规范植物生理学实验指导书(08)

1、 植 物 生 理 学 实 验 指 导 书王 娜 编 写适用专业：生 物 技 术江苏科技大学生物与环境工程学院 2009 年 11月前 言本实验指导主要为了配合理论教学而编写的。进行植物生命活动中一些最基本的过程（水分吸收、矿物质代谢、光合作用、生长调节物质、植物生长以及逆境生理等）的定性、定量测定和某些物质的分离提取，学习植物生理学中最基本的实验技术和方法；要求学生掌握植物生理学实验的基本原理和方法，掌握生理实验中一些常规仪器和设备的原理和操作方法，提高学生的动手能力，加强学生对理论教学内容的理解，并为以后的科研活动和撰写科研论文打下基础。同时，按照“素质教育”要求，以培养面向21世纪具有一定

2、创新能力的人才为目标。在必修的验证性实验：植物组织水势的测定，硝酸还原酶活性的测定，吲哚乙酸氧化酶活性的测定，种子发芽率的快速测定的基础上，尽量结合当前生产和科研工作的需要，增加了研究性实验和综合性实验内容。综合性实验如叶片色素的提取分离、色素性质及含量测定；研究性实验如高温胁迫下小麦幼苗体内渗透调节物质含量测定。通过设计性和综合性实验注重学生动手能力、思辩能力和创造能力的培养，符合培养既有扎实基础知识又有创新思维能力的教改方向，有利于增强学生独立工作、解决问题的能力。I目 录实验一 植物组织水势的测定1实验二 硝酸还原酶活性的测定3实验三 叶片色素的提取分离、色素性质及含量的测定6实验四 吲

3、哚乙酸氧化酶活性的测定10实验五 种子发芽率的快速测定12实验六 高温胁迫下小麦幼苗体内渗透调节物质含量测定15II实验一 植物组织水势的测定（长度法和小液流法）实验学时：2 实验类型：验证实验要求：必修一、实验目的1、 了解水势的概念及其对植物吸收外界水分的作用。2、 熟练掌握长度法和小液流法测定植物组织水势的原理和方法。二、实验内容 配制一系列梯度的蔗糖溶液，通过放入其中的土豆条的吸水和失水，使土豆条长度和外界溶液发生浓度的变化，进而判断出等渗溶液，计算出水势。三、实验原理、方法和手段当植物细胞组织放在外界溶液中时，如果植物的水势小于溶液的渗透势，则组织吸水体积变大并使溶液浓度变大；反之，

4、则植物细胞内水分外流体积变小并使溶液浓度变小；若植物组织的水势与溶液的渗透势相等，则两者水分保持动态平衡，植物组织体积不变，外界溶液浓度也不变，此时溶液的渗透势即等于所测植物的水势。可以利用溶液浓度的变化，分析采用小叶流法、长度法等来测定实验前后的变化。然后根据范特荷夫公式计算溶液渗透势，从而得知植物组织水势。四、实验组织形式在教师指导下，以学生为主的开放性运行模式。五、实验条件1、仪器和试剂试管、毛细滴管、刀片、移液管、镊子、米尺、甲烯蓝、温度计、1mol/L蔗糖溶液2、参考文献张志良，瞿伟菁著。植物生理学实验指导（第三版），高等教育出版社。六、实验步骤（一）长度法1、以1mol/L的蔗糖溶

5、液为母液分别在大试管中配制0.5、0.4、0.3、0.2、0.1M蔗糖液各15ml，混匀，编号（实验组）。2、取5只中试管，编号，从对应的大试管中各取5ml溶液为对照组。3、每只试管取准确度量的45cm长、0.09cm2横截面的土豆条4条，量取总长度，记为L1，置于大试管中，放置30分钟后（摇动数次），取出各管内的土豆条测定总长度，记为L2。4、比较实验前后土豆条总长度的变化，判断与确定等渗浓度。（二）小液流法1、向每一只实验组大试管中加入甲烯蓝粉末少许，振荡，使溶液变蓝。2、用毛细滴管从实验组各大试管中吸入少许着色液，然后伸入到对应的对照组试管中部，缓慢释放出一滴，观察小液流的移动方向，记录

