免疫球蛋白重链结合蛋白和钙网蛋白在肝细胞癌中的表达与转移的关重点

1、史堡匿生盘查！Q! !生！旦！旦筮！鲞筮！ Q塑盟！ ！丛型!1 塑：丛！竺！，！：！：！：盟！ ：！ Q 免疫球蛋白重链结合蛋白和钙网蛋白 在肝细胞癌中的表达与转移的关系 傅哲叶健文唐文超王刚唐红卫闰冰冯若 【摘要】目的探讨免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)和钙网蛋白(CRT) 在肝细胞癌中的表达与转移的关系。方法采用Western印迹及实时荧光定量 PCR技术检测Bip与CRT在正常肝脏细胞株及肝癌细胞株表达；收集201 4年6月至2015年5月在郑州大学第一附属医院住院患者手术的肝细胞癌标本 4 3例，用免疫组织化学染色和Western印迹技术检测43例肝细胞癌组织 及相应的癌旁组织和5例

2、肝血管瘤旁组织中Bip和CRT蛋白的表达，并分析与 临床病理资料的关系。结果Bip和CRT在肝癌细胞株及肝细胞癌组织中高表 达，在肝细胞癌组织中总的阳性表达率分别为8 6.0%(37/43)和6 5.1%(28/43),Bip在转移组高表达率为10 0%(19/19), 明显高于非转移组的7 5.0%(18/24)，两者比较，差异有统计学意义 (P0.05);CRT在转移组高表达率为84.2%(16/19 )，明显 高于非转移组的5 0.0%(12/24)，差异有统计学意义(尸V0 .05) 且两者表达呈正相关；Bip阳性率及表达量与肝细胞癌的TNM分期，转移相关 (均P0.05),CRT阳性

3、率及表达量均与肝细胞癌的转移相关(PV 0.05)。结论Bip和CRT的表达与肝细胞癌的转移相关，对肝细胞癌患者 预后的监测有潜在意义。 【关键词】癌，肝细胞；免疫球蛋白重链结合蛋白；钙网蛋白；转移 基金项目：国家自然科学基金(U1204815);河南省高校科技创新人 才支持计戈 U (14HASTIT030)Relationshipbetweentheexpressionofimmunogiobulinheavyc hainbindingproteinandcalreticulin andmetastasisin hepatocellularcarcinomaFuZhe+,YeJi anwe

4、n，死昭Wenchao,Wang奄白ng,TangHongwei, YahBing,FengRuo.4DepartmentofHepatob iliaryandPancreaticSurgery,theFirstA ffiliatedHospitalofZhengzhouUniversi ty;KeyLaboratoryofHepatobiliaryandPa ncreaticSurgery Immunoglobulinheavychainbindingpro etin; Calreticulin:Metastasis Fundprogram:NationalNaturalScience Fo

5、undationofChina（U1204815）;Technolo gyandlnnovation TalentsofHenanPmvincialEducationDe partment（14HAslln.|030） 肝细胞癌是常见的恶性肿瘤，其复发及转移率高是阻碍肝癌术后患者获得远期 生存的重要因素之一。免疫球蛋白重链结合蛋白（Bip）亦称为葡萄糖调节蛋 8 78（GRP78 ）是内质网分子伴侣蛋白，是判定内质网是否应激的重要指 标之一心引。研究表明，内质网应激与肿瘤细胞转移、侵袭密切相关H弓|。钙网蛋 白（CRT）主要分布于内质网中，是一种多功能分子伴侣蛋白，参与多种生物学 调节功能，如

6、钙平衡，转录，基因表达，糖蛋白折叠，损伤修复，免疫应答和细胞 的多种功能（细胞粘连、迁徙、增生、吞噬和凋亡）x4j。本研究旨在探讨Bi p及CRT在肝细胞癌组织中表达及及转移的关系及其机制。 对象与方法 一、对象 1 研究对象：人肝脏细胞株L02及人肝癌细胞株SMMC 7 7 2 1、He pG2、Bel7402、MHCC97H购于中国科学院上海细胞库。收集20 14年6月至2015年5月在郑州大学第一附属医院肝胆胰外科住院患者的手术 标本，其中4 3例为肝细胞癌组织及距相应瘤体2cm以上的癌旁组织，5例为正 常肝脏组织（肝血管瘤切除的瘤旁组织，均无肝炎、肝硬化表现），实验设计及取 材经郑州大

