基因芯片技术及其在结核分枝杆菌检测中的应用

1、基因芯片技术及其在结核分枝杆菌检测中的应用摘要：基因芯片技术，是指将已知核酸序列的DNA或RNA片段作为探针，在芯 片上做成点阵，再与待测标本中的DNA或RN;片段，按照碱基互补配对原则进行杂 交，经特定软件的分析处理， 获取大量相关基因信息的技术。 本文对该技术及其 在结核分枝杆菌检测中的应用进行综述。关键词：基因芯片技术；结核分枝杆菌结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病， 主要侵犯肺脏。 在某些经 济欠发达地区，许多结核病患者因为得不到全程，合理的救治而产生结核耐药， 这使得控制结核病的发生发展成为世界性难题。 目前，临床实验室采用的检测结 核分枝杆菌的方法主要有抗酸染色法和细菌培养

2、法等 .2001 年康润田 1 等应用抗 酸染色、细菌培养、荧光染色、PCRPCR反向探针膜杂交法，检测59例标本(其 中，结合组 43例，对照组 16例)中的结核分支杆菌，比较分析后，阳性率( %) 结果如下图：依上图，可以得出的结论为：抗酸染色法简便、实用、快捷 , 但非结核性分 枝杆菌亦可出现阳性结果； 细菌培养作为结核病诊断的金标准， 虽优于抗酸染色 法，但时间比较长，影响早期用药；荧光染色和PC是可供选择的检测方法，却可 能出现假阳性和假阴性；而依赖于基因芯片的PC杂交梳法敏感性和特异性均高， 是比较准确的检测方法 1 。1. 基因芯片基因芯片 (gene chip) 技术是随着“人

3、类基因组计划” (human genome project,HGP) 的进展而发展起来的 , 它是 21 世纪以来影响最深远的重大科技进 展之一 , 是分子生物学、微电子学及物理学综合交叉形成的高新技术。1.1 基因芯片的概念基因是指具有遗传效应的 DNA片段，位于细胞的染色体上。我们将大量的基因片段按一定的顺序固定在特定的载体上，即为基因芯片，它是专 门应用于核酸检测的一种生物芯片。在一块约1cm2 大小的芯片上，可固定数千甚至上万的基因片段，由此形成一个密集的基因方阵，方便对多个基 因进行同步检测 2 。1.2 基因芯片的优点基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量的检测技术 , 正逐步成为

4、疾病诊 断的尖端技术之一 3 ，其优点主要表现在 :一，灵敏性和准确性；二，快捷简便 性；三，同步性。在医学领域，医生针对多种相似病原菌进行鉴别诊断时 , 若能 应用基因芯片技术 , 则在短时间内就能知道病人是哪种微生物感染，这对指导临 床合理、及时、准确的用药提供了很大的方便。1.3 基因芯片的分类： 4基因芯片有多种分类方法：1.3.1 按基因芯片所用载体材料分为： 玻璃芯片，硅芯片，陶瓷芯片；其中， 玻璃芯片因易得，荧光背景低，应用方便等优点，被广泛应用；1.3.2 按芯片点样方式的分为：原位合成芯片，微距阵芯片，电定位芯片；1.3.3 按基因芯片用途分为：表达谱芯片，诊断芯片，指纹图谱

5、芯片，测序 芯片和毒理芯片等；134按照载体所点DNA种类分为：寡核苷酸芯片和cDNA芯片，前者主要 用于基因组学及表达谱研究，后者主要用于表达谱研究 5 。1.4 基因芯片的用途基因芯片技术的准确灵敏性，同步性，所需样本少，污染少的特点 , 使其不 仅在疾病检测方面有广泛应用， 在法医学鉴定， 药物筛选方面及环境科学方面同 样有重要的使用价值：疾病检测诊断方面， 基因芯片只需少量标本， 在短时间内， 即可对所需鉴别 的疾病进行同步化检测，不仅能帮助医生尽早做出诊断，还能减轻病人的痛苦， 一举两得。法医学方面，基因芯片优于早先的 DNA旨纹鉴定，将这些具有遗传效应的 基因片段分析处理后， 可以

6、更准确的推断生命体的特征， 常被应用于尸体鉴定及 亲子鉴定。药物筛选方面 7，基因芯片通过分析用药前后机体基因表达谱的改变，来判 断药物的疗效，省时、省力又准确。环境科学方面， 目前， 基因芯片已经应用于土壤中微生物的检测， 水中病原 菌及毒物鉴定 8 ，如果应用恰当的话，可以解决人类日常生活中不少问题，使人 们的生活水平得到提高。1.5 基因芯片的原理基因芯片是将已知核酸序列的 DNA固定在某种载体上，然后与待测样品中 的DNA或 RNA按照碱基互补配对原则进行杂交，再经过特定计算机软件的处理， 获得待测样品的信息。如果待测样本为RNA 般先经逆转录过程，形成RNA-DNA 杂交体，经RNA