6、实验结果，判断与确定与植物组织水势相等的外界溶液的浓度。3、计算植物组织水势。sRtiC七、思考题1、试比较两种方法测定的结果是否相同。2、为什么本实验测定的是植物组织的水势而不是植物细胞的渗透势？21实验二 硝酸还原酶活性的测定实验学时：4实验类型：验证实验要求：必修一、实验目的掌握硝酸还原酶活性测定方法，加深对硝酸还原酶在植物氮素代谢中重要作用的理解。二、实验内容 硝酸还原酶在一定的条件下能够将硝酸根离子转变为亚硝酸根离子。通过测定亚硝酸根离子量的多少，在一定程度上反应酶活性的强弱。三、实验原理、方法和手段NR是植物氮素代谢作用中的关键酶，与作物吸收与利用氮肥有关。它作用于NO3-使其还原

7、为NO2-:NO3-+NAD（P）HH2e NO2-NAD（P）H2O产生的NO2-再从组织中渗透到外界溶液，并积累在溶液中。利用对氨基苯磺酸与萘胺的显色反应（在酸性溶液中NO2-与对氨基苯磺酸形成重氮盐，重氮盐再与萘胺反应形成红色的偶氮化合物。该反应H，重氮，而偶联，颜色比较稳定；而温度，反应O-,但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同的条件下进行）利用分光光度法可以测定反应液中NO2-含量的增加，从而表现该酶活性的大小。这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5g的NaNO2。四、实验组织形式在教师指导下，以学生为主的开放性运行模式。五、实验条件1、仪器及试剂分光光度计、天平、恒温培养箱、三

8、角烧瓶、量筒、移液管、真空泵或注射器、真空干燥器、烧杯、0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液。萘胺溶液：称取0.2g萘胺放在烧杯中，先用少量95酒精溶解，然后再缓慢倒入50ml盐酸中，再加水定容至100ml。0.2mol/L KNO3：称取20.22g KNO3溶于1000ml蒸馏水中。对氨基苯磺酸溶液：称取1g加25ml浓盐酸溶解，再用蒸馏水稀释至100ml。5ug/ml NaNO2标准溶液：称取1g NaNO2溶解于1000ml水中，然后吸取5ml。再加水稀释成1000ml。2、参考文献张志良，瞿伟菁著。植物生理学实验指导（第三版），高等教育出版社。六、实验步骤1、取0.2 mol/L

9、KNO3溶液和0.1mol/L 磷酸缓冲液各5ml，置于三角瓶中，混匀，为实验组；另取水和0.1mol/L 磷酸缓冲液各5ml，置于另一三角瓶中，混匀，为对照组。将新鲜取回的叶片水洗（叶片一定要洗净，否则所带灰尘会影响OD值），吸干，然后用打孔器钻成直径约1cm的圆片若干，于天平上称取等重（约1g）的小叶圆片两份，分别置于上述两个三角瓶中。分别抽气，放气后，圆片即沉于溶液中。将三角瓶置于恒温箱中30下避光（NR暗中反应）保温30min后，各取反应液1ml，按照步骤2测定NO2-的量。2、NO2-量的测定：1ml反应液顺次加入2ml 对氨基苯磺酸、2ml 萘胺，混匀，30min后（否则颜色不稳定

10、）测定520nm的吸光度值。3、标准曲线制作：以5ug/ml的NaNO2溶液为母液，配置5、4、3、2、1、0ug/ml的溶液各5ml，各取1ml配制液按步骤2反应测定OD值。以OD值为纵坐标，浓度为横坐标，绘标曲；或根据浓度与OD值关系直接计算回归方程。4、根据标曲或回归方程计算出实验组和对照组对应的NaNO2浓度。5、根据结果计算NR活性。七、结果计算以NO2-g/g.h为单位表示活性：NR活性（实验组对照组g/ml）10ml21g八、思考题1、抽气前，小叶圆片为何浮于水面？真空抽气完，放气后，小叶圆片为何能沉入水中？本实验中为何要抽气？2、为何实验过程中保温要避光？3、本实验取材时为何要