7、学第一附属医院医学伦理委员会批准。所有患者术前未接受放化疗，临 床资料完整，术后病理诊断明确。本例癌组织患者中男3 4例，女9例，年龄4 28 0岁，平均年龄为（5 7.49.7 ）岁。根据有无肝内外转移将肝细胞 癌组织标本分为转移组（19例）和非转移组（24例）。 2 .试剂和材料：青、链霉素购自美国Sigma公司，DMEM购自北京赛 默飞公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，兔抗人Bip多克隆抗体（1:1 0 0 0稀释）、鼠抗人CRT多克隆抗体（ 1:1 0 0 0稀释）购自美国Abca m公司，鼠抗人B.acti n单克隆抗体（1:5 0 0 0稀释）购自美国Sig ma公司，驴抗兔I

8、gG（ 1:3 0 0 0稀释）、驴抗小鼠IgG（ 1:3 0 0 0 稀释）购自美国SantaCruz公司PV 9 0 0 0二步法免疫组织化学试 剂盒、DAB显色试剂盒、苏木精购自北京中 杉金桥生物技术有限公司。逆转录 试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒购自成都福际生物技术有限公司。 二、方法 1 .免疫组织化学染色：按试剂盒PV 9 0 0 0二步法操作：组织切片常规 二甲苯脱腊，梯度乙醇和蒸馏水进行水化，枸椽酸盐缓冲液高火2mi n，低火1 5mi n进行抗原修复，3%过氧化氢去离子水阻断内源性过氧化物酶，一抗4C 孵育过夜，通用型二抗室温孵育15min,DAB显色处理，苏木精复染，脱

9、水、封片。 2. Westem印迹：用RIPA（强）细胞裂解液裂解细胞并收集，用B CA法进行蛋白浓度定量。取相同蛋白总量进行上样，在10%聚丙烯酰胺凝胶 （SDS -PAGE）中进行电泳，所得PVDF膜在室温下用5%脱脂奶粉封闭 2h, 抗4C孵育过夜，磷酸盐缓冲液（PBS ）漂洗6次，5min/次，室 温孵育相应二抗1h，用ECL化学发光液在暗室进行曝光，B.肌动蛋白（ac tin ）作为内参，用Photoshop图像软件分析灰度值。 3 .实时荧光定量PCR :按照RNA提取试剂盒操作，分别提取总RNA, 测定RNA浓度及纯度后，逆转录PCR，合成cDNA，以不同细胞cDNA为 模版，按

10、照试剂合操作说明进行实时荧光定量PCR（引物序列见表1）,采用2 “法分析目的基因mRNA的相对表达量。 表1各相关基因引物序列 基因序列(5 *3 ) Bip CRT B肌动蛋白 GAACGTCTGATI GGCGATGC ACCACCTTGAACGGCAAGAA GGAGCAGTrrCTGGACGGAGACCGTAGAACTTGC CGGAAC CCTGGCACCCAGCACAATGGGCCGGACTCGrrCA 7nC 4 统计学分析：应用SPSS17. 0统计软件进行分析，计数资料采用P earsonChi Square检验和F isher精确概率法，相对表达量 采用t检验或单因素 生

11、堡医生苤圭！Q! 生！旦！ i旦笠堑鲞筮！ Q塑盟！ ！丛笪垦丛塑： 丛！翌！ ！：！鱼。！：堑：盟！ ：！ Q 方法分析，两者的相关性采用Spearman相关性检验。以PV0.05 为差异有统计学意义。 结果 l. Bip和CRT在肝脏细胞株及肝癌细胞株的表达：肝癌细胞株SMMC 772 1、HepG2、Bel7402、MHCC97H 中Bip 蛋白及 mRN A表达量均较正常肝脏细胞株L02高，SMMC 7721、HepG2、Bel 7402、MHCC97H中CRT蛋白及RNA表达量均较肝脏细胞株L02高 (图1),提示Bip与CRT高表达在肝癌细胞株中普遍存在 2, Bip和CRT在肝脏