7、酶的水解，变为单链DNA再与已知的探针进行杂交9。1.6 基因芯片技术的主要技术环节基因芯片主要包括 4个基本技术环节 10,11 ： 1.芯片制备；2.样品制备；3.分 子之间杂交反应； 4. 反应结果的检测及分析。1.6.1 芯片制备： 目前，芯片的制备主要采用的载体有玻璃片或硅胶片 , 再将 DNA RNA片段或蛋白质分子按一定顺序排列在载体上，形成芯片；1.6.2 样品制备：样品的制备和处理是该技术的第 2 个重要环节。我们所接 触的样品都是复杂的生物分子混合体 , 一般不能直接与基因芯片进行反应。 因此， 需要将这些混合体进行特定的生物处理,以获取所需的DNARNA片段或蛋白质分 子

8、等，并加以标记 , 标记的方法有荧光标记法，生物素标记法、核素标记法，其 中，最常用的是荧光标记法，标记后的样本可以提高检测的灵敏度；1.6.3 分子之间杂交反应：此反应是芯片检测的关键一步。芯片的杂交原理 与普通的核酸分子之间的杂交相同， 其优势在于基因芯片所需样本量少， 杂交时 间短。为了使反应更加精确， 通常需要人为地调节反应所需的最适环境， 以减少 错配率 , 从而获取最能反映生物本质的信号 ；1.6.4 反应结果的检测及分析： 目前，芯片信号检测方法是应用芯片扫描仪 , 通过采集各反应点的荧光强弱和荧光位置 , 经过软件分析 , 即可以获得相关的基 因信息。1.7 基因芯片的国内外研

9、究现状 12 鉴于基因芯片的诸多优点，世界上的许多国家和地区都已着手进行基因芯 片的研制和开发 , 美国政府于 1998 年正式启动基因芯片计划 , 国立卫生研究院 (NIH) 、能源部、中央情报局等均参与了此项目。同时斯坦福大学、麻省理工学 院及部分国立实验室如 Argonne, Oakridge 也参与了该项目的研究和开发。 英国 剑桥大学、欧亚公司也正在从事该领域的研究。 世界大型制药公司对基因芯片技 术用于基因多态性、 疾病相关性、 基因药物开发和合成或天然药物筛选等领域感 兴趣 , 也已研制或正在研制自己的芯片设备和技术设备。我国人口众多，有着丰富的基因资源 , 由于所有疾病和遗传信

10、息都与基因有 着密切的联系 , 因此基因研究具有特别重要的价值 , 基因芯片技术的发展将大大 促进我国的人类基因组计划的进程。目前国内掀起基因芯片的研究热潮 , 联合基 因科技集团有限公司成功地制作了国内第一块基因表达谱芯片和 HCV诊断芯片， 并通过了由上海市科委组织的专家鉴定 ,标志着我国的芯片研究已跟上国际同行 发展的步伐 ,走向产业化进程。2基因芯片在结核分枝杆菌检测中的应用2.1. .基因芯片对结核分枝杆菌耐药性的研究 基因芯片对结核分枝杆菌的研究一经报道， 立即引起了国内外学者的高度重 视，成为本世纪分子生物学的研究热点 13,14 。在结核分枝杆菌耐药性检测方面， 芯片技术可将所

11、有突变的探针固定到一张芯片上， 只须一次杂交， 即可获得某一 菌株对所有药物的敏感性结果， 因而对指导医生合理用药非常有价值， 并为控制 疾病的传播提供了可能性，以下是近 12 年来各国科研人员利用结核分枝杆菌检 测结核分枝杆菌所取得的成果 15 ：2.1.1 1998 年， Gingeras 等13利用结核分枝杆菌 rpoB 基因保守区 705bp 特异核苷酸序列探针与基因芯片进行杂交，对10 种，121 株分枝杆菌进行基因分型与菌种的鉴定。作者用 rpoB 寡核苷酸芯片技术与常规双脱氧核苷酸测序方 法，对 10种分支杆菌种间与种内的序列多样性进行分析，并确证了几种特异性 单碱基多态性；2.

12、1.2 1999年Troesch等何设计的16S rRNA和rpoB基因序列芯片，鉴定 出 70 株 27 种分枝杆菌临床分离株以及 15 株耐利福平菌株；2.1.3 2002 年张万江等 17报道应用基因芯片技术检测 1 株结核分枝杆菌药 物敏感株和 4 株耐多药株结核分枝杆菌， 基因芯片扫描结果经分析与传统药敏检 测结果相符合。2.1.4 2003年崔振玲等用18芯片检测耐异烟肼分离株katG、ahpC调节区域 和inhA调节区域的基因突变。同年，端木和运等19报道应用基因芯片检测 20 株耐INH、RFP结核分枝杆菌临床分离株的katG、rpoB基因突变；李胡渤等用 DNA0芯片对59株