11、选用新鲜叶片，最好要照光一段时间？4、阐述分光光度计使用过程及注意事项。注意事项：比色皿和其它物品不能摆在仪器上，保持仪器干燥；开关盖时动作要轻，不用仪器时样品盖要打开；在不使用时调至T档，以保护机器；手握比色皿毛面，用待测液洗涤12次后再加入待测液测定。比色时浓度由低到高测；测定需要在同一台机器上进行，最好使用同一个比色皿，在倒掉比色液后，用蒸馏水冲洗干净；用后比色皿要立即冲洗，再浸入蒸馏水中；如需洗涤比色皿可用20的稀硝酸；OD值一般在0.20.8之间（在此间线性关系较好）。实验三 叶片色素的提取分离、色素性质及含量的测定实验学时：4实验类型：综合实验要求：必修一、实验目的以植物叶片组织为

12、材料，提取叶绿体色素；以纸层析法分离其成分；鉴定叶绿体色素的理化性质，有助于对其生理功能的理解；学会色素含量测定方法。二、实验内容光合作用是自然界中重要的反应，它关系到整个生物界的生存与发展。在光合作用过程中，叶绿素是重要的色素，它占总色素的75，对光能的吸收和传递转化有着不可替代的作用。功能是与结构和化学特性有着必要的联系，通过本实验让学生了解叶绿素的有关知识，加深对光合作用的了解。本实验涉及到多个知识点：1、叶绿体色素的提取方法：叶绿体色素溶入有机溶剂而不溶入水，本实验在提取时运用的是丙酮（有机溶剂）提取，而含量测定时用水研磨，给学生一个整体的比较认识。2、了解叶绿体色素结构特征及其光学性

13、质：通过光破坏、Cu取代、荧光和磷光等特性的实验观察，让学生了解色素结构和性质。3、色素分类：高等植物叶绿体色素分为叶绿素（a和b）和黄色素（胡萝卜素和叶黄素），通过纸层析方法，既能够让学生了解纸层析的原理又能够通过各自的性质特点分离出四种色素，加深对课堂内容的掌握。4、根据LambertBear定律，测定出叶绿体a、叶绿体b和总叶绿素的含量。三、实验原理、方法和手段1、叶绿体色素主要包括叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素，它们是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质。从植物叶片中提取和分离色素是对其认识和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用丙酮提取。分离色素的方法有多种，纸

14、层析是其中最简便的一种。当溶剂不断从层析滤纸上流过时，由于混合物中各成分在流动相和固定相间具有不同的分配系数和移动速度，从而使样品中的混合物得到分离。根据叶绿体色素的结构特征及其光学性质，可观察其一系列性质。2、如果混合液中的两种组分，它们的光谱吸收峰虽有明显的差异，但吸收曲线又有些重叠，在这种情况下要分别测定这两种组分，可根据LambertBear定律，通过代数方法，计算出一种组分由于另一种组分存在时对吸光度的影响，最后分别得到两种组分的含量。叶绿素a、b在长波长方面的最大吸收峰分别在663nm和645nm，同时在该波长时，叶绿素a、b的吸光系数k已知。我们可根据LambertBear定律，

15、列出浓度C和光密度D之间的关系式：D663=82.04Ca9.27Cb （1）D64516.75 Ca45.67 Cb （2） C为叶绿素浓度，单位为g/L解方程：Ca12.7D6632.69D645 （3） Cb22.9D6454.68D663 （4） CTCaCb20.2D6458.02D663 （5） CT为叶绿素浓度，Ca、Cb、CT的单位为mg/L四、实验运行形式在教师指导下，以学生为主的开放性运行模式。五、实验条件1、仪器和试剂天平、量筒、研钵、烧杯、普通漏斗、分液漏斗、滤纸、结晶皿、毛细滴管、移液管、试管、太阳灯、吸球、酒精灯、丙酮、分光光度计、80丙酮、无水CaCO3、石英砂、