12、组织及肝细胞癌组织的表达：肝细胞癌组织中Bi p和CRT均明显高于相应癌旁组织和正常的肝脏组织，总阳性率分别为8 6.O%(37/43 )和65.1%(28/43);Bip在转移组高表达率 为10 0%(19/19 )，明显高于非转移组的7 5.0%(18/24)，两 者比较，差异有统计学意义(P5 201553.8000.051 V5 2 3 1 转移有191905.520 0.027 无2 4 病理分级 高冲分化 272340.0451.000 低分化16 14 2 TNM分期 I + U251965.0210.032M + W 18 18 0 注：Eip :重链结合蛋白；CRT :钙网蛋

13、白；AFP :甲胎蛋白 表3肝细胞癌中Bip与CRT表达的相关性分析（例） 注：Bip :重链结合蛋白；CRT :钙网蛋白 和凋亡），与肿瘤细胞的转移及侵袭关系密切帕 了。本研究表明，Bip及 CRT在肝癌细胞株及肝细胞癌组织中异常高表达，在转移组及非转移组的肝细胞 癌组织中，转移组肝癌组织中Bip与CRT表达 量均高于非转移组肝细胞癌组织。本研究分析了 Bip及CRT与肝细胞癌组织病理参数的关系，研究 发现，Bip的高表达与肝细胞癌的转移、TNM分期相 关，CRT的高表达与肝细胞癌的转移相关，提示Bip与CRT可能与肝细 胞癌的转移、侵袭及恶性程度相关。 肝细胞癌的转移及侵袭复杂且涉及多途径

14、的过 程。Zhao等T叫发现Bip与c Src结合后，c.Src发生 磷酸化，促进肝癌细胞的转移及侵袭Su等No在44例肝癌患者中发现 Bip异常高表达，且与肝癌的门静脉侵犯及肝内转移相关，过表达Bip蛋白后 通 过促进局部黏着斑激酶(FAK)蛋白的磷酸水平促 进肝癌细胞的转移及侵袭Li u等纠对40例胃癌组织进行研究发现CR T在胃癌组织中高表达，且与 胃癌转移密切相关，体外实验也同样表明过表达CRT后通过调节E.cad hefin，Snai 1等方式促进胃癌细胞的转移及侵袭；Wang等0 16 研究发现CRT在食管鳞癌高表达，且与病人预后密切相关，沉默CRT的表达后 减少食管鳞癌转移至肺的

15、可能性；Feng等17o发现沉默CRT的表达后， 抑制肝癌细胞生长、转移，上调细胞凋亡，并与P13K/Akt相关，提示CR T在多种肿瘤的转移中扮演重要角色。田若阳等 8J在对外阴鳞癌的研究发现B ip及CRT在外阴鳞癌中高表达，且两者表达量呈正相关。本研究发现Bip及 CRT与肝癌的转移密切相关，且两者在肝细 胞癌组织中呈正相关(r = 0.382P=0.007)，提示Bip与CR T可能与肝癌的转移相关。 总之，Bip及CRT在肝癌细胞株及肝细胞组织 5 O 1 4 4 9 6 7 8 8 7 3 2 9 6 2 5 屹M打, M他博mnn 5 4 2 1 5 3 3 2 4 m殂如, n

16、拍 拍 ”9 他孔砑M 笛他年 性 舡 主堡匿堂盘查！ ！生！旦！旦笠堑鲞筮！翅盟！ ！丛塑!1 坠：丛！些！i:!:B ！: !:盟！ ：！ Q 中高表达，为肝癌转移的研究提供新的思路。 参考文献 lSiegelR,MaJ,Zouz,etal.Cancersta tistics,2014J.cACancerJClin,2014,6 4(1):9.29.DOI:10.3322/caac.21208.2 WangWA,GroenendykJ,MichalakM.Endopla smicreticulumstressassociatedrespons esincancerJ.BiochimBiop

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