还有一些因素可导致软骨细胞凋亡、关节破坏,如IL-1、IL-8、TNF-、PGE2、Aggrecan G1区等。1.2.3 治疗方面有了不少新方法目前中西医治疗OA的药物较多，西药治疗OA主要有三大类，第一类为快作用药，即非甾体药，特点是发挥作用快，但副作用较大，对胃肠、肝肾、血小板均有较大影响，OA多为老年人，长期服用此类药尤其不能耐

43、受，且部分药物价格不菲，而且由于过分的镇痛，导致病人失去警惕过分运动，以致出现“消炎痛髋”，从长期疗效来看反而不佳，最新观点认为乙酰氨基酚应作为治疗OA的首选药，但尚有一定争议，且同样存在上述副作用；第二类为慢作用药，发挥作用慢，疗效不确切，价格昂贵，临床上尚未广泛运用；第三类为软骨保护剂，尚未问世。关节清理术、膝关节置换术，适应症较少，费用高，创伤大，病人难以接受。中哦药治疗OA的研究取得了可喜的进步，但中药治疗仍存在较多共性的问题：多属临床经验，无对照组，特别是西药对照组观察，处方不固定。缺乏用客观的最新的国际公认的、量化的临床观察指标及疗效判断标准为手段来寻找治疗OA的中药。未针对OA发

44、病机制进行临床及动物试验从生化、免疫、病理、细胞分子水平来探讨中药的药物作用机理。缺乏高效的、作用综合、副作用小的新药。中医认为OA属痹症中的痹、痛痹、骨痹，认为其病因与年老体衰、长期劳损、外感风寒湿邪有关，明确指出肝肾亏虚、气血不足、筋骨失养为OA的发病基础，而寒湿、痰瘀为病理因素及病理产物。周尊谦等人在传统中医理论基础上，阐述了膝OA骨内高压血瘀证氧自由基之间的密切关系；谢林等论述了膝OA与血瘀证之间的内在联系，旨在为运用活血化淤药治疗OA提供理论依据。治疗方面从古到今绝大部分医家皆针对其病因病机采用益肝肾、强筋骨、补气血治其本；散寒通络、化痰胜湿治其标。独活寄生汤是用于治疗风寒湿痹、关节

45、疼痛和脑血管后遗症的传统固防，具有补肝肾、活血通络之功，临床常见本方加减治疗OA，疗效比较肯定。朱健儿以本方加味治疗262例，总有效率94.7%。单文龙等用本方加减治疗骨关节炎24例，有效率为87.5%。陆智报道用本方加减治疗104例，总有效率91.3%。1.2.4 实验研究方面有了较大的进展随着对OA发病机理的不断深入认识，对OA的实验研究方面也开始了向多层次多角度的方向发展。动物实验不再只局限于微循环和一般抗炎、镇痛试验，现已使用针对OA的动物实验，并采用相关的指标进行检测。目前实验研究内容主要有以下几个方面，研究最多的是OA的血液流变学、氧自由基及一氧化氮含量等，这些试验一般均可通过建立

46、骨关节炎的模型来完成，也可通过使用其它相似的模型检测相关指标来进行，如可建立急性血淤模型来检查血液流变学指标，使用老龄动物通过检测体内SOD及MDA含量推断药物的抗氧自由基的能力等。在NO对OA影响的实验中，一般采用硝酸还原酶法来测定NO含量，运用PT-PCR技术测定NOS基因表达。IL-1、IL-6、TNF等细胞因子、软骨降解酶尤其是基质金属蛋白酶、诱导关节滑膜炎症的物质如纤溶酶原/纤溶酶原激活物和前列腺素PGE2、软骨细胞的细胞凋亡及增殖情况、性激素水平等也越来越多地被作为检测指标使用到实验研究中来。1.3 选题的理论和实践依据祖国医学并无骨关节炎的病名，从历代文献来看本病应归属于“骨痹”

47、、“痛痹”范畴。我们认为OA病人除了肝肾亏虚，寒湿痹阻外，一般OA病人体重超重较多，也即为痰湿偏盛之体，另外脾虚生湿及寒湿痹阻日久湿聚成痰，痰淤交阻是引起膝关节肿胀畸形、活动受限的重要因素，所谓顽症怪病皆质之于痰淤。基于现代医学对OA发病机理的深入研究，我们在补益肝肾、活血通络基础上，结合中药对缓解软骨降解，增加软骨细胞功能，抑制滑膜增生及炎症的研究成果，于1995年即对备急千金要方中的独活寄生汤进行化裁，重用活血化淤，加用化痰清热之品，总结制定出了高效、药源广泛、安全可行的痛痹颗粒，并于1999年采用痛痹颗粒的组方治疗膝OA，方中以独活为君药，以祛下焦与筋骨间风寒湿邪；威灵仙舒筋通络止痹痛；