16、浓盐酸、乙醚、甲醇、醋酸铜、30KOH-甲醇液 2、参考文献张志良，瞿伟菁著。植物生理学实验指导（第三版），高等教育出版社。六、实验步骤（一）色素提取及性质观察1、提取：去除中脉的的菠菜叶4g，加少许石英砂和少许固体CaCO3，加丙酮5ml，匀浆后，倒入漏斗过滤，再用5ml丙酮洗涤滤渣倒入漏斗中过滤（滤纸不用水浸泡，否则荧光不明显），再用丙酮10ml冲洗滤渣，得叶绿体色素。2、荧光现象的观察：取上述叶绿体色素提取液少许于试管中，在反射光和透射光下观察提取液的颜色有无不同，为什么？ 3、纸层析分离色素：取一滤纸条卷成芯（纸芯的长度取决于结晶皿底部大培养皿边缘的高度），用毛细滴管在 一端点样101

17、5次（注意一次所点溶液不可太多，如色素过淡，待风干或用电吹风吹干后再点）。另取一大圆形滤纸，中间挖一小孔径与纸芯相符的小孔，插入芯，将丙酮汽油推进剂（V/V3：10）倒适量于结晶皿中，结晶皿置于大培养皿中，将纸芯直立于其中，再盖上另一大培养皿，展层。15min左右观察现象，并解析原因。4、光对叶绿体色素的破坏作用（光漂泊现象）：取两只小试管分别装有叶绿体色素，一只置强光下，另一只置于暗处，经23小时后比较其颜色的变化，并解析原因。5、铜在叶绿素分子中的替代作用：取叶绿体色素于试管中，逐滴加入浓盐酸（一般一滴即可，如太多则会由褐色转为亮绿色，原因不明），直至颜色呈褐绿色，再加入少量醋酸铜晶体（不

18、能剧烈振荡，否则乳化，有气泡），逐渐加热溶液，则颜色又转为亮绿色。解析原因？6、黄色素和绿色素的分离：5ml提取液15ml乙醚（萃取色素）20ml水，冲洗两次，轻轻摇动分液漏斗，静置片刻，观察溶液变化，为什么？弃去下层丙酮和水，再加5ml30KOH-甲醇液和10ml水，摇动分液漏斗，静置约10min后，观察现象并解析原因。（二）色素含量测定1、取菠菜叶0.5g剪碎后置于研钵中，加蒸馏水5ml，少许CaCO3和石英砂，研磨成匀浆，定容至10ml，得叶绿素悬浮液。2、取2.5ml悬浮液于试管中，加入10ml丙酮振荡，过滤，以80丙酮作为对照，测定OD663、OD645。3、将OD值代入公式计算出C

19、a、Cb、CT。4、计算叶绿素含量与叶绿素a/b：（需要考虑稀释因子） 叶绿素aCa12.5/100010/2.51/0.50.1 Ca（mg/g鲜重） 叶绿素b0.1Cb（mg/g鲜重） 总叶绿素含量0.1CT（mg/g鲜重）七、思考题1、画图说明纸层析得到的结果，并解析原因。2、研磨提取叶绿体色素时为何要加入少许的CaCO3？3、铜在叶绿素分子中替代镁的作用，有何实用意义？4、为何水提取的是叶绿素悬浮液，加入丙酮后就成为真溶液？5、叶绿素a和b在红光区和蓝光区都有最大吸收峰，能否用蓝光区的最大吸收峰波长进行叶绿素a和b的定量分析，为什么？6、你所测得的叶绿素a/b值是否与教材上的数值相近，

20、为什么？实验四 吲哚乙酸氧化酶活性的测定实验学时：4实验类型：验证实验要求：必修一、实验目的通过本实验让学生了解基本的酶液提取方法，掌握吲哚乙酸氧化酶反应的基本原理。二、实验内容生长素在植物体内起着重要的作用，调节着生物体的生长和发育过程。而吲哚乙酸氧化酶通过调节体内吲哚乙酸的水平，间接对植物体产生影响。1、掌握酶的基本提取方法：酶从植物体内提取后很快容易失活，因而需要一定的外界条件加以控制，这是体外测定酶活力时必须注意的一个问题。本实验是学生第一次提取酶液，因而需要着重注意，如：冰浴研磨，冷冻离心，离心机的使用和调控等等。2、掌握吲哚乙酸和吲哚乙酸氧化酶的关系：在植物体内吲哚乙酸含量高的地方