13、耐药结核分枝杆菌进行耐异烟肼、耐利福平基因进行检测。2.2基因芯片技术应用于耐多药结核病（MDR-TB检测的现状至今为止，经过各国科研工作者的共同努力，已经鉴定出的结核分枝杆菌耐 药相关基因如下表21-25结核分枝杆菌耐药相关基因抗结核药物耐药相关基因编码对象利福平（RFPrpoBRNA聚合酶B亚基katG过氧化氢酶-过氧化物 酶in hA烯酰基载体蛋白还原酶异烟肼（INH）ahpC烷基过氧化氢酶kasAB -酮酰基运载蛋白裂合 酶oxyR氧化-应激应答反映调节蛋白oxyR吡嗪酰胺（PZA）pncA吡嗪酰胺酶乙胺丁醇（EMBembB阿拉伯糖基转移酶链霉素（SMrpsL核糖体30S亚基S12蛋白

14、rrs核糖体30S亚基16SrRNA氟喹诺酮类gyrADNA回旋酶A亚基gyrBDNA回旋酶B亚基2.3 应用基因芯片技术检测结核分枝杆菌的优势基因芯片法对于结核分枝杆菌的检测，主要是针对其基因的保守片段，由于 其具有较高灵敏度和特异性，且操作简便，完成一个检测周期只需6-8 h,所以对 于结核病尤其是肺外结核病具有较高的诊断价值26 o3. 展望 尽管基因芯片技术发展的时间还不长，在各个科学领域还未广泛深入，应用 过程中还存在这样那样不可预知的问题， 但由于其自身的诸多特性， 使得这项技 术有着巨大的潜能， 相信随着科学工作者不断的追求和探索， 基因芯片技术一定 会在生命科学研究领域创造辉煌

15、的成就。参考文献：1. 康润田 , 胡德华， 等 五种方法检测临床标本中结核分支杆菌的比较分析 中国防痨杂志 J 2001 ， 23 （1）60.2. 蔡玉梅，张素娟 基因芯片概述 中国科技信息 2005,12.3. 刘瑛 , 温来欣 基因芯片技术在实验室中的应用 J. 职业与健康 2008 ，24 （14）：1448-1449.4. 裘敏燕，李瑶，等 基因芯片技术及其应用 第二军医大学报 2001 ，22（6）5. 张辉 ，杨小洁，等 基因芯片技术及其在病原微生物检测和研究中的应用 动物医学进展 2009,30（12）:100-104.6. 袁建琴，高斌站，等 基因芯片技术的研究和应用 山西

16、农业大学学报 2006,5（5）.7. 江禾，王友群 基因芯片技术与药物的研究和开发 世界临床药物 M 2008，02.8. 范金坪 生物芯片 技术 及其应用研究 中 国医 学物理学杂志 J 2009 ,26 （2）： 1115-1117.9. 严春光，陈军辉，等 基因芯片及其应用 中国生化药物杂志 J 2006 ， 27 （5）：321.10. 陈忠斌 生物芯片技术 M ，北京：化学工业出版社 .2005.11. M.谢纳.生物芯片技术分析M，北京：科学出版社.2004.12. 孙国波 董飚 基因芯片技术研究进展及其应用上海畜牧兽医通讯2009,6:27-29.13. Gingeras T

17、R ， Ghandour G， Wang E， etal Simultaneous genotyping andspeciesidentification using hybridization patternrecognition analysis of genericmycobacterium DNA arraysJGenomeRe，s 1998，8（ 5）： 435448.14. Talaat A M ， Hunter P ， Johnston S A,al Genome-directed primers for selectivlabeling of bacterial transcr

18、ipts for DNmicroarray analysisJ Nat Biotechnol 2000 ， 1 8（6）： 679682 .15. 张俊仙，吴雪琼 基因芯片技术及其在结核分枝杆菌菌种鉴定及耐药性检测 方面的研究进展 实用医学杂志 J,2000 ， 25（21）:3718-3719.16. Troesch A， Nguyen H， Miyada C G， et al Mycobacterium speciesidentification and rifampin resistance testing with high density DNA probe arrays JJ Cl

19、in Microbiol， 1999， 37（ 1 ）： 495517. 张万江， 鲍朗，等. 利用基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药性的研究 J. 中华检验医学杂志， 2002， 25（4）： 209.18. 崔振玲，景奉香，等用DNA芯片快速检测结核分枝杆菌对异烟肼的耐药性J. 中华检验医学杂志， 2003.19. 端木和运，张钢，等.DNA芯片法检测耐多药结核分支杆菌耐药性J.临床 医学， 2003， 23（5）： 252620. 李胡渤，张晨曦，等.59株耐药结核分枝杆菌DNA芯片检测结果分析J . 医药论坛杂志， 2003， 24（19）： 2526.21. Banerjee A， DubnauE， QuemardA， et al.inhA ， a gene encoding a target for isoniazid and ethionamide in Mycobacterium tuberculosisJ.Science ， 1994， 263（514