48、淫羊藿、怀牛膝补肝肾，强筋骨，通经络，其中怀牛膝为引经药；当归养血柔肝、舒筋活血；川芎则通达四肢关节，为血中气药；虎杖活血清热解毒，同时防诸药辛燥太过。诸药合用共起补肝肾、祛风湿、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保护软骨。通过36例的临床研究、观察，结果表明本方疗效显著且副作用小。因此有必要对痛痹颗粒治疗骨性关节炎的作用机制尤其是该方对软骨细胞的细胞凋亡与增殖机理做进一步的研究，冀能证实痛痹颗粒的临床疗效，明确其作用机制，并初步探讨本病发病的可能机理，为新药问世提供客观的依据，所以进行设计并立题。1.4本研究达到的科学技术水平，预期社会效益和应用推广前景1.4.1继承和发扬祖国医学，保持中医特色，以

49、临床疗效为前提，以实验研究为基础，制造规范化大鼠的膝OA模型，从发病机理探讨本药的作用机制。本实验采用可靠地国际公认的方法复制动物模型，并采用最新的检测指标IL-1、TNF、SOD、MDA、NO等，总之本研究基于现代医学对OA发病机制的最新研究成果，从生化、免疫等多个角度多个层次，系统观察并进行归纳总结，确保本课题不但可行而且先进，冀能填补省内外运用中药治疗OA的空白，并希望以此为基础，进一步从细胞水平（包括本药对软骨细胞及细胞凋亡与增殖的影响）研究中药对OA的长久作用及影响，从而达到挤身国际先进水平的目的，让中药真正走向世界。1.4.2目前，中药治疗OA的方法颇多，但大多以临床疗效研究为主，

50、大样本、规范化的研究很少，中医中药治疗机理的研究，虽有涉及，但大多分散且存在一定的重复性，理想的治疗药物尚未问世，具有公认疗效的小儿迁延性腹泻临床治疗方案尚未确立，其疗效评价体系尚需研究确定，尤其是缺少中医药治疗学整体研究思路与方法，使中药复方治疗OA的疗效机理尚未能全面揭示，影响了该领域研究的深入。而痛痹颗粒是在中医理论指导下选用千金要方中独活寄生汤进行加减所得，并采用可靠的实验模型及最新的国际公认的相关指标进行实验研究，观察其对OA的确切疗效及作用机理，这必将对OA的中医理论产生较大影响，同时对临床治疗也起到更好的指导作用，从而产生较好的社会经济效益。随着改革开放的形势发展，以及中国加入W

51、TO与国际接轨的进程的不断完善，祖国医学国际地位不断的提高，我们将从祖国医学宝库中发掘出的治疗OA的高效药物与现代新技术、新方法进行研究总结，从而为人类造福，为振兴中医事业做出应有的贡献。2.科研假说或技术构想：主要内容、技术关键目的，技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。2.1主要内容2.1.1探讨OA的病因病机，提出新见解，发展中医理论。2.1.2运用现代科学技术，开展实验研究，从分子生物学、免疫学、生理生化学等多方面来探讨“痛痹颗粒”治疗膝OA的疗效机制及药理毒理作用。2.2主要技术关键2.2.1膝OA模型的复制目前所使用的OA动物模型一般可分为两大类，其一是诱发模型，即通过各种操

52、作方法如制动、手术、关节内注药、关节内植入软骨碎片或微粒等诱导OA产生；另一类为自发模型，即不用任何外界干预，动物自发OA，如C57黑鼠等。在选择动物模型时一般应考虑动物的种属（包括其生活习性、关节结构、组织学及病理学特征）、不同方法的造模机制和OA模型的特点，并应参照研究目的加以选择。在诱发模型中，常用的方法是手术造成关节的应力改变及关节腔内注入木瓜蛋白酶， 这两种方法都能复制出较成功较高的OA模型，且操作较为简单。具体的造模机制在于低应力可以造成软骨厚度减少，SO染色变淡，水分增加，蛋白聚糖聚集度损伤等变化，木瓜蛋白酶作为一种蛋白水解酶会引起关节软骨的退行性改变。在具体的造模过程中我们选用

53、以上两种方法来分别复制动物模型。用于动物模型的动物一般有狗、兔、鼠等，我们选用大鼠做OA模型，因为该模型关节软骨退变的组织学特征与人类相似，且动物来源较广泛，且经济。2.2.2关节软骨细胞的获取和培养基于来源广泛，操作可行的原则，目前用于体外培养的软骨细胞一般均为兔关节软骨细胞原代培养所得。软骨需在严格无菌的条件下分离，经过一系列的漂洗、消化等工作后获取软骨细胞。目前还没有专门用于软骨细胞培养的培养液，国外采用的培养液种类繁多，有199、1640、F12、改良Eagle等，国内的有199、1640、DMEM（高糖）等，其中加入胎牛血清（占15%），一般以使用DMEM培养液居多。在培养液中还含有一些辅助添加剂，包括25mmol/L Hepes、1mmol/L 丙酮酸钠、2mmol/L 谷氨酰胺、50umol/L 二硫基乙醇以及10万单位/L的青霉素和10万单位/L的链霉素，P