21、，酶活性很低；而含量低的地方，酶活性高。本实验材料运用的是豆芽，在取豆芽部位时就存在技术的问题。3、掌握吲哚乙酸氧化酶反应的基本条件：（1）、需要辅酶：Mn2和单元酚；（2）、反应温度：30；（3）、以底物的减少表示：吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性，其产物多种多样，因而不能以产物的增加表示。4、新进UV9100分光光度计的使用方法。三、实验原理、方法和手段吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性，其产物多种多样。植物体通过吲哚乙酸氧化酶调节体内吲哚乙酸的水平，从而影响植物的生长。酶活力的大小以吲哚乙酸减少的速度表示。吲哚乙酸在无机酸存在条件下能与FeCl3反应

22、生成红色的螯合物，可用分光光度法测定其含量来反应吲哚乙酸的含量。四、实验组织形式在教师指导下，以学生为主的开放性运行模式。五、实验条件1、仪器和试剂分光光度计、离心机、恒温水浴锅、天平、研钵、试管、移液管、烧杯0.02M的磷酸缓冲液，pH6.1。1mM2，4-二氯酚：16.3mg定容至100ml。1mM MnCl2：19.8mgMnCl2.4H2O定容至100ml。1mM吲哚乙酸：17.5mg用少量乙醇溶解，定容至100ml。吲哚乙酸B试剂：0.5M的FeCl3溶液：1.35g定容至10ml 35%过氯酸：250ml过氯酸原液（70）到500ml，棕色瓶保存。使用前将10mlFeCl3溶液和5

23、00ml 35%过氯酸混合，最好现用现配。2、参考文献张志良，瞿伟菁著。植物生理学实验指导（第三版），高等教育出版社。六、实验步骤1、将大豆芽或绿豆芽，除去子叶与胚根，称取下胚轴2g，置研钵中，加入5ml的预冷磷酸缓冲液，冰浴中研磨，再加15ml的缓冲液混匀后，离心管中离心20min（4000rpm），所得上清液即为粗酶液。2、取试管两只，一只为实验组，加入1mlMnCl2，1ml二氯酚，2ml吲哚乙酸，4ml酶液，2ml磷酸缓冲液（吲哚乙酸氧化酶需要两个辅基：Mn2和酚，一般是单元酚）；另一只为对照组，除了酶液换成磷酸缓冲液外，其余都相同。两只试管一起25恒温水浴中保温30min。3、吸取反

24、应混合液1ml，再加2ml试剂B，混匀。30恒温箱中暗中保温30min。观察颜色变化，分光光度计测OD530值。4、标准曲线：以20ppm的IAA溶液为母液，配置20、15、10、5、0ppm的溶液各5ml。各取1ml，按照步骤（3）测定OD值。以OD值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。5、以被氧化的吲哚乙酸的量表示吲哚乙酸氧化酶活性。七、思考题1、本实验为何取材时除去子叶和胚根，留取下胚轴?2、测定NR活性时我们以产物NO2的增加来测定酶活性，本实验中为什么不能以产物的增加来表示酶的活性呢？实验五 种子发芽率的快速测定实验学时：2实验类型：验证实验要求：必修一、实验目的通过本实验让学生掌

25、握基本的测定种子发芽率的方法。二、实验内容种子发芽率是指在最适宜的条件下，在规定的天数内，发芽的种子占供试种子总数的百分比。它是决定种子品质和实用价值大小的主要依据，与播种时种子的用量直接有关。但用常规的直接发芽的方法测定发芽率所需的时间较长，特别是有时为了应急的需要，如涉及到购买种子，则更是无法知道。快速测定法将在很短时间内获得结果。三、组织运行形式 在教师指导下，以学生为主的开放性运行模式。I：氯化三苯四氮唑法（TTC法）一、实验原理凡有生命活力的细胞均具有呼吸作用从而都有氧化还原反映，而死细胞则无此反应。TTC可渗入种胚的活细胞内，并作为氢受体被脱氢辅酶（NADH或NADPH）上的氢还原

26、，此时无色的TTC便转变为红色的三苯基甲 （TTF），并吸附在活细胞的表面，根据活细胞着色的深浅可定性的判断种子活力的有无与大小。该方法在国际间、地区间交换种子最为常用。二、仪器和试剂恒温箱、烧杯、培养皿、镊子、刀片、天平0.5的TTC溶液：称取0.5gTTC放在烧杯中，加入少许的95乙醇使其溶解，然后用蒸馏水定容至100ml，棕色瓶中保存。若溶液变为红色，表示已被氧化不能再用。三、实验步骤1、浸种：将待测的种子在30温水中浸种数小时，以增强种胚的呼吸强度，使显色迅速。2、显色：取吸涨的种子100粒，用刀片沿着胚的中心线纵切为两半，将一半置于1只培养皿中，加入适量的0.5的TTC溶液（以浸没种

27、子为度）后，置于30恒温箱内。0.51小时后，观察现象，判断种子活力的有无与大小。 将另一半种子在沸水中煮5min杀死胚，或用微波炉烤死胚，作同样染色，保温处理，作为对照。观察并与活种子比较看现象有何不同。3、计算活种子的百分率。II、溴麝香草酚蓝法（BTB法）一、实验原理凡活细胞必有呼吸作用，吸收空气中的氧气，放出二氧化碳。二氧化碳溶于水中成为碳酸，碳酸解离成H和HCO3，使胚周围环境的酸度增加，可用酸碱指示剂BTB来测定酸度的改变。BTB的变色范围为pH6.07.6，酸性成黄色，碱性成蓝色，中间经过绿色（变色点为pH7.1）。颜色变化越明显则表明种子活力越强。死细胞没有呼吸作用，也没有BT

28、B的颜色变化。二、仪器和试剂 恒温箱、烧杯、培养皿、镊子、天平、漏斗、滤纸、琼脂0.1的BTB溶液：称取BTB0.1g，溶解于煮沸过后的100ml自来水中，然后用滤纸滤去残渣。溶液若为黄色，可滴加数滴稀氨水或稀NaOH溶液，使之变为蓝色或蓝绿色，棕色瓶中保存。1BTB琼脂溶液：取0.1BTB溶液 100ml于烧杯中，将1g琼脂尖碎后加入，用小火加热并不断搅拌。待琼脂完全溶解后，趁热倒在数个干洁的培养皿中，使之为一均匀的薄层，冷却后备用。三、实验步骤1、浸种：同上述TTC法 2、显色：吸取吸张的种子100粒，整齐的将胚向下埋于准备好的琼脂凝胶培养皿中，间隔距离在1cm左右。然后将培养皿置于恒温培

29、养箱中3035培养。2h后，观察试验现象并判断种子活力的有无与大小。用沸水杀死或微波炉烤死的种子作同样浸种、显色、保温处理，进行对比观察。3、记数种胚附近出现的黄色晕圈的活种子数，计算活种子的百分率。III、红墨水染色法一、实验原理 活细胞的原生质膜具有选择性吸收物质的能力，红墨水不能进入细胞；而死的种胚细胞原生质膜失去这种能力，红墨水进入死细胞并染色。二、仪器试剂培养皿、镊子、刀片5红墨水：以市购红墨水为原液，用自来水配置成5的红墨水溶液。三、实验步骤1、浸种：同上述TTC法。2、显色：取吸胀的种子100粒，用刀片沿着种胚的中心线纵切成两半，将一半置于1只培养皿中，加入适量的5红墨水（以浸没

30、种子为度）染色。1015min后倒去红墨水，用自来水冲洗多次，直至冲洗液无色为止。观察种子活力大小与有无。用沸水杀死或微波炉烤死的种子作同样的染色处理。进行对比观察。3、记数种胚不着色或着色浅的活种子数，计算活种子的百分率。四、思考题1、试比较用三种方法测定的种子的发芽率是否一致？并与种子的实际萌发率是否一致？如若有偏差，理论上应为偏高还是偏低？为什么？2、BTB法测定种子发芽率，配置BTB溶液为何要用自来水，而且还需要煮沸，为什么？用蒸馏水可否配置？3、BTB法测定种子发芽率时，若用煮死的种子作比较，有时也会发现在种子周围出现黄色晕圈，为什么？实验六 高温胁迫下小麦幼苗体内渗透调节物质含量测

31、定实验学时：8实验类型：研究实验要求：必修一、实验目的通过实验让学生掌握可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量测定的方法，了解在胁迫情况下，植物体内渗透调节物质含量变化对植物体的作用。二、实验内容 可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸是植物在逆境条件下体内迅速大量产生的物质，能够调节植物细胞的渗透压，尽量避免植物受到伤害，或者把伤害降低到最少的水平。1、加深对环境保护的理解：现在环境破坏越来越厉害，植物体在生长时所受到的逆境越来越多，因而有必要让学生了解植物在逆境条件下体内生理生化变化，提高认识，加强保护环境的概念。2、掌握逆境情况下渗透调节物质的生理作用：逆境下植物体内首先变化的是水分，造成水分的流失，而

32、渗透调节物质通过其含量的变化，调节细胞质的渗透势，从而使水分不至于过度丧失，维持在一定的水平，将伤害降低到最小水平。3、掌握渗透调节物质的提取方法。4、掌握渗透调节物质的测定方法。5、掌握一定的实验室模拟逆境的方法。可溶性糖含量的测定一、实验原理、方法和手段 植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，试剂便宜，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存

33、在的影响，并且产生的颜色可稳定160min以上。二、实验运行形式 在教师指导下，以学生为主的开放性运行方法。三、实验条件1、仪器试剂分光光度计、水浴锅、刻度试管、刻度吸管。90苯酚溶液：称取90克苯酚（AR），加蒸馏水10ml溶解，在室温下可保存数月；9苯酚溶液：取3ml90苯酚溶液，加蒸馏水至30ml，现配现用；浓硫酸（比重1.84）1蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80下烘至恒重，精确称取1.000克。加少量水溶解，转入100ml容量瓶中，加入0.5ml浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度；100g/L 蔗糖标准液精确吸取1蔗糖标准液1ml加入100ml容量瓶中，加水至刻度。2、参考文献张志良，瞿伟菁著。

34、植物生理学实验指导（第三版），高等教育出版社。四、实验步骤1、标准曲线的制作：取不同浓度的糖溶液各2ml，分别向试管内加入1ml 9苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以520S加入5ml浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8ml，在室温下放置30min，比色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色，以糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。2、可溶性糖的提取：取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.100.30g，共3份（或干材料），分别放入3支刻度试管中，加入510ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25ml容量瓶中，反复漂洗试管及残

35、渣，定容至刻度。3、测定：吸取2ml样品液于试管中（重复2次），同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定吸光度。由标准曲线查出糖的量。4、结果计算按下式计算测试样品的糖含量：可溶性糖含量（）从标准曲线查得糖的量（g）提取液体积（ml）稀释倍数/测定用样品液的体积(ml)样品重量(g)106100脯氨酸含量的测定一、实验原理、方法和手段 用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯

36、氨酸的含量。二、实验运行形式 在教师指导下，以学生为主的开放性运行方法。三、实验条件1、仪器试剂分光光度计、研钵、小烧杯、容量瓶、试管、 移液管、 注射器、水浴锅、漏斗、漏斗架、滤纸、剪刀。酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，搅拌加热（70）溶解，贮于冰箱中；3磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；冰醋酸；甲苯2、参考文献张志良，瞿伟菁著。植物生理学实验指导（第三版），高等教育出版社。四、实验步骤1、标准曲线的绘制：在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度

37、，此标准液中每ml含脯氨酸100g。取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1、2、3、4、5及6g/ml。取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲

38、线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（g/2ml）。 2、脯氨酸含量的测定：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml3的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000rpm下离心5min。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。3、结果计算根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml测定液中脯氨酸的含量（Xg/2ml），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下：脯氨酸含量（g/g）X5/2/样重（g）。可溶性蛋白含量的测定一、实验原理、方法和手段考马斯